مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) وجين تحليل التعبير عن فوس، معربا عن الخلايا العصبية من الطازجة والمجمدة الأنسجة دماغ الفئران

ملخص

هنا نقدم بروتوكول الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS) لدراسة التعديلات الجزيئية في فوس، معربا عن الفرق العصبية من أنسجة المخ على حد سواء الطازجة والمجمدة. استخدام الأنسجة المجمدة يسمح نظام مراقبة الأصول الميدانية عزل العديد من مناطق الدماغ خلال جلسات متعددة لتحقيق الاستفادة القصوى من الموضوعات الحيوان قيمة.

الملخص

دراسة المرونة العصبية والتعديلات الجزيئية في السلوكيات علم هو التحول من دراسة مناطق الدماغ كاملة لدراسة مجموعات محددة من الخلايا العصبية تنشيط توزيعها قليلة يسمى الفرق العصبية التي تتوسط علم الجمعيات. وقد تم مؤخرا الأمثل مضان الفرز الخلية المنشط (FACS) لأنسجة الفئران الكبار الدماغ ويسمح عزل الخلايا العصبية تفعيلها باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا العصبية NeuN والبروتين فوس، وهو علامة من الخلايا العصبية تفعيلها بقوة. حتى الآن، تم عزل فوس، معربا عن الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى من أنسجة جديدة، والتي تنطوي الأيام تجهيز طويلة ويتم تقييمها بعد إجراءات طويلة ومعقدة السلوكية يسمح أعداد محدودة جدا من عينات المخ. هنا وجدنا أن غلة فوس، معربا عن الخلايا العصبية وفو مرنا من المخطط الظهرية كانت متشابهة بين تشريح الأنسجة الطازجة والأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية لمدة 3 - 21 أيام. وبالإضافة إلى ذلك، أكدنا على النمط الظاهريمن الخلايا إيجابية NeuN وNeuN سلبية مرتبة حسب تقييم التعبير الجيني من الخلايا العصبية (NeuN)، نجمي (GFAP)، oligodendrocytic (Oligo2) وmicrogial علامات (Iba1)، مما يدل على أن الأنسجة المجمدة يمكن أن تستخدم أيضا لنظام مراقبة الأصول الميدانية عزلة أنواع الخلايا الدبقية. عموما، فمن الممكن لجمع وتشريح وتجميد أنسجة المخ لجلسات متعددة FACS. هذا يزيد من كمية البيانات التي تم الحصول عليها من المواد الحيوانية القيمة التي غالبا ما خضعت لإجراءات سلوكية طويلة ومعقدة.

المقدمة

خلال التعلم والحيوانات تشكل الجمعيات بين مجموعات معقدة من المحفزات محددة للغاية. ويعتقد أن هذه المعلومات ذات الدقة العالية ليتم تشفيرها من التغييرات في أنماط محددة من الخلايا العصبية وزعت قليلة يسمى الفرق العصبية. وقد تم مؤخرا تحديد الفرق العصبية التي كتبها تحريض الجينات في وقت مبكر على الفور (IEGs) مثل فوس، قوس، وZif268 ومنتجات البروتين في الخلايا العصبية التي تم تفعيلها بقوة خلال سلوك أو التعرض جديلة. فوس، معربا عن الخلايا العصبية على وجه الخصوص وقد ثبت أن تلعب دورا السببية في سياق والسلوكيات تعلمت ^1-4 جديلة محددة. وهكذا، neuroadaptations الجزيئية فريدة من نوعها ضمن هذه تنشيط الخلايا العصبية فوس، معربا هي أفضل المرشحين للالآليات العصبية التي تكود علمت جمعيات شكلت خلال اضطرابات التعلم والتعلم غير طبيعية عادية، مثل الإدمان واضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) ^5.

