مقالة منهجية

بروتوكول لعزل الدائرة ماوس ويليس

DOI:

10.3791/54352

⸱

أكتوبر 22, 2016

 ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, Sorbonne Universités

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا بروتوكولا قابلا للتكرار لعزل دائرة الفأر في ويليس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دائرة الدماغية الشريانية (الدائرة الشريانية الدماغية) أو دائرة ويليس (البقرة) هي مفاغرة الدورة الدموية المحيطة التصالبة البصرية وتحت المهاد التي تزود الدم إلى الدماغ والهياكل المحيطة بها. وقد تورط في العديد من الاضطرابات الدماغية، بما في ذلك اعتلال وعائي دماغي اميلويد (CAA) vasculopathies -associated وتصلب الشرايين داخل الجمجمة وتمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة. تتطلب دراسات الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأمراض لتحديد أهداف عقار جديد للوقاية من النماذج الحيوانية. قد يكون بعض من هذه النماذج المعدلة وراثيا، في حين أن آخرين سوف تشمل عزل الدماغية، الأوعية الدموية، بما في ذلك طريقة CoW.The الموصوفة هنا هي مناسبة لعزل بقرة في أي سلالة الماوس ولديه إمكانات كبيرة لفحص (التعبير عن الجينات، وإنتاج البروتين، التعديلات البروتين posttranslational، تحليل secretome، الخ) دراسات على السفن الكبيرة من cerebro- الماوسالأوعية الدموية. ويمكن أن تستخدم أيضا لدراسات المجراة سابقا، من خلال تكييف نظام حمام الجهاز وضعت للمعزولة الشرايين الماوس حاسة الشم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دائرة الدماغية الشريانية (الدائرة الشريانية الدماغية)، المعروف أيضا باسم دائرة ويليس (البقرة)، حلقة من Willisor ويليس المضلع) وصفت لأول مرة من قبل توماس ويليس في 1664. وهو مفاغرة الدورة الدموية الموجودة في جميع أنحاء التصالبة البصرية وتحت المهاد التي يمكن أن تعتبر محورا مركزيا توريد الدم إلى الدماغ والهياكل المحيطة بها. يدخل الدم هذا الهيكل عن طريق الشريان السباتي الداخلي والشرايين الفقرية ويتدفق من دائرة عن طريق الوسط الداخلي والشرايين المخية الخلفية. وقد تركت كل من هذه الشرايين والحق الفروع على جانبي الدائرة. وقاعدي، وظيفة التواصل، والتواصل الشرايين كاملة دائرة الأمامي (الشكل 1 والشكل 2). تم تصغير خطر تدفق الدم وضعف في أي من الشرايين تدفق من دمج الدم دخول دائرة من الشريان السباتي والشرايين الدماغية، مما يضمن أن يتم توفير كمية كافية من الدم إلى بالمطر. ويقدم هيكل أيضا الطريق الرئيسي لتدفق ضمانات الدم في أمراض انسداد حاد في الشريان السباتي الداخلي.

عدة أنواع من الاضطرابات الدماغية لديهم أصلهم في البقرة. الأكثر شيوعا هي الدماغي اعتلال وعائي اميلويد (CAA) vasculopathies -associated وتصلب الشرايين داخل الجمجمة وتمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة. 1، 2، 3 وهذه الاضطرابات قد يؤدي إلى نقص انسياب الدم بسبب توسع الأوعية، وداخل المخ و / أو تحت العنكبوتية نزيف ترجمة في نهاية المطاف إلى السكتات الدماغية الإقفارية أو النزفية أو ، في أحسن الأحوال، نوبة نقص تروية عابرة. جعلت التطورات الحديثة في إجراءات التشخيص، بما في ذلك تصوير الأعصاب، وربما جنبا إلى جنب مع القسطرة، من الممكن تشخيص هذه الأمراض الدماغية الكبرى سريريا، دون الحاجة لخزعة الدماغ. ومع ذلك، علاجات فعالة ومحددة (الدوائية أو اللف) تفتقر حاليا، وبالتالي هناك حاجة لتعريف جديدأهداف جزيئية.

وتحديد الأهداف عقار جديد للوقاية من هذه الأمراض في البشر تتطلب النماذج الحيوانية وسبل عزل الدماغية، الأوعية الدموية بما في ذلك بقرة. وينبغي لهذه النماذج أن يقدم دليلا على والقرائن إلى تغييرات محددة، بما في ذلك التغيرات الالتهابية، والتي تحدث في جدران الأوعية الكبيرة في النماذج الحيوانية من تمدد الأوعية الدموية في الشريان داخل الجمجمة، الجهاز المركزي للمحاسبات أو تصلب الشرايين داخل الجمجمة. 4، 5، 6

