يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد وتطبيقات الثقافات عضوي التوتة شريحة

8.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54355

⸱

أغسطس 6, 2016

 ,  , 
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا إعداد شرائح الغدة الصعترية التي، جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، ويمكن استخدامها لنموذج اختيار الإيجابية والسلبية لتطوير خلايا تي. ويمكن أيضا شرائح الغدة الصعترية يمكن تكييفها لفي الموقع تحليل الهجرة خلية توتية، التعريب، وإشارات عبر المناعي واثنين من الفوتون المجهري.

الملخص

وقد وفرت عائدات اختيار الغدة الصعترية في المكروية الغدة الصعترية فريدة وعالية التنظيم مما يؤدي إلى توليد وظيفية، مرجع خلية T-متسامح النفس. في المختبر نماذج لدراسة التزام نسب T والتنمية رؤى قيمة حول هذه العملية. ومع ذلك، فإن هذه النظم تفتقر إلى كامل محيط الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد ضروري للتنمية الخلايا التائية، وبالتالي، هي تقريبية غير مكتملة في الجسم الحي اختيار الغدة الصعترية. بعض التحديات المتعلقة بالتنمية خلية النمذجة تي يمكن التغلب عليها باستخدام النماذج في الموقع التي توفر المكروية الغدة الصعترية سليمة التي تؤيد تأييدا كاملا اختيار الغدة الصعترية من تطوير خلايا تي. الغدة الصعترية الثقافات شريحة عضوي النمط تكمل القائمة في تقنيات الموقع. شرائح الغدة الصعترية الحفاظ على سلامة المناطق القشرية والنخاعية الغدة الصعترية وتوفر منبرا لدراسة تطوير thymocytes مضافين لمرحلة تنموية محددة أو الذاتية T جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في المكروية الغدة الصعترية ناضجة. نظرا لقدرتها على توليد ~ 20 شرائح في الماوس، وشرائح الغدة الصعترية تقدم ميزة فريدة من نوعها من حيث قابلية للتجارب إنتاجية عالية. وعلاوة على ذلك، السهولة النسبية في توليد شرائح الغدة الصعترية والقدرة على تراكب فرعية التوتة مختلفة أو السكان الخلية الآخرين من خلفيات وراثية متنوعة تعزز براعة هذا الأسلوب. نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد شرائح الغدة الصعترية، والعزلة، وتراكب thymocytes، وتفكك شرائح الغدة الصعترية لتحليل تدفق cytometric. ويمكن أيضا أن تتكيف هذا النظام لدراسة تطوير الخلايا التائية غير التقليدية وكذلك تصور الهجرة خلية توتية، التفاعلات خلية خلية توتية اللحمية، وإشارات TCR المرتبطة اختيار الغدة الصعترية بواسطة المجهر ثنائي الفوتون.

المقدمة

خلايا T تفرق من خلال سلسلة من وسيطة التنموية في الغدة الصعترية وهي الفترة التي كانت تواجه عدة نقاط التفتيش التي تضمن توليد وظيفية، متسامح النفس مرجع الخلايا التائية 1-3. اختيار إيجابية تعزز بقاء thymocytes مع مستقبلات الخلايا التائية (TCR) قادرة على الاعتراف، مع انخفاض في تقارب المعتدل، الببتيد التي قدمها الجزيئات الرئيسية في أنسجة الجسم المعقدة (MHC) على الخلايا القشرية الغدة الصعترية الظهارية (CTEC) 2،3. اختيار السلبية وتنمية الخلايا التائية التنظيمية (T ريج) تساهم في إنشاء التسامح مع الذات عن طريق القضاء أو تحويل thymocytes التي تستجيب بقوة لالببتيد الذاتي التي قدمها MHC 2،4. غير ناضجة CD4 + CD8 + إيجابية المزدوج (DP) thymocytes معربا عن TCRs التي تمر عملية اختيار تفرق في القطعان الخلايا التائية الناضجة، والغالبية العظمى منها MHC الصف الأول المقيدة CD8 + السامة للخلاياأو MHC من الدرجة الثانية المقيدة CD4 + المساعد (SP) خلايا إيجابية واحدة T، قبل أن تغادرها الغدة الصعترية لأداء وظائف المستجيب في الأجهزة اللمفاوية الثانوية 1-3.

