يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنقية مجمعات الأصلية للدراسة الهيكلية باستخدام طريقة العلامة جنبا الى جنب الانجذاب

9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54389

⸱

يوليو 27, 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تم استخدام طريقة تنقية التقارب الترادفي (TAP) على نطاق واسع لعزل المجمعات الأصلية من المستخلص الخلوي ، حقيقيات النواة في المقام الأول ، للبروتينات. هنا ، نقدم بروتوكول طريقة TAP المحسن لتنقية المجمعات الأصلية للدراسات الهيكلية.

الملخص

وقد نهج تنقية تقارب ناجح في عزل المجمعات المحلية لتوصيف البروتين. عدم التجانس الهيكلي ودرجة من التجانس التركيبي مجمع عادة لا تعيق التقدم في إجراء مثل هذه الدراسات. في المقابل، مجمع مخصص للتوصيف الهيكلية يجب تنقيته في الدولة التي هي على حد سواء بشكل إنشائي ومتجانسة من الناحية الهيكلية وكذلك بتركيز أعلى من اللازم لالبروتينات. في الآونة الأخيرة، كانت هناك تقدما كبيرا في تطبيق المجهر الإلكتروني لتحديد هيكل المجمعات الجزيئات الكبيرة. زاد هذا الاهتمام في نهج مجمعات تنقي الأم ذات نوعية كافية وكمية من أجل تقرير الهيكلي بواسطة المجهر الإلكتروني. وقد تم تحسين (وات) طريقة جنبا الى جنب الانجذاب تنقية لاستخراج وتنقية وسيلة فرعية 18، ~ 0.8 نجمة داود الحمراء بروتين نووي ريبوزي التجمع من مهدها الخميرة (خميرة الخباز)

المقدمة

يتم تنفيذ العديد من العمليات الخلوية الرئيسية من قبل البروتين كبير والبروتين RNA مجمعات 1. واختناق كبير لإجراء دراسات الفيزيائية الحيوية والهيكلية لهذه المجمعات هو الحصول عليها من نوعية مناسبة (أي تجانس) وبتركيز مناسب. عزل مجمع من مصدر الأصلي يحتوي على العديد من المزايا، بما في ذلك الاحتفاظ التعديلات بعد النسخي و / أو متعدية ذات الصلة من مفارز وتأمين التجمع معقدة السليم. ومع ذلك، المجمعات الخلوية كبيرة غالبا ما تكون موجودة في خلية في عدد نسخة منخفضة وتنقية يجب أن تكون فعالة للغاية وتحدث في ظل الظروف الفسيولوجية القريب لضمان الحفاظ على سلامة المعقدة. تنقية مجمع من مصدر وحيد الخلية هو تحديا من نوع خاص، ويمكن أن تكون باهظة من الناحية المالية. وهكذا، الاستراتيجيات أو الأساليب التي تتسم بالكفاءة وتسفر عن مجمع متجانسة والمطلوب للغاية.