Fluoreوقد سمحت مسرح الحادث الفرز الخلية المنشط (FACS) مؤخرا تحليل neuroadaptations الجزيئية فريدة من نوعها داخل الخلايا العصبية فوس، معربا عن. التدفق الخلوي والفرز الخلية وضعت في 1960s ^6،7 لتوصيف وعزل الخلايا وفقا لخصائص ضوء تشتت ومناعي بها، وقد استخدمت لفترة طويلة في علم المناعة وأبحاث السرطان. ومع ذلك التدفق الخلوي ونظام مراقبة الأصول الميدانية يتطلب خلايا مفردة نأت التي يصعب الحصول عليها من أنسجة المخ الكبار. وقد استخدم نظام مراقبة الأصول الميدانية أول من عزل وتحليل الخضراء بروتين فلوري (GFP) -expressing الخلايا العصبية الجسم المخطط من الفئران المعدلة وراثيا التي لا تتطلب الأجسام المضادة العلامات ^8،9. قمنا بتطوير القائم على الضد طريقة FACS ¹⁰ إلى عزل وتقييم التعديلات الجزيئية في فوس، معربا عن الخلايا العصبية تفعيلها من خلال المخدرات و / أو العظة في الحيوانات البرية نوع ^11-15. في هذه الطريقة، وصفت الخلايا العصبية مع الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا العصبية العامة NeuN، في حين تفعيلها بقوة الخلايا العصبيةوصفت مع الأجسام المضادة ضد فوس. على الرغم من أن طريقة الأولي لدينا يتطلب تجميع ما يصل إلى 10 فئران لكل عينة لأنسجة جديدة، سمحت التعديلات اللاحقة للبروتوكول FACS عزل فوس، معربا عن الخلايا العصبية والبلمرة الكمية سلسلة من ردود الفعل (QPCR) تحليل مناطق الدماغ منفصلة من الفئران واحد ^13-15 . وعموما، تم العثور على تغيرات الجزيئية فريدة من نوعها في فوس، معربا عن الخلايا العصبية تفعيلها خلال مجموعة متنوعة من السلوكيات context- وتنشيط جديلة في أبحاث الإدمان على ^12،14،15.

وهناك مشكلة لوجستية كبرى مع أداء نظام مراقبة الأصول الميدانية على أنسجة جديدة هي أن يستغرق يوم كامل لفصل الأنسجة والعملية من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية. وبالإضافة إلى ذلك، هناك فقط حوالي أربع عينات يمكن معالجتها يوميا. وهذا يعني عادة أن منطقة الدماغ واحد فقط يمكن تقييم من كل الدماغ ومناطق الدماغ المتبقية يتعين التخلص منها. هذه هي المشكلة الرئيسية لانخفاض الإنتاجية الإجراءات السلوكية مثل الإدارة الذاتية وتري الانقراضنينغ يتطلب الجراحة وأسابيع عديدة من التدريب المكثف. وعلاوة على ذلك، والإجراءات السلوكية طويلة ومعقدة في يوم الاختبار يجعل من الصعب على أداء نظام مراقبة الأصول الميدانية في نفس اليوم. وسيكون ميزة كبيرة لتكون قادرة على تجميد العقول من الحيوانات مباشرة بعد الاختبار السلوكي، ومن ثم عزل الخلايا العصبية فوس، معربا عن من مناطق الدماغ واحدة أو أكثر في أوقات مختلفة من اختيار المحققين.

هنا علينا أن نبرهن أن لدينا بروتوكول FACS يمكن استخدامها لعزل الخلايا العصبية فوس، معربا عن (وأنواع الخلايا الأخرى) من أنسجة المخ على حد سواء الطازجة والمجمدة. وكمثال على ذلك، ونحن عزل فوس، معربا عن الخلايا العصبية من المخطط الجرذان بعد حقن الميثامفيتامين الحادة ومن الفئران ساذجة بدون حقن (حالة المراقبة). ومع ذلك، هذا البروتوكول FACS يمكن استخدام أي بعد العلاج السلوكي أو الدوائي. وأشار تحليل QPCR لاحق من عينات لدينا أن التعبير الجيني من هذين النوعين من الخلايا يمكن تقييمها مع سيميكفاءة لار من الأنسجة على حد سواء الطازجة والمجمدة.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) من المعاهد الوطنية للصحة الدليل للرعاية واستخدام حيوانات المختبر ^(16).

ملاحظة: جميع الخطوات أدناه استخدام أنابيب الطرد المركزي انخفاض ملزم التي تم الاحتفاظ بها على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. إعداد قبل مجموعة الأنسجة

1. تعيين أجهزة الطرد المركزي إلى 4 ^{درجة مئوية.}
2. البولندية النار على مجموعة من ثلاثة الماصات الزجاج باستور مع تناقص بأقطار من حوالي 1.3، 0.8، و 0.4 ملم لكل عينة.
3. إعداد المسمى 1.7 مل أنابيب تحتوي على 1 مل الباردة العازلة ألف وإبقاء الأنابيب على الجليد.
4. إعداد علبة الجليد التي تحتوي على تشريح مصفوفة، ملاعق وألواح الزجاج (أو مقلوب الزجاج طبق بيتري) التي لأداء تشريح الدماغ. قبل البرد اثنين أو أكثر من شفرات الحلاقة على ورقة لوحات الزجاج والأنسجة استخدام لتجف جميع الصكوك التي تمس رالقضية.
5. ذوبان الجليد الحل أنزيم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة قبل جمع الأنسجة.