إضافة إلى تعقيد تطوير الخلايا التائية هي الهجرة ديناميكية واللقاءات الخلوية تطوير thymocytes في جميع أنحاء شبكة خلية انسجة 5-9. هذه الخلايا اللحمية تلعب أدوارا متميزة في تطوير خلية توتية ويتم توزيعها بشكل مختلف بين المناطق القشرية والنخاعية الغدة الصعترية حيث الايجابية والسلبية اختيار تحدث 10. على الرغم من أن اختيار إيجابية تجري في المقام الأول في القشرة، وهناك أدلة تتراكم أن موانئ دبي thymocytes تهاجر إلى النخاع ولا تزال بحاجة إلى إشارات TCR قبل أن تتمايز إلى خلايا T ناضجة مما يشير إلى أن النخاع قد توفر إشارات إضافية ضرورية لاستكمال اختيار الإيجابية ونسب التمايز 11،12. وعلاوة على ذلك،على الرغم من وجود خلايا متخصصة النخاعية الغدة الصعترية الظهارية (MTEC) التي تعبر عن ومولدات المضادات المقيدة الأنسجة موجودة تسهيل حذف thymocytes autoreactive 13،14، تحدث نسبة كبيرة من اختيار السلبية في القشرة ردا على أعرب بتواجد مطلق الببتيد الذاتي قدمت من قبل شجيري الخلايا 15،16. وبالتالي، يجب نماذج دقيقة للتطوير الخلايا التائية توفر المكروية الغدة الصعترية درجة عالية من التنظيم، مع القشرية سليمة والمناطق النخاعية، التي تسهل التفاعل بين thymocytes والخلايا اللحمية، وتدعم الهجرة خلية توتية كما تخضع هذه الخلايا اختيار الإيجابية والسلبية.

لتكمل خارج الحي تحليلات thymocytes كوسيلة لدراسة اختيار الإيجابية والسلبية، وعدد من في المختبر، في الموقع، وفي النماذج الحية للتنمية الخلايا التائية وضعت 17-22. فقد كان من الصعب بمكان أن ألخصاختيار إيجابية في المختبر، ولكن coculture من السكان الخلايا الجذعية أو السلائف الخلايا التائية مع خلايا انسجة التعبير عن الشق يجند، ولا سيما OP9-DL1 / 4 خلايا، لديها القدرة على دعم التزام نسب T واختيار إيجابية محدودة مما يجعله لا يقدر بثمن في نموذج المختبر ل دراسة T نمو الخلايا 23-25. قيود من هذا النظام، ومع ذلك، تشمل حقيقة أن هذه الخلايا تفتقر إلى المعدات اللازمة لتصنيع الببتيد فريدة من نوعها وجدت في خلايا انسجة الغدة الصعترية والمكروية الغدة الصعترية ثلاثية الأبعاد.

وإن كان أكثر تعقيدا من الناحية الفنية، في الموقع والنماذج الحية من اختيار الغدة الصعترية يمكن التغلب على بعض العقبات المتعلقة بنظم في المختبر. Reaggregate الثقافات الجهاز الغدة الصعترية (RTOC) تحتوي على تعريف خليط من thymocytes والخلايا اللحمية الغدة الصعترية 18،26،27. هذه reaggregates الخلايا الظهارية التوتة الحفاظ MHC من الدرجة الأولى والثانية والتعبير يمكن أن تدعم الإنمائية للالإقليم الشمالي على حد سواء التقليدية فرعية الخلايا التائية، ومع ذلك لا تزال تفتقر إلى تعريف المنشآت القشرية والنخاعية. الجنين الثقافة الجهاز الغدة الصعترية (FTOC) هو نموذج شعبية للتنمية الخلايا التائية التي يمكن المصنف مع thymocytes عبر ثقافة شنقا الإفلات من فصوص الغدة الصعترية lymphodepleted أو عن طريق الحقن من thymocytes إلى lymphoreplete فصوص الغدة الصعترية ودعم التنمية الفعالة للCD4 + و CD8 + T الخلايا مع مرور الوقت في الثقافة 18،28-31. في بدء ثقافة فصوص الغدة الصعترية الجنين هناك ندرة في mTECs، ولكن الهياكل القشرية والنخاعية محددة قد تتطور بمرور الوقت اعتمادا على الظروف. وهو عامل مهم هو أن هذا النموذج قد دعم تفضيلي الجنين مقابل تطوير خلية بالغة تي. وأخيرا، حقن intrathymic السلائف التوتة المحددة في فئران بالغة يمثل تحديا تقنيا ولكنها توفر بوضوح بيئة لدعم تطوير خلايا T في الجسم الحي. هذه في الموقع والنماذج الحية هي أدوات ممتازة رo يجب النظر في مسألة التنمية خلية الدراسة تي واستخدامها على أساس التجربة تلو التجربة.