استراتيجية التي كانتنجحت في تنقية المجمعات الأم من الخلايا حقيقية النواة لتوصيف الأولي هو جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات) طريقة 2،3. وقد ابتكر طريقة TAP في البداية لتنقية البروتين الأصلي من الخميرة في مهدها (البيرة س) في مجمع مع التفاعل عامل (ق) 2. الطريقة التونسية تستخدم علامات اثنين، كل بطاقة تنصهر فيها جنبا إلى جنب لنفس تسلسل الجينات المكودة للبروتين. وقد تم اختيار العلامات وذلك لتحقيق التوازن بين الحاجة إلى ضيق وانتقائية ملزمة لراتنج تقارب مع الرغبة في الحفاظ على قرب شروط حل الفسيولوجية. ويقدم التوازن للحفاظ على التفاعل مستقر (ق) من البروتين ذات الكلمات الدلالية مع التفاعل عامل (ق) لتوصيف ما بعد تنقية. وضعت علامة TAP أدرجت genomically في نهاية (C-النهائي) من الجين تشفير البروتين وتتكون من سلسلة الترميز لكالمودولين ملزم الببتيد (CBP) تليها البروتين أ - إضافة أكثر من مجرد 20 كيلو دالتون إلى الموسومة بروتين. الجمارك وحماية الحدود قصير، 26 والأحماض الأمينية، ومعترف بها من قبل ~ 17 كيلو دالتون بروتين كالمودولين (CAM) في وجود الكالسيوم مع K D بناء على أمر من 10 -9 م 4. العلامة البروتين وأكبر، تتكون من اثنين من يكرر من 58 بقايا مع رابط قصير بين يكرر. ومن المسلم به كل تكرار حمض 58 الأمينية التي كتبها المناعي G (مفتش) مع K D ~ 10 -8 م 5. بين هذه العلامات اثنين تأسست موقع تقديرا لTEV البروتيني، وببتيداز داخلية من فيروس التبغ إحفر 6،7. كما هو موضح في الشكل رقم 1، في خطوة تقارب الأولى من طريقة برنامج المشورة التقنية الموسومة بروتين لا بد أن راتنج مفتش عبر البروتين ألف ومزال البروتين تصفها على عمود الانقسام على إضافة TEV البروتيني، الموقع تحديدا الشق بين العلامات اثنين. هذا هو خطوة ضرورية كما تفاعل مفتش والبروتين وقوي جدا ويمكن إلا أن يكون منزعجا بشكل كاف في ظل تغيير طبيعة الظروف الحل. تفتقر إلى العلاقات العامةotein علامة، لا بد من البروتين لراتنج كاميرا في وجود الكالسيوم ومزال من هذا الراتنج مع إضافة EGTA أيونات المعادن خالب (جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic) (الشكل 1).

بعد فترة وجيزة، تم استخدام إدخال طريقة وات في دراسة على نطاق واسع لتوليد "الخريطة" من ​​التفاعلات المعقدة في س. الخباز 8. الأهم من ذلك، نتيجة لهذا الجهد مكتبة بأكمله الخميرة TAP معلم المفتوحة القراءة الإطار (ORF)، وكذلك TAP الفردية الموسومة ORFS متاحة 9 من مصدر تجاري. وهكذا، يمكن للمرء الحصول على أي سلالة الخميرة مع بروتين الموسومة لأي مجمع الخميرة. كما حفزت طريقة TAP تعديلات أو تغيرات العلامة التونسية، بما في ذلك: استخدامه لتنقية المجمعات من حقيقية النواة الأخرى، وكذلك الخلايا البكتيرية 10،11. وتصميم "علامة تقسيم"، حيث أن البروتين ألف والجمارك وحماية الحدود يتم وضعها على البروتينات المختلفة 12؛ وتاتغيرت ع، وذلك لاستيعاب الحاجة للمحقق، مثل الحساسية من المجمع إلى الكالسيوم 2+ أو EGTA 13.

وقد أدت التطورات الحديثة في كل من الأجهزة ومنهجية تقدما كبيرا في تطبيق المجهر الإلكتروني (EM) لتحديد هيكل، التي أدت إلى الأعلى، بالقرب الصور ذات الدقة الذرية المجمعات الجزيئات 14. القرار الذي يمكن الحصول عليه من مجمع كتبها EM، ومع ذلك، لا يزال يتوقف على نوعية المجمع قيد الدراسة. وقد استخدمت هذه الدراسة المنهج العلامة التونسية لتنقية من س. الخباز وU1 snRNP، من 18 فرعية (~ 0.8 MDA) انخفاض عدد النسخ مجمع بروتين نووي ريبوزي التي هي جزء من التضفير 15،16. وقد تم اتخاذ عدد من الخطوات لتنقية هذا المجمع بحيث متجانسة وذات تركيز كاف. ووصف المشاكل المحتملة التي تواجهها في مختلف مراحل تنقية واستراتيجيات إجراءات للتصدي challأبرزت enges. من خلال تقييم بعناية والاستفادة المثلى من الخطوات في تنقية، تنقية U1 snRNP هو من نوعية وكمية في مناسبة لوصمة عار السلبية والإلكترون المجهري البرد (البرد EM) الدراسات. يوصف بروتوكول طريقة TAP الأمثل لتنقية المجمعات الأم للدراسات الهيكلية هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: لقد ابتكر البروتوكول التالي لتنقية مجمع من 4 لتر من زراعة الخلايا، تقريبا الوزن 40 غ الرطب من الخلايا. مرة واحدة على استعداد، يجب أن يتم تخزين جميع المخازن في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون شهر من إعدادها. تضاف الحد من وكيل ومثبطات الأنزيم البروتيني فقط إلى مخازن فقط قبل استخدامها.