قمنا بتأسيس طريقة لعزل الماوس بقرة لتسهيل الدراسات من التهاب الأوعية في مرض الزهايمر (AD) والأمراض ذات الصلة، مثل الجهاز المركزي للمحاسبات. وقد تم تطوير هذه الطريقة لعزل البقرة الماوس لتقييم التعبير الجيني الدماغية التهابات أثناء تطور المرض. جنبا إلى جنب مع الكشف عن ترسب اميلويد بيتا داخل جدران السحايا الرقيقة وحنوني الشرايين، يمكن لهذا الأسلوب يجعل من الاسهل لردعمنجم العلاقة المحتملة بين التعبير الجيني التهاب في جدار الأوعية الدموية الدماغية، وتراكم Aβ الببتيد. شبكة الأوعية الدموية في الدماغ، بما في ذلك السحايا الرقيقة وحنوني في الفضاء تحت العنكبوتية، هو امتداد للشرايين الكبيرة تشكيل دائرة ويليس. ويمكن استخدام الأسلوب هو موضح هنا لعزل بقرة من أي سلالة الماوس ويمكن استخدامها لجميع أنواع الفرز (على سبيل المثال، التعبير الجيني، وإنتاج البروتين والتعديلات البروتين posttranslational) على السفن الكبيرة من الفأرة الدماغية، الأوعية الدموية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ كافة الإجراءات وفقا للمعايير الجماعة الأوروبية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وبموافقة لجنة الاخلاق المحلية لإجراء التجارب على الحيوانات (إيل دو فرانس-باريس-لجنة والاعتماد 4270).

1. التخدير

  1. ضخ جرعة قاتلة من بنتوباربيتال (تصل إلى 1 ملغ / 10 غرام من وزن الجسم) (إبرة 27 عيار وحقنة 1 مل) البريتونى إلى فئران بالغة قبل الجراحة.

2. السفينة الإرواء

ملاحظة: ليست هناك حاجة لتطبيق التعليم والتدريب المهني مرهم للعين خلال نضح السفينة. هذا الإجراء السريع (5-10 دقائق) وينتهي في موت الحيوان. تأكيد عدم استجابة مع قليل أخمص قدميه.

  1. باستخدام مقص القزحية، وجعل شق، حوالي 4 سم، في جدار البطن والصفاق، فقط تحت القفص الصدري.
  2. إجراء شق صغير (بضعة ملليمترات طويلة) في الحجاب الحاجز ومن ثم continuالبريد شق في الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري لفضح تجويف الجنبي.
  3. رفع القص بعيدا والمشبك غيض من القص مع مرقئ. وضع مرقئ على الرقبة. تقليم بعناية الأنسجة الدهنية التي تربط عظمة القص إلى القلب.
  4. اجتياز 15 عيار التروية الإبرة من خلال البطين الأيسر في قمة القلب.
  5. وأخيرا، استخدام مقص لقطع أحد فصوص الكبد لخلق متنفسا.
    ملاحظة: يمكن إنشاء منفذ بديل باستخدام مقص القزحية لخلق شق إلى الأذين الأيمن.
  6. يروي هذا الحيوان مع 25-50 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع مضخة تعمل بمعدل 2.5 مل / دقيقة. يجب أن يتم استبدال الكبد بلانش لأن الدم مع برنامج تلفزيوني.
  7. بعد ما يقرب من خمس دقائق، وبمجرد أن السائل من الكبد واضح تماما، ووقف نضح.
  8. إذا تم التخطيط المناعية أو تلطيخ العادية، يروي الحيوان مع 50 مل من امتصاص العرق(منهاج العمل، 4٪ في برنامج تلفزيوني) لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: الحذر، والأبخرة PFA سامة. وينبغي أن يتم نضح من الحيوانات مع PFA في غطاء الدخان التهوية.