شرائح الغدة الصعترية، ومع ذلك، فقد ظهرت مؤخرا كنموذج تنوعا، مكملة لدراسة اختيار الغدة الصعترية في الموقع مع إمكانية استيعاب فريدة من نوعها، ومعقدة، والتجارب التي مرت أعلى عموما. شرائح الغدة الصعترية الحفاظ على سلامة المناطق القشرية والنخاعية وتوفر إطارا الخلايا اللحمية التي تدعم الهجرة خلية توتية خلال التنمية، فضلا عن كفاءة الإيجابية والسلبية اختيار 11،32-39. مجموعات فرعية خلية توتية أضاف فوق شرائح الغدة الصعترية تهاجر إلى الأنسجة وعلى النحو المناسب microenvironmental المتخصصة 34،37. وthymocytes مضافين يمكن تمييزها عن الخلايا الذاتية شريحة الغدة الصعترية عبر علامات مسانج أو العلامات الفلورية ويمكن حافظت في الثقافة لعدة أيام. الثقافات الغدة الصعترية شريحة عضوي النمط يمكن استخدامها لدراسة الجوانب المختلفةالتنمية الخلايا التائية بما في ذلك اختيار التوتة، والسلوك خلية توتية (الهجرة والتفاعلات الخلوية)، وتوطين خلية توتية، من بين أمور أخرى. نظرا لقدرتها على توليد ~ 20 شرائح الغدة الصعترية في الماوس، وقابلية للتجارب أكبر عموما من غيرها في نماذج الموقع من اختيار الغدة الصعترية. على الرغم من أن إعداد شرائح الغدة الصعترية يتطلب معدات متخصصة، مثل vibratome، والوقت حياة شرائح الغدة الصعترية في الثقافة محدودة بسبب فقدان الخلايا مع مرور الوقت عن طريق موت الخلايا وعدم وجود غشاء تغليف، توفر شرائح الغدة الصعترية نموذجا ممتازا لتحليل اختيار الغدة الصعترية السكان متزامنة من thymocytes ضمن المكروية الغدة الصعترية ناضجة. نحن هنا وصف إعداد شرائح الغدة الصعترية (بما في ذلك حصاد الغدة الصعترية، تضمين الاغاروز من فصوص الغدة الصعترية وvibratome باجتزاء الأنسجة جزءا لا يتجزأ)، والعزلة وتغشية thymocytes، وتفكك شرائح الغدة الصعترية لتحليل تدفق cytometric.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على بروتوكولات لجميع الدراسات على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان في مركز البحوث - المسمى Hôpital ميزونوف-روسيمونت.

1. حصاد ماوس الغدة الصعترية لإعداد التوتة شرائح وتعليق خلية واحدة

  1. الموت ببطء الفأر مع CO 2 تليها خلع عنق الرحم.
  2. في غطاء تدفق الصفحي، دبوس الجانب البطني الماوس يصل إلى لوحة تشريح. رذاذ الفأر مع الايثانول 70٪. إزالة أي نوع من الكحول الزائد عن طريق اللمس مع الشاش لمنع الإيثانول من دخول تجويف الصدري وإتلاف الأنسجة.
  3. رفع الجلد في قاعدة القص مع زوج من ملقط وجعل قطع طريق الجلد. تمديد قطع من الجلد صعودا إلى كل forelimb.
  4. جعل خفض إضافي في قاعدة القص لفصل الحجاب الحاجز من القفص الصدري. ثم قطع كل جانب من القفص الصدري نحو الترقوة. الوجه القفص الصدري على نحو الرأس تعريض التجويف الصدري. وفصين اثنين منالغدة الصعترية تقع على الجزء العلوي من القلب.
  5. إزالة النسيج الضام حول فصوص الغدة الصعترية باستخدام ملقط، مقص تشريح الصغيرة، و / أو مقص منحني حادة. استخدام زوج من طرف منحني ملقط غرامة لرفع فصوص الفردية من تحت أو عبر المتبقية النسيج الضام.
    ملاحظة: لا فهم الغدة الصعترية مباشرة.
  6. وضع فصوص الغدة الصعترية في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على برنامج تلفزيوني ويوضع جانبا على الجليد لحين الحاجة إليها.