1. إعداد استخراج خلية كاملة عن جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

  1. نمو س. خلايا خميرة
    1. خط الموسومة برنامج المشورة التقنية المطلوبة س. سلالة الخباز من التخزين (-80 درجة مئوية) في الصعود إلى سكر العنب الخميرة ببتون (YPD) لوحة. احتضان لمدة 3-5 أيام (30 درجة مئوية)، حتى تظهر خلايا الخميرة البيضاء ورقيق.
    2. تطعيم خط من حوالي 2 مم 2 من خلايا جديدة من لوحة إلى 10 مل سائل الإعلام YPD في 50 مل أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين مخروطي الشكل. هز أنبوب في 180 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) بين عشية وضحاها (30M درجة مئوية).
    3. تطعيم 2 مل من فوقثقافة يلة لكل لتر من وسائل الإعلام YPD في 2 L مخروطي أو دورق مخروطي. هزة في 180 دورة في الدقيقة (30 درجة مئوية). مراقبة نمو الخلايا في كثافة ضوئية من 600 نانومتر (OD 600) حتى مرحلة سجل في وقت متأخر، OD 600 من 1،8-2، عادة 20-24 ساعة.
  2. حصاد س. خلايا خميرة
    1. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 5400 x ج لمدة 15 دقيقة (4 درجة مئوية).
    2. صب بسرعة طاف والحفاظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية أو على الجليد.
    3. تعليق كل ليتر من بيليه الخلية مع 2 مل المبردة الاحتياطي تحلل (10 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل؛ 0.2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0 و 5 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8.0 و 10٪ الجلسرين؛ 0.1٪ ضد NP-40 / ت). تعليق الخلايا عن طريق دوامات و / أو تكرار pipetting ليستخدم 10 مل الماصة المصلية.
      ملاحظة: أهمية NP-40 لأنها تتعلق يناقش جودة المعقدة وتحليل بعد تنقية أدناه.
    4. نقل تعليق خلية في فارغة 50 مل البولي بروبلين المخروطية أنبوب الطرد المركزي كEPT على الجليد. يغسل كل زجاجة الطرد المركزي مع 2 مل إضافية من الاحتياطي تحلل المبردة وإضافة إلى تعليق خلية في أنبوب 50 مل.
    5. تحديد الوزن الرطب للبيليه خلية وزنها عن طريق الأنبوب، وطرح وزن أنبوب فارغ فضلا عن الواق تحلل المضافة.
      ملاحظة: ليتر من زراعة الخلايا وجود OD 600 من 1.8 حوالي 10 غرام.
    6. إنشاء حمام النيتروجين السائل في أنبوب 50 مل الطرد المركزي مخروطي البولي بروبلين. رسم الخلايا علقت في حقنة 5 مل. توصيل 16 G الإبرة إلى حقنة. تجميد تعليق خلية بتمريرها من خلال حقنة / إبرة لتوليد الخلايا "قطرات". وينبغي أن يكون معدل التجميد حوالي 1 دقيقة / مل.
    7. تخزين قطرات الخلايا المجمدة (-80 درجة مئوية) أو التوجه إلى تحلل.
  3. الناشر خلايا والمحللة توضيح
    1. ليز خلايا الخميرة باستخدام طاحونة القهوة. خلايا ليز ثماني إلى تسع مرات مع 25 ثانية طحن رشقات نارية، في حين تهز جطاحونة offee. قبل استخدامها، قبل البرد طاحونة القهوة مع النيتروجين السائل. كل جولتين من طحن، إضافة طبقة ضحلة من النيتروجين السائل لطاحونة وتسمح له لتتبخر.
    2. اثارة مع النيتروجين ملعقة المبردة السائلة حسب الحاجة للحفاظ على الخلايا من تراكمها. أخذ الحيطة والحذر لمنع ذوبان الخلايا، مما يؤدي إلى تراكمها الخلية. يجب أن تظهر الخلايا على شكل مسحوق أبيض ناعم التالية تحلل. والحد الأقصى بيليه خلية من 4 لتر من الخميرة (~ 40 ز) يمكن أن يكون الأرض في وقت واحد.