2. نسيج جمع وتشريح

1. بدء السلوكي أو الدوائي العلاج 90 دقيقة قبل جمع الأنسجة.
   ملاحظة: للحصول على النتائج المعروضة هنا، والحقن داخل الصفاق الحاد من 5 ملغم / كغم من الميثامفيتامين على الفئران في بيئة جديدة (حالة اختبار) والفئران ساذجة أبقى في أقفاص وطنهم (حالة المراقبة) أجريت.
2. تخدير الفئران عن طريق وضعها في مجفف عاء زجاجي مع isoflurane المشبعة وقطع رأس الفئران 30 - بعد مرور 60 ثانية باستخدام المقصلة.
   استخدام المقص لإزالة الجلد والعضلات من الرأس وفضح الجمجمة. استخدام رينجرز لقطع الجمجمة وفتح ماغنوم الثقبة وإزالة الجزء الخلفي من الجمجمة. استخدام رينجرز إلى قطع على طول الحواف العلوية من الجمجمة لفضح الدماغ. يجب الحرص على عدم تلف الدماغ. استخدام ملعقة صغيرة لحلج القطن بلطف تحتد رفع الدماغ. رفع الدماغ وقطع الأعصاب حتى الدماغ هو حر ^17.
3. تشريح الأنسجة باستخدام شفرات الحلاقة.
   ملاحظة: الحصول على عينات الأنسجة باستخدام أي من الطرق التالية: (2.3.1) تشريح الأنسجة حديثا. (2.3.2) الأنسجة المجمدة بعد تشريح. أو (2.3.3) الأنسجة المجمدة تشريح من الدماغ كله المجمدة. الحفاظ على مصفوفة تشريح الدماغ، شفرات الحلاقة والزجاج لوحة الجافة في جميع أنحاء تشريح ويمكن لعمليات مثل الماء المكثف تنميق تؤدي إلى الناشر منخفض التوتر من الخلايا. استخدام النظارات المكبرة لضمان تشريح دقيق.
   1. لتشريح الأنسجة الطازج، ضع الدماغ المستخرج حديثا في مصفوفة تشريح الدماغ (الفئران على شكل الدماغ قالب معدني مع فتحات لشفرات الحلاقة في فترات 1 مم) الذي تم المبردة على الجليد. إدراج اثنين أو أكثر من شفرات الحلاقة قبل المبردة في فتحات لقطع شرائح الاكليلية التي تحتوي على منطقة في الدماغ (ق) من الفائدة. ضع قطع شريحة على لوحة زجاجية مبردة.
      ملاحظة: تشريح الدماغ رجوملاعق من الفائدة على طبق من زجاج المبردة.
   2. لالأنسجة المجمدة بعد التشريح، تشريح منطقة في الدماغ (ق) من الفائدة من شرائح من الدماغ المستخرج حديثا، مماثلة لتلك المذكورة أعلاه في 2.3.1. ضع تشريح الأنسجة إلى microtube وتجميد بسرعة الأنسجة عن طريق غمر microtube في -40 درجة مئوية نظير البنتان لمدة 20 ثانية. حافظ على تشريح الأنسجة المجمدة في جميع الأوقات في -80 درجة مئوية الفريزر حتى مزيد من المعالجة.
   3. لالأنسجة المجمدة، وتجميد فورا الدماغ المستخرج حديثا في -40 درجة مئوية نظير البنتان وتخزينها في كيس مختوم في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      1. في يوم من تشريح، ضع الدماغ المجمدة في ناظم البرد وضعت في حوالي -20 درجة مئوية (أي أكثر دفئا من -18 درجة مئوية) لحوالي 2 ساعة لكي تتوازن درجة الحرارة.
         ملاحظة: العقل يمكن أن تقطع بسهولة عند هذه الدرجة، في حين أن انخفاض درجات الحرارة كثيرا تجعل الدماغ هشة جدا بحيث لا يمكن خفض بأمان.
      2. استخدام شفرات الحلاقة لخفض 1-2 ملم شرائح الاكليليةأدمغة المجمدة في ناظم البرد. استخدام اضعافها إبرة 12- لعيار 16 للحصول على اللكمات الأنسجة من هذه الشرائح في ظل ظروف التجمد. حافظ على تشريح الأنسجة المجمدة في جميع الأوقات حتى مزيد من المعالجة.
4. إضافة 1-2 قطرات من عازلة لتغطية تشريح الأنسجة قبل تنميق. إزالة معظم المادة البيضاء من الأنسجة باستخدام اثنين من شفرات الحلاقة لمنع فقدان الخلايا العصبية خلال الفترة المتبقية من عملية سحن. إذا بدءا من الأنسجة المجمدة، ثم السماح للأنسجة لذوبان الجليد على لوحة زجاج الباردة لمدة لا تتجاوز 1 دقيقة قبل تطبيق العازلة حل.
5. فرم الأنسجة 100 مرة في كل اتجاه متعامد مع شفرة حلاقة على طبق من زجاج المبردة. عقد شفرة حلاقة رأسي لوحة الزجاج عندما تنميق.
   ملاحظة: تنميق شامل أمر بالغ الأهمية لجميع الخطوات البروتوكول.
6. استخدام شفرات الحلاقة لنقل الأنسجة المفروم إلى أنابيب microcentrifuge تحتوي على 1 مل من الاحتياطي البارد A. عكس أنبوب 3-5 مرات لكهEP جميع الأنسجة المفروم في الحل.