2. الاغاروز التضمين وVibratome التقطيع من التوتة فصوص

  1. يعد حل الاغاروز 4٪ لتضمين عن طريق إذابة 2 ز-انصهار منخفضة نقطة الاغاروز في 50 مل العقيمة برنامج تلفزيوني والميكروويف على إعداد منخفض حتى يذوب تماما agarose. تغطية قارورة مع رقائق الألومنيوم وضعها في حمام مائي عند 55 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  2. في نسيج الثقافة هود، وإعداد وسائل الإعلام كاملة RPMI-1640 التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 4 مم الجلوتامين، 1X البنسلين / الستربتومايسين، و 10 ميكرومتر2-المركابتويثانول.
  3. إضافة 1.5 مل كاملة وسائل الاعلام RPMI-1640 لكل بئر إلى 6 جيدا وحة زراعة الخلايا ووضع إدراج ثقافة خلية في كل بئر. تعيين لوحة جانبا في حاضنة عند 37 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
  4. يعد حمام الماء المثلج ذائب بالماء والثلج في دلو الجليد.
  5. بعناية إزالة جميع الأنسجة الضامة المتبقية المحيطة بكل فص الغدة الصعترية باستخدام ملقط غيض غرامة. هل هذا في حين غمرت الفص الغدة الصعترية في برنامج تلفزيوني في طبق زراعة الأنسجة، وبعد نقل على الأنسجة محو غارقة مع برنامج تلفزيوني، أو تحت المجهر تشريح.
  6. السماح للالاغاروز لتبريد أقل من 40 درجة مئوية، وعندما القارورة هي مجرد الحارة للاتصال، لتجنب ارتفاع درجة حرارة الأنسجة. صب تبريد 4٪ الاغاروز في قالب الأنسجة إلى ارتفاع ~ 1 سم.
  7. استخدام زوج من ملقط لنقل بعناية الفص الغدة الصعترية إلى أنسجة مسح ولفة برفق لتجف دون الإضرار الأنسجة. تأكد من أن الأنسجة يجف تماما أو أنه سوف تنزلق من الاغاروز تشريح خلال.
  8. إدراج بعناية الفص في الاغاروز وضعه إما أفقيا (لزيادة مساحة سطح كل شريحة) أو عموديا (لزيادة عدد شرائح) في الجزء السفلي من القالب. وضع القالب في الماء المثلج لمدة 5-10 دقائق للسماح للالاغاروز ليصلب.
  9. خلال هذا الوقت، وإعداد vibratome للتشريح من قبل تركيب علبة عازلة، وتجميع القرص العينة، وإدخال شفرة vibratome. ضع قطعة من الشريط مختبر على القرص العينة. تعقيم نظيفة، مساحة العمل تجميعها مع 70٪ من الإيثانول.
  10. وبمجرد أن يتصلب الأغاروس، عكس القالب واضغط برفق في وسطها للافراج عن الاغاروز جزءا لا يتجزأ من الفص.
  11. استخدام شفرة حادة لخفض الاغاروز الزائدة المحيطة الفص ترك ~ 2 ملم من الاغاروز على كل جانب و~ 0.5 سم في القاع.
  12. تأمين كل كتلة الاغاروز مع قطرة من الغراء الأنسجة إلى قطعة من الشريط على القرص العينة. كتل متعددة ويمكن لصقها على الشريط.
  13. محاذاة واي vibratome شفرة ث الجزء العلوي من كتلة agarose. ملء علبة عازلة مع برنامج تلفزيوني العقيمة حتى يتم مغمورة كتلة شفرة والاغاروز (ق) بالكامل.
  14. قسم الأنسجة الاغاروز جزءا لا يتجزأ من الحصول على شرائح بسماكة 400-500 ميكرون. تعيين vibratome إلى 0.225 ملم / ثانية سرعة، 100 التردد هرتز، و 5 ° زاوية.
  15. استخدام ملعقة عازمة على جمع شرائح الغدة الصعترية في لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة كما يتم قطع. تجاهل شريحة الأولى والأخيرة.
  16. فحص شرائح تحت المجهر في ضوء 4X التكبير. اختيار شرائح مع أنسجة الغدة الصعترية سليمة والمحيطة الاغاروز (الشكل 1A).
  17. نقل شرائح لوحة أعدت في الخطوة 2.3 باستخدام طرف ماصة إلى الشريحة بلطف شريحة الغدة الصعترية من ملعقة عازمة على إدراج الثقافة الخلية. كل إدراج يمكن أن تستوعب ~ 3 شرائح. تأكد من شرائح لا تلمس بعضها البعض أو الجدران إدراج الثقافة الخلية.
  18. الحفاظ على لوحة عند 37 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.