      وتناقش ملاحظات بشأن طريقة تحلل أدناه: ملاحظة.
    3. تقييم درجة تحلل الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو بديل طريقة عد الخلايا. لتوفير تحليل كاف، أخذ العينات التالية: (1) قبل أن تحلل. (2) بعد أربع جولات من تحلل. و (3) بعد تحلل. للتحقق هذه العينات، تأخذ كمية صغيرة من الخلايا التي تحتوي على النيتروجين ملعقة المبردة السائلة ومكان في أنبوب 1.5 مل.
    4. وحالما يتم إذابة الخلايا، ماصة 5 ميكرولتر من الخلاياوتخلط مع 495 ميكرولتر المياه. إذا 40 - لوحظ 60٪ تحلل الخلايا، انتقل إلى الخطوة التالية في البروتوكول.
      وتناقش ملاحظات بشأن تأثير فترات طويلة من تحلل أدناه: ملاحظة.
    5. مرة واحدة لوحظ تحلل الكافي، مخزن هي lysed الخلايا (-80 درجة مئوية) أو الشروع في الخطوة التالية.
    6. إعداد اثنين من 50 مل البولي بروبلين المخروطية أنابيب الطرد المركزي كل منها 15 مل الاحتياطي تحلل، بما في ذلك 1 ملي phenylmethanesulfonyl فلوريد (PMSF)، 1 ملم dithiothreitol (DTT)، ومزيج المتاحة تجاريا من مثبطات الأنزيم البروتيني.
      ملاحظة: إذا لوحظ التحلل البروتيني كبير، والنظر في استخدام سلالة نقص الأنزيم البروتيني.
    7. استخدام النيتروجين السائل ملعقة المبردة لحلج القطن في مسحوق الخلايا هي lysed المجمدة في المعدة 50 مل أنابيب. إضافة مسحوق خلية / الصلبة تدريجيا إلى تحلل العازلة، التي تحتوي على حد سواء اختزال ومثبط البروتياز (ق).
    8. تدوير 50 ​​مل أنابيب بلطف على RT وذلك لذوبان الجليد / حل الخلايا، ولكن أيضا لمنع الفقاعات من تشكيل. اق مسحوق خلية / يذوب الصلبة، إضافة خلية إضافية الصلبة / مسحوق.
    9. شغل كل واحد منهما 50 مل الأنابيب حتى لديها كل ما يقرب من 20 غراما من الخلايا أو جميع الخلايا المضافة. مواصلة ذوبان الجليد / تذويب حتى لا توجد كتل الخلايا المجمدة التي لوحظت في 50 مل أنابيب. وهذا ينبغي أن يستغرق حوالي 50 دقيقة.
    10. الطرد المركزي الخلايا المحللة مع وقف التنفيذ لمدة 20 دقيقة في 25000 x ج (4 درجة مئوية). الخلايا هي lysed جيدا قد يحمل كمية صغيرة من راسب أسود.
    11. نقل 50 مل من طاف لالبولي الأنابيب فائقة الطرد المركزي (26.3 مل أنابيب المستخدمة) وإضافة 10 ميكرولتر 200 ملي PMSF إلى كل أنبوب الكامل.
    12. الطرد المركزي لمدة 1 ساعة على 100000 x ج (4 درجة مئوية). وينبغي أن تكون أربع طبقات واضحة، من أسفل إلى أعلى: (1) بيليه واضح من الصعب، وتحتوي على مجمعات الريباسي. (2) لينة بيليه غنية بالدهون. (3) واضحة طبقة صفراء مشوبة كبيرة تحتوي على أكثر من البروتينات والمجمعات القابلة للذوبان الخلية. و (4) في "وضيع" الطبقة العليا تتكون من الدهون.
    13. أداء جميع الصورةالخطوات التي تبعت في غرفة باردة (4 درجة مئوية). إزالة أكبر قدر من أعلى "وضيع" طبقة الدهون ممكن باستخدام 1 مل الماصة وتجاهل. استخدام 10 الماصة المصلية مل لاسترداد أكثر من الصفراء، طبقة واضحة.
    14. استرداد مل القليلة الماضية من هذه الطبقة باستخدام ماصة 1 مل لتجنب إزعاج أسفل طبقتين. من 40 ز خلية الرطب بيليه، ما يقرب من 48 مل من الطبقة المتوسطة عادة ما تعافى و 8 مل من طبقة الدهون إزالة / التخلص منها.
      ملاحظة: إن ما يعرقل تدفق تنقية العمود إلى حد كبير من وجود الدهون، والتي أيضا قد يقلل من جودة للمجمع، وناقش أدناه.