التفكك 3. خلية

ملاحظة: استخدام نهاية لطيف على نهاية خلط للجميع من الخطوات التالية. لا تستخدم خلاط دوامة وتجنب فقاعات الهواء التي تسبب تلف الخلايا.

1. أجهزة الطرد المركزي لأنابيب العينات في 110 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف تجاهل. ببطء إضافة 1 مل من محلول أنزيم إذابة الطازج الباردة (التي تحتوي على مزيج من البروتينات والانزيمات) أسفل الجدار الداخلي للmicrotube. تمتص فورا بيليه كامل وبلطف ماصة صعودا وهبوطا 4 مرات فقط مع كبير معتدلة ماصة قطر الحافة لتفريق بيليه الأنسجة المفروم.
2. عكس microtubes على الفور لمنع بيليه من الالتصاق إلى أسفل واحتضان عينات مع نهاية الإفراط في نهاية خلط لمدة 30 دقيقة في 4 ^{درجة مئوية.}
3. بعد هضم أنسجة الأنزيمية، أنابيب الطرد المركزي في 960 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف وإضافة 0.6 مل من الاحتياطي البرد A. فوراذ بعد إضافة العازلة ألف واستخدام نفس ماصة لتفريق بيليه بواسطة مص بيليه كامل وبلطف ماصة صعودا وهبوطا 5 مرات.
4. ميكانيكيا يسحن الأنسجة هضمها وجمع في 15 مل أنابيب باستخدام الخطوات التالية. لكل عينة، استخدام مجموعة منفصلة من 3 الماصات باستور الزجاج المصقول النار مع تنازلي بأقطار من حوالي 1.3، 0.8 و 0.4 مم تعلق على المصابيح اللاتكس.
   1. يسحن بلطف كل عينة 10 مرات مع ماصة زجاج 1.3 مم. السماح للعينة تستقر لمدة 2 دقيقة على الجليد (الحطام والخلايا undissociated سوف تستقر في القاع). جمع طاف (~ 0.6 مل) ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل (أنبوب رقم 1).
   2. إضافة 0.6 مل العازلة حل لبيليه المتبقية. يسحن العينة 10 مرات مع ماصة زجاج 0.8 مم. السماح للعينة تستقر لمدة 2 دقيقة على الجليد. جمع طاف (~ 0.6 مل)، ونقل إلى نفس 15 مل المخروطية أنبوب # 1.
   3. إضافة 0.6 مل العازلة حل لبيلي المتبقيةت. يسحن العينة 10 مرات مع ماصة زجاج 0.4 مم. السماح للعينة تستقر لمدة 2 دقيقة على الجليد. جمع طاف (~ 0.6 مل، وبدون لمس بيليه مع الخلايا غير فصل) ونقل إلى نفس 15 مل المخروطية أنبوب # 1.
      ملاحظة: حافظ على قطر ماصة 0.4 ملم في أنبوب رقم 1 للخطوات سحن التالية.
   4. كرر الخطوة 3.4.3 ثلاث مرات أكثر باستخدام أصغر ماصة الزجاج (~ 0.4 مم)، وجمع طاف في منفصلة 15 مل أنبوب مخروطي (أنبوب رقم 2).
   5. يسحن تعليق خلية تم جمعها في أنابيب رقم 1 ورقم 2 لمدة 10 مرات أكثر باستخدام ماصة الزجاج 0.4 ملم والحفاظ على الجليد.

