Method Article

تنقية مجمعات الأصلية للدراسة الهيكلية باستخدام طريقة العلامة جنبا الى جنب الانجذاب

DOI:

10.3791/54389

⸱

July 27th, 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام طريقة تنقية التقارب الترادفي (TAP) على نطاق واسع لعزل المجمعات الأصلية من المستخلص الخلوي ، حقيقيات النواة في المقام الأول ، للبروتينات. هنا ، نقدم بروتوكول طريقة TAP المحسن لتنقية المجمعات الأصلية للدراسات الهيكلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد نهج تنقية تقارب ناجح في عزل المجمعات المحلية لتوصيف البروتين. عدم التجانس الهيكلي ودرجة من التجانس التركيبي مجمع عادة لا تعيق التقدم في إجراء مثل هذه الدراسات. في المقابل، مجمع مخصص للتوصيف الهيكلية يجب تنقيته في الدولة التي هي على حد سواء بشكل إنشائي ومتجانسة من الناحية الهيكلية وكذلك بتركيز أعلى من اللازم لالبروتينات. في الآونة الأخيرة، كانت هناك تقدما كبيرا في تطبيق المجهر الإلكتروني لتحديد هيكل المجمعات الجزيئات الكبيرة. زاد هذا الاهتمام في نهج مجمعات تنقي الأم ذات نوعية كافية وكمية من أجل تقرير الهيكلي بواسطة المجهر الإلكتروني. وقد تم تحسين (وات) طريقة جنبا الى جنب الانجذاب تنقية لاستخراج وتنقية وسيلة فرعية 18، ~ 0.8 نجمة داود الحمراء بروتين نووي ريبوزي التجمع من مهدها الخميرة (خميرة الخباز)

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنفيذ العديد من العمليات الخلوية الرئيسية من قبل البروتين كبير والبروتين RNA مجمعات 1. واختناق كبير لإجراء دراسات الفيزيائية الحيوية والهيكلية لهذه المجمعات هو الحصول عليها من نوعية مناسبة (أي تجانس) وبتركيز مناسب. عزل مجمع من مصدر الأصلي يحتوي على العديد من المزايا، بما في ذلك الاحتفاظ التعديلات بعد النسخي و / أو متعدية ذات الصلة من مفارز وتأمين التجمع معقدة السليم. ومع ذلك، المجمعات الخلوية كبيرة غالبا ما تكون موجودة في خلية في عدد نسخة منخفضة وتنقية يجب أن تكون فعالة للغاية وتحدث في ظل الظروف الفسيولوجية القريب لضمان الحفاظ على سلامة المعقدة. تنقية مجمع من مصدر وحيد الخلية هو تحديا من نوع خاص، ويمكن أ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: لقد ابتكر البروتوكول التالي لتنقية مجمع من 4 لتر من زراعة الخلايا، تقريبا الوزن 40 غ الرطب من الخلايا. مرة واحدة على استعداد، يجب أن يتم تخزين جميع المخازن في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون شهر من إعدادها. تضاف الحد من وكيل ومثبطات الأنزيم البروتيني فقط إلى مخازن فقط قبل استخدامها.

1. إعداد استخراج خلية كاملة عن جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