الطبقة = "jove_title"> 3. إعداد Thymocytes لتتراكب

  1. عزل فصوص الغدة الصعترية كما هو موضح في القسم 1. يفرق بين الفصوص يدويا لجعل التعليق خلية واحدة باستخدام معقم طاحونة 15 مل أنسجة مليئة 5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 2٪ FBS. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  2. الطرد المركزي الخلايا في 545 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 1 مل من تحلل العازلة 1X ACK (0.15 M NH 4 CL، 10 ملي KHCO 3، 0.1 ملي نا 2 EDTA) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لليز خلايا الدم الحمراء.
  3. ملء الأنبوب إلى 15 مل مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS. الطرد المركزي الخلايا في 545 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. resuspend الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS وتمر الخلايا من خلال مرشح شبكة 255 ميكرون.
  5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. الطرد المركزي الخلايا في 545 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و resuspend الخلية بيليه في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS في concentrأوجه من 1 × 10 7 خلايا لكل مل.
  6. تسمية الخلايا مع الأصباغ الخلوية مثل استر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة إذا لم تكن تستخدم thymocytes من الفئران معربا عن علامات مسانج أو صحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا لتمييزها عن الخلايا الذاتية شريحة.
  7. بعد غسل النهائي من الخلايا المسمى، resuspend الكرية خلية في وسائل الإعلام كاملة RPMI-1640 في 1-3 × 10 6 خلايا في 15 ميكرولتر.

4. تتراكب Thymocytes على التوتة شرائح

  1. استخدام ماصة لنضح أي السائل الذي يحيط شرائح الغدة الصعترية على إدراج.
    ملاحظة: احرص على تفادي الإضرار الاغاروز. في حالة تلف الاغاروز، فإن thymocytes مضافين لا نعلق على سطح شريحة بسبب فقدان التوتر السطحي.
  2. دون لمس شريحة مع طرف ماصة، تراكب 15 ميكرولتر من thymocytes أعدت في القسم 3 على كل شريحة الغدة الصعترية.
  3. احتضان جيش التحرير الشعبى الصينىالشركة المصرية للاتصالات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح للخلايا لتهاجر إلى شرائح الغدة الصعترية.
  4. بعد 2 ساعة، وشطف شرائح الغدة الصعترية 3 مرات مع 1 مل PBS لإزالة thymocytes مضافين الزائدة والتي لم تتحول بعد إلى الأنسجة.
  5. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حتى شرائح الغدة الصعترية جاهزة للحصاد، وعادة 1-72 ساعة اعتمادا على التجربة.