4. خلية التثبيت وPermeabilization

1. إعداد 4 microtubes لكل عينة (اثنان microtubes للخلايا من أنبوب رقم 1 واثنين من لخلايا من أنبوب رقم 2) وذلك بإضافة 800 ميكرولتر من الايثانول البارد 100٪ (المخزنة في -20 ^درجة مئوية قبل الاستخدام) في كل أنبوب والاحتفاظ بها على الجليد . ملاحظة: الإيثانول النهائيوالتركيز يكون 50٪.
2. ماصة ~ 800 ميكرولتر من تعليق خلية (من أنبوب رقم 1 وأنبوب رقم 2) في كل من 4 أنابيب تحتوي على الإيثانول الباردة وعكس أنابيب لخلط العينات.
3. احتضان أنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة في حين عكس الأنابيب كل 5 دقائق.
4. بعد تثبيت / permeabilization، أنابيب الطرد المركزي في 1700 x ج لمدة 4 دقائق على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. ترك 50 ميكرولتر من حل لمنع فقدان الخلية.
   ملاحظة: الكريات في هذه المرحلة هي بيضاء وعصا أقل لجدار الأنابيب من قبل permeabilization. لذلك، إزالة طاف بعناية عن طريق لمس جدار microtube حيث لا يوجد بيليه ووضع طاف ببطء باستخدام micropipette.

الترشيح 5. خلية

1. اعادة تعليق الكريات من الخطوة 4.4 مع برنامج تلفزيوني الباردة على النحو التالي:
   1. إضافة 550 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة إلى واحد من اثنين من microtubes القادمة من أنبوب رقم 1، واستخدام بي قطر كبير نسبياpette تلميح إلى ماصة بلطف صعودا وهبوطا تعليق خلية 5 مرات. كرر الشيء نفسه بالنسبة microtube واحدة قادمة من أنبوب رقم 2.
   2. للخلايا من أنبوب رقم 1، وذلك باستخدام نفس ماصة، ونقل تعليق الخلية الأولى لبيليه الثاني. resuspend الكرية الثاني قبل pipetting بلطف جنبا إلى جنب تعليق خلية صعودا وهبوطا 5 مرات.
   3. للخلايا من أنبوب رقم 2، و resuspend والجمع بين الكريات (أي microtubes الثالث والرابع) كما هو موضح في 5.1.2.
2. تصفية اثنين من تعليق خلية من خطوات 5.1.2 و 5.1.3 على حدة باستخدام اثنين من أزواج مختلفة من مصافى الخلية (100 ميكرون و 40 ميكرون أحجام المسام) على النحو التالي:
   1. قبل الرطب كل مصفاة الخلية عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني إلى داخل مصفاة. استخدام ماصة لإزالة الزائدة برنامج تلفزيوني من خارج مصفاة.
   2. ماصة تعليق الخلية من الخطوة 5.1.2 بالتساوي على مصفاة الخلية الأولى مع 100 ميكرون حجم المسام. جمع من خلال تدفق في أنبوب 50 مل على الجليد. استخدام بيpette لجمع flow- من خلال تعلق على الجزء السفلي الجانب الخارجي للمصفاة الخلية.
   3. استخدام نفس ماصة لنقل التدفق من خلال الخلية مصفاة 100 ميكرون إلى الخلية مصفاة 40 ميكرون. جمع هذا التدفق من خلال أنبوب في آخر 50 مل على الجليد. عند نقل تدفق من خلال من 40 ميكرومتر مصفاة الخلية، تغيير نصائح ماصة جديدة لتجنب التلوث من 100 مصفاة ميكرومتر الخلية.
   4. كرر هذه الخطوات تعليق الخلية من الخطوة 5.1.3 باستخدام مجموعة جديدة من المرشحات.
3. الجمع بين التدفق من خلال اثنين من كل عينة عن الحجم النهائي من حوالي 1 مل لكل عينة.