2. العمود تنقية الخطوة 1: مفتش اللوني

  1. الراتنج موازنة والتجليد
    1. إعداد 300 ميكرولتر مفتش سيفاروز الطين لمدة 40 غرام من بيليه الخلية. قطع نهاية 1 مل طرف الماصة لتسهيل pipetting لالطين. غسل / تتوازن الراتنج مفتش ثلاث مرات، في كل مرة مع 5 مل IgGD150 العازلهص (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 150 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2 و 5 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8؛ 0.1٪ ت / ت NP-40؛ 1 ملم DTT، قرص مثبط البروتياز في 50 حجم مل).
      1. تدور لبيليه في 160 x ج (4 درجة مئوية) بين يغسل وإزالة طاف.
    2. تدوير الراتنج مفتش مع طاف المرحلة المتوسطة واثنين مصغرة أقراص مثبط البروتياز في 40 غرام من الخلايا، وذلك باستخدام المدورة المناسب، لمدة 2 ساعة (4 درجة مئوية). هذا هو الحل دفعة مفتش.
    3. إعداد كل منهما 10 مل الأعمدة بولي الإعدادية للاستخدام عن طريق خفض نهاية العمود لإنتاج قطع مسطح. إلى الإسراع في التعبئة وغسل العمود عن طريق تدفق الجاذبية، تحميل بحد أقصى 200 ميكرولتر من الراتنج مفتش معبأة أو ~ 25 مل من محلول دفعة مفتش لكل 10 مل العمود.
    4. من أجل حل دفعة مفتش في العمود والسماح لالرواسب بفعل الجاذبية. إذا الترسيب وقتا أطول من 30 دقيقة، وهناك على الأرجح كان تلوث الدهون عندما يتعافى المرحلة المتوسطة من ر الطرد المركزيubes.
    5. غسل العمود معبأة مع أربعة متتالية 10 مل حجم IgGD150 العازلة.
  2. على الشق TEV العمود
    1. ختم الجزء السفلي من العمود وإضافة 1 مل من IgGD150 العازلة و 100 ميكرولتر من TEV البروتيني (0.6 ملغ / مل الأسهم، متحولة البديل S219V من TEV المنتجة في المنزل). ختم الجزء العلوي من العمود وتخلط لمدة 20 دقيقة (18 درجة مئوية) باستخدام خلاط الحراري، والهز في 750 دورة في الدقيقة. الراتنج و resuspend وتخلط مرة أخرى لمدة 20 دقيقة، كرر مرة أخرى ليصبح المجموع 1 ساعة الحضانة.
      ملاحظة: ومن الأهمية بمكان الحفاظ على الوقت من الحضانة إلى أدنى حد ممكن.
    2. العودة العمود إلى 4 درجات مئوية، وأزل البروتين / مجمع عن طريق الجاذبية. أزل القتلى حجم مع 200 ميكرولتر إضافية من IgGD150 العازلة.