5. تفكك التوتة شرائح لالتدفق الخلوي

  1. إعداد أنبوب microcentrifuge لكل شريحة وذلك بإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS.
  2. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS إلى إدراج زراعة الأنسجة مع شرائح الغدة الصعترية ويحرك بلطف مع ملعقة عازمة على فصل شرائح من سطح إدراج الثقافة الخلية.
  3. نقل شريحة من الإدراج إلى أنبوب microcentrifuge باستخدام ملعقة عازمة.
  4. تعطيل شريحة باستخدام مدقة microcentrifuge لأنبوب عينة يدويا. إضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS إلى الحجم النهائي 300ميكرولتر.
  5. مرشح النسيج فصلها من خلال مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب microcentrifuge جديد. الخلايا التي تمت تصفيتها على استعداد لتكون ملطخة لتحليل تدفق cytometric 40.
  6. تصفية الخلايا مرة ثانية قبل تمريرها على قياس التدفق الخلوي لضمان أن جميع الاغاروز تتم إزالة ولا يعوق تدفق عداد الكريات.
  7. الحصول على الخلايا على تدفق عداد الكريات وتحليل البيانات كما وصفت سابقا 40.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحليل شرائح دعم الغدة الصعترية من الجوانب المختلفة للتنمية الخلايا التائية مثل اختيار الإيجابية والسلبية. لالتجارب الناجحة، ونوعية شريحة الغدة الصعترية أمر بالغ الأهمية. وبالتالي، يجب فحص شرائح الغدة الصعترية لضمان سلامة الأنسجة الغدة الصعترية وأن الاغاروز المحيطة شريحة الغدة الصعترية سليمة (الشكل 1A). التوتر السطحي يمكن أن يتعرض للخطر عندما تلف الاغاروز مما تسبب في انخفاض كبير في عدد من thymocytes التي تهاجر إلى...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد شرائح الغدة الصعترية ونتائج ممثل اختيار الإيجابية والسلبية كفاءة مضافين الاختيار معقد التوافق النسيجي الكبير المقيدة أنا TCR thymocytes المعدلة وراثيا عن طريق التدفق الخلوي. وقد استخدم هذا النظام مع نجاح مماثل لدعم اختيار الإيجابية للMHC من الدرجة الثانية مقيدة خلايا CD4 + T من الاختيار موانئ دبي thymocytes 32، و، في وجود مستضد ناهض، واختيار السلبية والغدة الصعترية تي تنمية ريج 11،12، 36،38،39،43،44. هذا البرو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نود أن نشكر ماريلين فورنييه على تعليقاتها على المخطوطة وخوسيه تيسييه على المساعدة الفنية. تم الحصول على C57BL / 6-Tg (OT-I) -RAG1 # 4175 من خلال برنامج تبادل NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة. يتم تقديم الدعم لهذا البحث من خلال منحة من مؤسسة SickKids و CIHR-IHDCYN (NI15-002) ، ومنحة تشغيلية من CIHR-III (MOP-142254) ، وأموال بدء التشغيل من FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) و Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation إلى HJM. HJM هو باحث مبتدئ 1 في FRQS ، ومحقق جديد CIHR (MSH-141967) ، وحاصل على جائزة Cole Foundation Early Career Transition.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
VibratomeLeica BiosystemsVT1000S 
NuSieve GTG AgaroseLonza50080قالب تضمين الاغاروز بدرجة حرارة انصهار
منخفضة (مقطوع - T12)Polyciences1898622 مم × 22 مم مربع ، مقطوع إلى 12 مم × 12 مم
شفرات التحضير ذات الحواف المزدوجةPersonna74-0002
لاصق المناديل3M & nbsp ؛1469SB
0.4 ومايكرو ؛ م إدراج ثقافة الخلية BD Falcon353090من بين العديد من العلامات التجارية التي تم اختبارها ، حافظت هذه على الخلايا الموجودة فوق الشرائح أفضل
ThermoFisher21600-010
RPMI-1640 مع L-glutamineWisent350-000-CL
مصل الأبقار الجنينيWisent080-110
L-Glutamine معطل بالحرارة ، 200 ملي مولارWisent609-065-EL
البنسلين / الستربتومايسين ، 100xWisent450-201-EL
2-MercaptoethanolAlfa AesarA15890
15 مل Tenbroeck مناديل المطاحنWheaton357426
نايلونمكون توريدU-CMN-255
عينة أنبوب الطرد المركزي الدقيق PestleBel-ArtF19922-0000
40 وميكرو ؛ م مصفاة خلية النايلونBD Falcon352340
ملقط Inox TipDumont & nbsp ؛RS-5047ملقط منحني ذو طرف ناعم ، مقاس .17 × .10 مم
ملقط صغيرDumont & nbsp ؛RS-5090 
شبكة مرشح

المراجع

  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
  4. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
  5. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  6. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  7. Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
  8. Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
  9. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  10. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
  11. Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
  12. Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
  13. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  14. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
  15. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
  16. Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
  17. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
  18. Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
  19. de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
  20. Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
  21. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
  22. Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
  23. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  24. de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
  25. Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
  26. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
  27. Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
  28. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
  29. Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
  30. Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
  31. Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
  32. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
  33. Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
  34. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  35. Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098(2012).
  36. Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566(2013).
  37. Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
  38. Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
  39. Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
  40. Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269(2012).
  41. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
  42. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  43. Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
  44. Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
  45. Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  46. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة شرائح غدية زعتريةتحضير شرائح غدية زعتريةعزل الخلايا الزعتريةتحليل قياس التدفق الخلويالبيئة الدقيقة للغدة الزعتريةتطور الخلايا التائيةالتقطيع بجهاز الفايبراتومالطمر في الآغاروزتراكب الخلايا الزعتريةمجهر فوتونين
إعداد وتطبيقات الثقافات عضوي التوتة شريحة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.