6. الحضانة مع الأجسام المضادة

ملاحظة: استخدام قسامات صغيرة من تعليق خلايا الدماغ لتحضير عينات الرقابة متعددة لتحديد التدفق المناسب الكريات الإعدادات قبل تشغيل العينة الرئيسية. لكل وضع العلامات الأجسام المضادة، وإعداد عينات السيطرة التي تتضمن أية أجسام مضادة، إلا أن حد ذاتهاالأجسام المضادة condary (أو غيرها من التسمية الفلورية)، وبعد ذلك كل الأجسام المضادة الأولية والثانوية (أو غيرها من التسمية الفلورسنت). استخدام عناصر التحكم هذه لتعيين البوابات التي تفصل محددة مقابل وضع العلامات غير محدد في عداد الكريات التدفق. عندما يكون ذلك ممكنا، استخدام fluorochromes التي لا تتطلب التعويض. زيادة الحجم النهائي من العينات السيطرة النابضة إلى الحجم النهائي من 700 ميكرولتر بإضافة برنامج تلفزيوني قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية.

1. إعداد تشتت الضوء والعينة الضابطة دابي عن طريق نقل عينة ميكرولتر من الخلايا التي تمت تصفيتها 100 إلى 1.7 مل microtube. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع 1 ميكروغرام / مل دابي لتلطيخ أنويتها. احتضان لمدة 10 دقيقة مع نهاية الإفراط في نهاية الاختلاط، وغسل (كما هو موضح في الخطوات 6.4.2 إلى 6.4.5) قبل أن تمر عبر قياس التدفق الخلوي.
   ملاحظة: يتم استخدام هذا النموذج فقط لضبط خلية / نوى البوابة قبل فرز الخلايا المتبقية في الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
2. إعداد عينات السيطرة immunolabeled واحدة عن طريق تحويل 100 & #181؛ ل من الخلايا التي تمت تصفيتها إلى 1.7 مل microtube. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع الأجسام المضادة واحد (على سبيل المثال، NeuN الأجسام المضادة). إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة إلى microtube مع الأجسام المضادة آخر (على سبيل المثال، فو الأجسام المضادة). إضافة الضد الثانوية المقابلة إذا لم يكن على الأجسام المضادة الأولية المباشر، مترافق.
   ملاحظة: يتم استخدام هذه العينات لتحديد أنبوب مضخم المناسب (PMT) الجهد، وتقييم تداخل الإشارات الفلورسنت اثنين إذا لزم الأمر. يجب معاير تركيز الأجسام المضادة لتحقيق أفضل نسب الإشارة إلى الضوضاء في كل القنوات. ويمكن أيضا إشارات الفلورسنت المتداخلة يتم تعويضهم من قبل المعايرة الداخلية للقنوات الفلورسنت مختلفة في قياس التدفق الخلوي.
3. إعداد مزدوجة الفلورسنت المسمى عينة السيطرة السلبية عن طريق نقل 100 ميكرولتر من الخلايا التي تمت تصفيتها إلى 1.7 مل microtube. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع الأجسام المضادة الثانوية وحدها أو الأجسام المضادة الأولية مباشرة مترافق مفتش الحكومة.
   ملاحظة: ثيعينة الضبط والرقابة ويمكن استخدام كل مرة قبل الفرز لتحديد مضان الخلفية لكل fluorophore.
4. إعداد عينة رئيسية ليتم فرزها.
   1. نقل 700 ميكرولتر من الخلايا التي تمت تصفيتها إلى 1.7 مل microtube. إضافة 7 ميكرولتر (1: 100) من الأجسام المضادة فو الأساسي مترافق مباشرة إلى اليكسا فلور 647 (مكافحة فو-AF647) و 1.4 ميكرولتر (1: 500) من الأجسام المضادة NeuN الأساسي مترافق مباشرة إلى فيكوإيريترين (مكافحة NeuN-PE). احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية الاختلاط.