  1. نمو س. خلايا خميرة
    1. خط ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت طريقة TAP تعديل لتنقية من س. الخباز وU1 snRNP، وهو بروتين نووي ريبوزي مجمع 18 فرعية. لتنقية TAP الأولية للمجمع بعد 2،3 بروتوكول نشر أسفرت مجمع الذي ظهر غير متجانسة، يهاجرون إلى ثلاثة فرق على الفضة الملون هلام بولي أكريلاميد الأصلي (الشكل 2A). جولات متعددة من تعظيم الاستفادة من طريقة TAP، أسفرت عن المجمع الذي هاجر في المقام الأول لفرقة واحدة على هلام الأصلي يدل على تجميع أكثر تجانسا (الشكل 2A).......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة التونسية تستخدم علامات اللذين تحقيق التوازن بين الحاجة إلى ضيق وانتقائية ملزمة لراتنج تقارب مع الرغبة في الحفاظ على قرب شروط حل الفسيولوجية. ويقدم التوازن للحفاظ على التفاعل مستقر (ق) من البروتين ذات الكلمات الدلالية مع التفاعل عامل (ق) لتوصيف ما بعد تنقية. وبالإضافة إلى ذلك، الموسومة TAP الفردية المتاحة من مصدر تجاري ORFS، بحيث يمكن للمرء أن يحصل على أي سلالة الخميرة مع بروتين الموسومة لأي مجمع الخميرة. الحفاظ على سلامة عملية معقدة وتوافر الموارد لاختبار استخدام مختلف وحد.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ممتنون لدعم ونصيحة نيكولاس غريغوريف. نشكر آنا لوفلاند وأكسل بريلوت وتشن شو ومايك ريجني على المناقشات المفيدة وإرشادات EM. تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم ، الجائزة رقم 1157892. يتم دعم مرفق Brandeis EM من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة P01 GM62580.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
S. cerevisiae TAP الموسومة سلالةOpen BiosystemsYSC1177هذه هي سلالة الخميرة الأساسية المستخدمة لتطوير بروتوكول TAP. خلفيته هي S288C: ATCC 201388: MATa ، his3 & Delta ؛ 1 ، leu2 & دلتا. 0 ، met15 & دلتا. 0 ، ura3 & دلتا. 0 ، SNU71 :: TAP:: HIS3MX6
مطحنة القهوةMr. CoffeeIDS77تستخدم لمقياس الدم لتحلل الخلايا
، Bright LineHausser Scientific3120تستخدم لتقييم تحلل الخلايا
JA 9.100 دوار الطرد المركزي   ؛بيكمان كولتر ، إنك.تستخدم لحصاد خلايا الخميرة
JA 20 دوار الطرد المركزي ذو الزاويةالثابتة Beckman Coulter، Inc.تستخدم لمسح مستخلص الخلية من المواد الخلوية غير القابلة للذوبان
Ti 60 دوار الطرد المركزي ذو الزاويةالثابتة Beckman Coulter، Inc.تستخدم لمزيد من مسح مستخلص الخلية القابلة للذوبان
ThermomixerEppendorfR5355شاكر الذي يتم التحكم فيه في درجة الحرارة
نظام هلام NovexThermo Fisher Scientific   ؛
راتنج IgGGE Healthcare17-0969-01Sepharose 6
راتنج كالمودولينالتدفق Agilent Technologies، Inc.214303البروتياز الراتنج Affinity
، أقراص صغيرةSigma Aldrich589297أقراص صغيرة cOmplete فائقة الخالية من EDTA
كوكتيل مثبط البروتياز ، أقراص كبيرةSigma Aldrich5892953cOmplete فائقة الخالية من EDTA
Phenylmethanesulfonyl فلوريد (PMSF) مذابفي الأيزوبروبانول
2 مل عمود Bio-SpinBio-Rad مختبرات ، شركة7326008تستخدم لتعبئة وغسل راتنج Calmodulin
10 مل عمود بولي التحضيرBio-Rad Laboratories، Inc.7311550تستخدم لتعبئة وغسل راتنج IgG
مسبقة الصب الأصلي PAGE Bis-Tris المواد الهلاميةLife TechnologiesBN1002Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16٪ جل بولي أكريلاميد مسبقة الصب
NativeMark معيار البروتينThermo Fisher ScientificLC0725معيار البروتين غير الملوثة المستخدم في PAGE الأصلي. تحميل 7.5 & ل للحصول على جل ملطخ بالفضة و 5 مو ؛ ل للحصول على جل SYPRO Ruby الملون
مسبقة الصب SDS PAGE Bis-Tris هلامLife TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12٪ جل بولي أكريلاميد مسبقة الصب   ؛
معيار بروتين PageRulerThermo Fisher Scientific26614معيار البروتين غير الملوثة المستخدم في النشاف الغربي
SDS تشغيل العازلةLife TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS الجسم المضاد
TAPالحراري فيشر العلميCAB1001الجسم المضاد الأساسي ضد علامة CBP
الجسم المضاد الثانويThermo Fisher Scientific31341الماعز المضادة للأرانب القلوية الفوسفاتيز مترافقة
BCIP / NBTThermo Fisher Scientific340425-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate / nitro blue tetrazolium   ؛
وحدات غسيلThermo Fisher Scientific88401Slide-A-Lyzer وحدات تصفية
الطرد المركزي ، 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Amicon Ultra-0.5 وحدة تصفية الطرد المركزي مع Ultracel-100
غشاء المنظفات الممتصة للحباتBio-Rad Laboratories، Inc.1523920ماصات Bio-bead SM-2
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564صبغة فلورسنت لتلوين الحمض النووي ، عند الكشف عن وجود SYPRO Ruby ، استخدم الطول الموجي للإثارة البالغ 488 نانومتر والطول الموجي للانبعاث 532 نانومتر
SYPRO RubyMolecular ProjectesS-12000صبغة فلورسنت لتلوين البروتين ، عند الكشف مع وجود SYBR Green II ، استخدم الطول الموجي للإثارة البالغ 457 نانومتر والطول الموجي للانبعاث 670 نانومتر
شبكات نحاسيةعلوم المجهر الإلكترونيG400-CP
سريع كوكتيل مثبط الكلى

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  2. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tandem Affinity PurificationNative Complex PurificationStructural Homogeneity AssessmentYeast Cell LysisIgG Sepharose BindingTEV Protease CleavageCalmodulin Affinity BindingNegative Stain EMSDS PAGE AnalysisMass Spectrometry Identification

Related Articles