3. العمود تنقية الخطوة 2: كالمودولين الانجذاب اللوني

  1. الراتنج موازنة والتجليد
    1. إعداد 200 ميكرولتر من راتنج تقارب كالمودولين لكل 40 غراما من خليةبيليه. غسل الراتنج ثلاث مرات، في كل مرة مع 5 مل كالمودولين ملزم العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، ايميدازول 5 ملم، ودرجة الحموضة 8؛ 2 مم CaCl 2؛ 0.1 ٪ ت / ت NP-40؛ 10 ملم β-المركابتويثانول)، الطرد المركزي في 160 x ج (4 درجة مئوية) لتكوير عن كل غسل.
    2. لكل 1 مل مفتش شطافة، إضافة 3 مجلدات من كالمودولين الاحتياطي ملزم. للحفاظ على مستوى الكالسيوم ثابت، إضافة CaCl 2 و β-المركابتويثانول لحساب لعدم وجود هذه المكونات في شطف مفتش. وينبغي أن تكون تركيزات النهائي 2 مم CaCl 2 و 10 ملي β-المركابتويثانول.
    3. إضافة العينة إلى الراتنج كالمودولين وربط لمدة 1 ساعة (4 درجة مئوية) باستخدام محور دوار أنبوب.
  2. التعبئة ويبلغ حجمه من كالمودولين الراتنج
    1. إعداد 2 مل العمود بولي الإعدادية في 100 ميكرولتر الطين كالمودولين بقطع نهاية العمود إلى إنشاء افتتاح شقة. تحميل ما لا يزيد عن 100 ميكرولتر كالمودولين الطين في التعاونlumn لتقليل كمية من الراتنج العينة يأتي في اتصال مع أثناء شطف.
    2. حزمة العمود عن طريق الجاذبية، ويغسل الراتنج في العمود ثلاث مرات مع 5 مل كالمودولين الاحتياطي ملزم.
    3. أزل البروتين مع إضافة 200 ميكرولتر كالمودولين شطف العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2 و 5 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8.0، 4 ملي EGTA، ودرجة الحموضة 8.0، 0.08٪ ضد / ت NP-40؛ 10 ملم β-المركابتويثانول). كرر ست مرات إضافة 200 ميكرولتر من كالمودولين شطف العازلة.
    4. لelutions 1-3، وتطبيق وحدة التخزين إلى عمود وجمع شطافة فورا. لشطف 4، وختم الجزء السفلي من العمود واحتضان مع شطف العازلة لمدة 2.5 دقيقة ثم فضها والسماح لأزل عن طريق الجاذبية. لشطف 5، واحتضان لمدة 5 دقائق ثم فضها وأزل. لشطف 6، واحتضان لمدة 10 دقيقة ثم فضها وأزل.
      ملاحظة: سلامة المجمع قد تختلف بين elutions / كسور (انظر القسم النتائج تمثيلي) <./ لى>
    5. Dialyze elutions 2-6 فردي بين عشية وضحاها باستخدام طريقة الغسيل الكلوي الجزئي المناسب. Dialyze الكسور ضد غسيل الكلى العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، ايميدازول 5 ملم، ودرجة الحموضة 8 و 10 ملي β-المركابتويثانول).
      ملاحظة: NP-40 لا يمر بشكل ملحوظ، على كل حال، من خلال الغشاء غسيل الكلى.

4. تحليلات ما بعد تنقية لتقييم الجودة مجمع

  1. جل الأصلية والفضة تلطيخ
    1. إعداد 4-16٪ الجاهزة هلام الأصلي لتحليل مجمع وفقا لتعليمات من الشركة المصنعة. استخدام الجزيئي معيار الوزن البروتين المناسب وتحميل 15 ميكرولتر من كل من مدال كالمودولين شطف / كسور على هلام.
    2. Electrophorese هلام في 150 V لحوالي 3 ساعات (4 درجة مئوية).
    3. الفضة وصمة عار في هلام لتقييم جودة كل من elutions ستة. بدلا من ذلك، استخدم التجارية حساسة على قدم المساواةوصمة عار فلوري (الصورة). في هذه المرحلة، وتركيز المجمع هو الأكثر احتمالا أقل من مستوى الكشف عن Coomassie تلطيخ الأزرق.
  2. جل إضافية طرق التحليل
    1. للكشف عن البروتين قبل الغرب النشاف، حل تعقيدا SDS أو PAGE الأم ومن ثم تحقيق في جل للحاتمة كالمودولين ملزم الببتيد (CBP) باستخدام الأجسام المضادة العلامة التونسية وفقا لتعليمات من الشركة المصنعة.
    2. باستخدام وصمة الفلورسنت معينة (ق)، وتأكد من وجود وسلامة من البروتين و / أو الحامض النووي في TAP تنقية معقدة. الحرص على أن يتم الكشف عن أي تداخل الطيفي بين هذه البقع.
  3. سلبي التصور وصمة عار المجهر الإلكتروني
    1. استخدام شبكات الكربون مستمرة يتوهج تفريغها في -15 مللي أمبير لمدة 30 ثانية، في غضون 30 دقيقة من تطبيق المعقدة.
    2. تطبيق 3 ميكرولتر من TAP تنقية مجمع (عادة بتركيز 1 نانومتر) إلى الشبكة. احتضان لمدة دقيقة واحدة. وصمة عار وROM جانب الشبكة لإزالة عازلة الزائد.
    3. يغسل مرتين مع 20 قطرات ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. وصمة عار الجانب بين يغسل.
    4. تطبيق الشبكة ل50 ميكرولتر سلبي قطرة وصمة عار واحتضان لدقيقة. ويوصى تلطيخ مع خلات اليورانيل (2٪) أو فورمات اليورانيل (0.75٪).
      تحذير: أملاح اليورانيل والحلول المشعة ضعيفة وتحتوي على المعادن الثقيلة. يجب التعامل مع هذه الرعاية وجميع المواد التي تأتي في اتصال مع ضرورة التخلص من النفايات باتباع المبادئ التوجيهية الموصى بها المؤسسية هذه الحلول.
    5. تطبيق شبكة لالطازجة 50 ميكرولتر انخفاض صمة عار السلبية، دون النشاف. احتضان لدقيقة، ثم وصمة عار الجانب، وأخيرا الهواء الجاف وتصور.
  4. البرد المجهر الإلكتروني (البرد EM) التصور
    1. أداء كرو-EM مع TAP تنقية معقدة، على الرغم الأمثل قد يكون من الضروري، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: وجود المنظفات في ارتفاع تركيزات أماهذ تعيق التقدم، وتتم مناقشته أدناه.