   2. في نهاية الحضانة، إضافة 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة إلى كل microtube، بما في ذلك العينة الرئيسية والعينات السيطرة، ومزيج من قبل انقلاب.
   3. microtubes أجهزة الطرد المركزي في 1300 x ج لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، وترك 50 ميكرولتر طاف لمنع فقدان الخلية.
   4. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى خلايا بيليه و resuspend باستخدام ماصة يبلغ قطرها غيض كبير باعتدال.
   5. أجهزة الطرد المركزي في 1300 x ج لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية. دiscard طاف.
   6. إعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر الباردة PBS (ضبط الحجم النهائي يتوقف على حجم بيليه).
   7. نقل وتصفية تعليق في أنبوب عينة FACS مستديرة أسفل مع غطاء مصفاة الخلية (40 ميكرون). الحفاظ على خلايا immunolabeled على الجليد وتنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية على الفور. ملاحظة: للحصول على الترشيح، ولمس طرف ماصة عموديا على الغطاء مصفاة، ودفع تعليق الخلية من خلال ذلك.
5. تدفق تعيين الكريات البوابات باستخدام عينات السيطرة.
   1. استخدام تشتت الضوء والعينة الضابطة دابي لتحديد السكان الخلية العصبية من مجموع الأحداث والحطام الخلوي.
      ملاحظة: الهيئات خلية في هذا المستحضر ليست سوى 1-2٪ من مجموع الأحداث (والباقي الحطام والعمليات الخلوية مكسورة). واستنادا إلى دابي إشارة الفلورسنت (تشير إلى نوى) ومبعثر إلى الأمام (حجم الخلية) فمن الممكن لتحديد أجسام الخلايا وبوابة تستند إلى الوراء على الأمام والجانب ضوء نثر خصائصالخلايا (كما هو موضح في الشكل رقم 1 أ، ب).
   2. استخدام عينات سيطرة immunolabeled واحدة لتحديد إعدادات PMT الجهد، وتحليل امتداد الانبعاثات من تألقي واحد محدد إلى مرشح / قناة أخرى (على سبيل المثال، اليكسا فلور 488 / FITC أو Phycoerythrine). إذا تداخل الإشارات الفلورسنت، وتصحيح التداخل عن طريق ضبط مستويات التعويض يدويا.
   3. استخدام سيطرة سلبية مزدوجة الفلورسنت وصفت لإعداد عتبة للسكان إيجابي.
      ملاحظة: الإشارة القادمة من هذه العينة ويعتقد أن ذلك يعود إلى صناعة السيارات في مضان وخلايا العينة الرئيسية تقع فوق هذه العتبة يمكن اعتبارها إيجابية. عادة، والمعلمات عتبة تصنيفها هي أكثر صرامة وتقريبا يتم فرز فعلا 2/3 العلوي من الخلايا المسمى فوق مراقبة سلبية.
6. نوع الخلايا العصبية من العينة الرئيسية التي FACS إلى 1.7 مل microtubes. جمع الخلايا في 50 ميكرولتر من الحمض النووي الريبياستخراج العازلة. بعد الفرز، ودوامة وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب وتخلط تعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات لاسترداد جميع الخلايا مرتبة من جدران الأنبوب.
7. احتضان تعليق خلية تم فرزها في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للتأكد من أن كل الخلايا هي lysed قبل استخراج الحمض النووي الريبي، ثم الطرد المركزي في 2800 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
8. طاف لنقل أنبوب ريبونوكلياز خالية للتخزين طويل الأجل في -80 درجة مئوية أو مباشرة معالجة العينة لعزل الحمض النووي الريبي، والتوليف [كدنا، الجين المستهدف قبل التضخيم وQPCR، كما هو موضح سابقا ^13-15.