3. عزل الدماغ ودائرة ويليس

  1. عزل الدماغ
    1. إزالة الرأس مع زوج من مقص جراحي.
    2. جعل شق خط الوسط مع مقص القزحية، جنبا إلى جنب الجلد من العنق إلى الأنف.
    3. تقليم قبالة الجلد لفضح الجمجمة وإزالة أي العضلات المتبقية والأنسجة الدهنية مع مقص القزحية.
    4. وضع نهاية حادة من مقص القزحية إلى ماغنوم الثقبة على جانب واحد، وحرك لهم بعناية على طول السطح الداخلي للجمجمة إلى الصماخ السمعي الخارجي (المعروف أيضا باسم قناة الأذن).
    5. إنتاج شق صفها في 3.1.4 على الجانب المقابل، وجعل خط الوسط وقطع على طول السطح الداخلي من العظم بين الجداري لبدء الدرز السهمي.
    6. زرع القزحيةمقص في العظم الجبهي، والحق بين العينين، في الدرز السهمي ثم فتحها لتقسيم الجمجمة في البلدين.
    7. رفع من الدماغ، والاستيلاء على بصيلات الشم وباستخدام مقص القزحية لقطع الاتصالات العصبية على سطحه البطني.
    8. إزالة الدماغ ووضعه في 60 ملم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني لعزل البقر. تزج تماما الدماغ في برنامج تلفزيوني. إذا تم إصلاح الدماغ مع PFA 4٪ (لباجتزاء لاحق والمناعية أو تلطيخ العادية)، ويبقيه في حمام من 4٪ PFA في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. عزل دائرة ويليس
    ملاحظة: مطلوب مجهر تشريح لعزل البقر. يجب أن تبقى في الدماغ في 4 درجات مئوية في جميع أنحاء الإجراء بأكمله.
    1. وضع الدماغ رأسا على عقب (أي على السطح الظهري لل) لتصور البقرة.
    2. استخدام ملقط صغير للاستيلاء على الشرايين الدماغية الأمامية (ACA) في قاعدة الفص الشمي ( ب (الشكل 1).
    3. استخدام نهايات حادة من ملقط لرفع وإزالة الشرايين الكبرى التي تكون بقرة من القشرة.
    4. ارفع بداية الخلفي التواصل الشرايين (PCA) لفصلهم من الدماغ، التي تجتاح الشرايين الدماغية المتوسطة (MCA) مع ملقط. التقاط الشرايين الأمامية (ACA وMCA) وسحبها بلطف على chiasm البصرية في الاتجاه الأمامي الظهري. لمنع الفوضى من البقر، يقطع الإجراء للتعامل مع الشرايين الأخرى.
    5. كرر الخطوات من 3.2.2 و 3.2.3 للشرايين المخيخيتين والخلفية (SCA) / (PCA) (ج، الشكل 1) والشريان القاعدي (BA) (د، الشكل 1)، وسحب منهم في dorsal- الاتجاه الأمامي. وقف في نهاية الإجراء الموضح طن 3.2.4.
    6. إزالة البقر كامل عن طريق سحب بلطف مع ملقط. ضع بقرة في 60 ملم طبق بيتري مليئة الجليد الباردة برنامج تلفزيوني وإزالة أي أنسجة المخ تعلق المتبقية مع اثنين من ملقط، وعقد بقرة في مكان مع دبابيس صغيرة.
    7. الحفاظ على بقرة تحصد في -80 درجة مئوية لمعالجتها لاحقا لتنقية الحمض النووي الريبي (عوائد استخراج الحمض النووي الريبي كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي - ما يقرب من 500 نانوغرام) أو استخراج البروتين.
      ملاحظة: لا يمكن الحفاظ عليه البقرة خارج الحي لمدة 24 ساعة، من خلال تكييف نظام حمام الجهاز المتقدمة للماوس معزولة الشريان حاسة الشم 7.

figure-protocol-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لعرض بطني من مخ الفأر تسليط الضوء على بقرة يتم تشكيل البقر اثنين من الشرايين السباتية الداخلية (MCA)، والتي هي مستمدة من اثنين من الشرايين الدماغية الأمامية (ACA)؛ وقاعديالشريان (BA) فروع في الخلفية (PCA) ومتفوقة (SCA) الشرايين الدماغية، واثنين من الشرايين الفقرية (VA).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قتل الماوس perfused برنامج تلفزيوني ويتم عزل البقر كما هو موضح في الفقرة 3.2 من البروتوكول. عند إجراء تشريح بشكل صحيح، يجب أن البقرة يخرج في قطعة واحدة، وينبغي أن تكون شفافة بعض الشيء نظرا لعدم وجود الدم المتبقي في الأوعية الدموية.

figure-results-1
الشكل 2: البقرة ماوس بعد ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف بروتوكول استنساخه لعزل دائرة ويليس. الاضطرابات الدماغية الأكثر شيوعا التي تنطوي على بقرة هي vasculopathies المصاحب الجهاز المركزي للمحاسبات، وتصلب الشرايين داخل الجمجمة وتمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة، والتي تؤثر على جدران الأوعية الشريانية. عوامل الخطر معروفة جيدا، ولكن المرضية الجزيئية هذه الاضطرابات الدماغية تزال غير مفهومة تماما وعلامات بيولوجية محددة للتنبؤ حدوثها تفتقر. وهناك اهتمام كبير في طرق لعزل البقرة من الفئران المعدلة وراثيا لربط الملاحظات العيانية مع ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل جامعة باريس السادسة ومنحة بيير فابر الابتكار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو s الفوسفات المخزنة المالحةSigma-AldrichD8537
Dumont # 55 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11295-51
مقص القزحية الناعمة المتصلبة   ؛أدوات العلوم الدقيقة14090-11
مقص - مستقيم / حاد / حاد     16.5 سمأدوات العلوم الدقيقة14002-16
ملقط دومون #7b  أدوات العلوم الدقيقة11270-20
مجهر التكبير المجسمنيكونSMZ745T
CellBIND Surface 60 مم طبق ثقافةCorning# 3295
مضخة تمعجية - MINIPULS 3GilsonM312
Pentobarbital SodiqueCeva Sant & eacute ؛ AnimaleFR / V / 2770465 3/1992

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
  2. Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
  3. Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
  4. Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
  5. Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
  6. Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
  7. Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
  8. Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
  9. Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
  10. Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
  11. Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
  12. Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
  13. Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
  14. Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PBS

مقالات ذات صلة