5. تخزين مجمع

  1. إعداد مجمع لتخزين
    1. التركيز على مجمع، إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام فلتر الطرد المركزي وجود الوزن الجزيئي قطع المناسب للمجمع. تدور في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة الزيادات حتى يتم التوصل إلى التركيز المطلوب.
      ملاحظة: سيتم تركيز NP-40 زيادة في التركيز خلال التركيز، لأنها لا تمر عبر فلتر ولا غسيل الكلى غشاء.
    2. تجميد فلاش المجمع في 30 مكل في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف تبريد حمام الإيثانول ثم تخزين في -80 درجة مئوية.
  2. اختياري إزالة ما بعد تنقية منظفات

ملاحظة: وجود المنظفات مثل NP-40 وبتركيز أعلى من أن تركيزه مذيلة حرجة قد تعوق أو تمنع التقدم لبعض التطبيقات. عواقب زواله من بروتووتناقش العقيد وكذلك استبدال مع إضافات أخرى أو شارك في المذيبات أدناه. إذا كان المطلوب لا NP-40، وهو خيار هو استخدام التطبيق التجاري لإزالة، على سبيل المثال بيو الخرز.

  1. قبل تتوازن المتاحة تجاريا المنظفات استيعاب حبات في غسيل الكلى العازلة. مزيج خمس حبات في 30 ميكرولتر من مجمع (عادة في 10 تركيز نانومتر).
  2. احتضان حبات معايرتها من الخطوة 5.2.1 مع TAP مجمع تنقيته لمدة 15 دقيقة على الجليد. استخدام المجمع في غضون ساعات قليلة بعد إزالة المنظفات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد استخدمت طريقة TAP تعديل لتنقية من س. الخباز وU1 snRNP، وهو بروتين نووي ريبوزي مجمع 18 فرعية. لتنقية TAP الأولية للمجمع بعد 2،3 بروتوكول نشر أسفرت مجمع الذي ظهر غير متجانسة، يهاجرون إلى ثلاثة فرق على الفضة الملون هلام بولي أكريلاميد الأصلي (الشكل 2A). جولات متعددة من تعظيم الاستفادة من طريقة TAP، أسفرت عن المجمع الذي هاجر في المقام الأول لفرقة واحدة على هلام الأصلي يدل على تجميع أكثر تجانسا (الشكل 2A)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الطريقة التونسية تستخدم علامات اللذين تحقيق التوازن بين الحاجة إلى ضيق وانتقائية ملزمة لراتنج تقارب مع الرغبة في الحفاظ على قرب شروط حل الفسيولوجية. ويقدم التوازن للحفاظ على التفاعل مستقر (ق) من البروتين ذات الكلمات الدلالية مع التفاعل عامل (ق) لتوصيف ما بعد تنقية. وبالإضافة إلى ذلك، الموسومة TAP الفردية المتاحة من مصدر تجاري ORFS، بحيث يمكن للمرء أن يحصل على أي سلالة الخميرة مع بروتين الموسومة لأي مجمع الخميرة. الحفاظ على سلامة عملية معقدة وتوافر الموارد لاختبار استخدام مختلف وحد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