النتائج

فرز الخلايا العصبية الإيجابية فوس فوس وسلبية من الطازجة والمجمدة الأنسجة الظهرية المخطط من الفئران واحدة بعد حقن الميثامفيتامين الحادة.

تم استخدام بروتوكول المذكورة أعلاه لفرز الخلايا العصبية الإيجابية فوس فوس وسلبية من فأر واحد ظهري المخطط 90 دقيقة بعد حقنة داخل الصفاق من الميثامفيتامين (5 ملغ / كلغ). واستخدمت الفئران ساذجة في أقفاص وطنهم والضوابط...

المناقشة

FACS يمكن استخدامها لفرز الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى من أي الطازجة أو المجمدة أنسجة المخ الكبار. كما ذكر في المقدمة، القدرة على استخدام الأنسجة المجمدة تتيح استغلال الأمثل لعينات من الحيوانات التي خضعت لإجراءات سلوكية معقدة ومطولة، مثل دراسات الإدارة الذاتية والانتكاس في أبحاث الإدمان. هذه الإجراءات السلوكية عادة ما يستغرق 1-2 ساعة أو أكثر، وتتطلب جميع الحيوانات (10-20 الكل) يتم اختبارها في نفس اليوم ^13،18. يستغرق ~ 4 ساعات لمعالجة 4 عينات أنسجة المخ تشريح حدي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مصفوفة الدماغ	CellPoint Scientific	69-2160-1	للحصول على شرائح الدماغ الإكليلية
السبات يتم استخدام	بتات الدماغ	HA-lf	Buffer A في البروتوكول لمعالجة الأنسجة والخلايا من خطوات التفكك إلى خطوات التثبيت
Accutase	Millipore	SCR005	يستخدم محلول الإنزيم في البروتوكول للهضم الأنزيمي للأنسجة قبل التخلي
أنبوب بروتين LoBind 1.5 مل ، PCR نظيف	Eppendorf	22431081	لمنع فقدان الخلية أثناء بروتوكول
مصفاة الخلية ، 40 & micro ؛ م	BD Falcon	352340	لتصفية خلية تعليق
الخلية مصفاة الخلية ، 100 & m	BD Falcon	352360	لتصفية تعليق الخلية
Falcon 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين المستدير القاع مع غطاء مصفاة الخلية	Bioscience	352235	لتصفية تعليق الخلية قبل المرور على مقياس التدفق
الخلوي Pasteur Pipet ، توريد زجاج	المعاهد الوطنية للصحة	6640-00-782-6008	للقيام بخلية الأنسجة
Milli-Mark Anti-NeuN-PE ، استنساخ A60 (فأر أحادي النسيلة) الجسم المضاد	EMD Millipore	FCMAB317PE	الجسم المضاد للكشف عن الخلايا العصبية
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)	تكنولوجيا إشارات الخلية	8677	جسم مضاد للكشف عن الخلايا التي تعبر عن Fos
DAPI	Sigma	D8417	لتسمية النوى
PicoPure RNA Isolation Kit	الأنظمة الحيوية التطبيقية.	KIT0204	تتضمن المجموعة المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي للخطوة 6.14. يتم استخدامه لجمع الخلايا المصنفة
Superscript III أول حبلا (كدنا	نظام تخليق Invitrogen	18080-051	لتصنيع (كدنا) من الحمض النووي الريبي
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems.	4391128	القيام بالتضخيم المسبق المستهدف من cDNA
TaqMan Advance Fast Master   ؛	الأنظمة الحيوية التطبيقية.	4444963	لعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجسات TaqMan
مسبار Fos TaqMan	Applied Biosystems.	Rn00487426_g1	مسبار TaqMan / الاشعال
< م > NeuN < / em > مسبار TaqMan	الأنظمة الحيوية التطبيقية.	CACTCCAACAGCGTGAC	لعلامة الجينات العصبية
< م > NeuN < / em > الأنظمة الحيوية التطبيقية التمهيدي	الأمامي.	GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	لعلامة الجينات العصبية
< م > NeuN < / em> التمهيدي العكسي	للأنظمة الحيوية التطبيقية.	TTCCCCCTGGTCCTTCTGA	لعلامة الجينات العصبية
< م > Gfap < / em > مسبار TaqMan	الأنظمة الحيوية التطبيقية.	Rn00566603_m1	مسبار TaqMan / بادئات لعلامة الجينات astrocityc
iba-1< / em> مسبار TaqMan	الأنظمة الحيوية التطبيقية.	Rn00574125_g1	مسبار TaqMan / بادئات لعلامة الجينات microglya
Gapdh< / em> مسبار TaqMan	الأنظمة الحيوية التطبيقية.	CTCATGACCACAGTCCA	للإشارة / التدبير المنزلي
الجينGapdh< / em> التمهيدي الأمامي	الأنظمة الحيوية التطبيقية.	GACAACTTTGGCATCGTGGAA	للجين المرجعي / التدبير المنزلي
Gapdh < / em> الأنظمة الحيوية التطبيقية التمهيدي	العكسي.	CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA	تسلسل النوكليوتيدات للإشارة / التدبير المنزلي الجين
Oligo2< / em> TaqMan	التحقيق الأنظمة الحيوية التطبيقية.	Rn01767116_m1	مسبار TaqMan / بادئات لعلامة الجينات قليلة التغصن
ماصة P1000	Rainin	17014382	يشار إليها باسم الماصة ذات قطر طرف كبير في الخطوتين 3.1 و 3.3 لخلية الأنسجة الخفيفة والخطوة 6.7 لإعادة تعليق الخلايا
7500 نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع في الوقت الحقيقي	الأنظمة الحيوية التطبيقية.	446985	لفارز الخلايا الكمي PCR
FACSAria I	Biosciences		لفرز FACS