المؤلفون ممتنون لدعم ونصيحة نيكولاس غريغوريف. نشكر آنا لوفلاند وأكسل بريلوت وتشن شو ومايك ريجني على المناقشات المفيدة وإرشادات EM. تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم ، الجائزة رقم 1157892. يتم دعم مرفق Brandeis EM من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة P01 GM62580.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
S. cerevisiae TAP الموسومة سلالةOpen BiosystemsYSC1177هذه هي سلالة الخميرة الأساسية المستخدمة لتطوير بروتوكول TAP. خلفيته هي S288C: ATCC 201388: MATa ، his3 & Delta ؛ 1 ، leu2 & دلتا. 0 ، met15 & دلتا. 0 ، ura3 & دلتا. 0 ، SNU71 :: TAP:: HIS3MX6
مطحنة القهوةMr. CoffeeIDS77تستخدم لمقياس الدم لتحلل الخلايا
، Bright LineHausser Scientific3120تستخدم لتقييم تحلل الخلايا
JA 9.100 دوار الطرد المركزي   ؛بيكمان كولتر ، إنك.تستخدم لحصاد خلايا الخميرة
JA 20 دوار الطرد المركزي ذو الزاويةالثابتة Beckman Coulter، Inc.تستخدم لمسح مستخلص الخلية من المواد الخلوية غير القابلة للذوبان
Ti 60 دوار الطرد المركزي ذو الزاويةالثابتة Beckman Coulter، Inc.تستخدم لمزيد من مسح مستخلص الخلية القابلة للذوبان
ThermomixerEppendorfR5355شاكر الذي يتم التحكم فيه في درجة الحرارة
نظام هلام NovexThermo Fisher Scientific   ؛
راتنج IgGGE Healthcare17-0969-01Sepharose 6
راتنج كالمودولينالتدفق Agilent Technologies، Inc.214303البروتياز الراتنج Affinity
، أقراص صغيرةSigma Aldrich589297أقراص صغيرة cOmplete فائقة الخالية من EDTA
كوكتيل مثبط البروتياز ، أقراص كبيرةSigma Aldrich5892953cOmplete فائقة الخالية من EDTA
Phenylmethanesulfonyl فلوريد (PMSF) مذابفي الأيزوبروبانول
2 مل عمود Bio-SpinBio-Rad مختبرات ، شركة7326008تستخدم لتعبئة وغسل راتنج Calmodulin
10 مل عمود بولي التحضيرBio-Rad Laboratories، Inc.7311550تستخدم لتعبئة وغسل راتنج IgG
مسبقة الصب الأصلي PAGE Bis-Tris المواد الهلاميةLife TechnologiesBN1002Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16٪ جل بولي أكريلاميد مسبقة الصب
NativeMark معيار البروتينThermo Fisher ScientificLC0725معيار البروتين غير الملوثة المستخدم في PAGE الأصلي. تحميل 7.5 & ل للحصول على جل ملطخ بالفضة و 5 مو ؛ ل للحصول على جل SYPRO Ruby الملون
مسبقة الصب SDS PAGE Bis-Tris هلامLife TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12٪ جل بولي أكريلاميد مسبقة الصب   ؛
معيار بروتين PageRulerThermo Fisher Scientific26614معيار البروتين غير الملوثة المستخدم في النشاف الغربي
SDS تشغيل العازلةLife TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS الجسم المضاد
TAPالحراري فيشر العلميCAB1001الجسم المضاد الأساسي ضد علامة CBP
الجسم المضاد الثانويThermo Fisher Scientific31341الماعز المضادة للأرانب القلوية الفوسفاتيز مترافقة
BCIP / NBTThermo Fisher Scientific340425-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate / nitro blue tetrazolium   ؛
وحدات غسيلThermo Fisher Scientific88401Slide-A-Lyzer وحدات تصفية
الطرد المركزي ، 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Amicon Ultra-0.5 وحدة تصفية الطرد المركزي مع Ultracel-100
غشاء المنظفات الممتصة للحباتBio-Rad Laboratories، Inc.1523920ماصات Bio-bead SM-2
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564صبغة فلورسنت لتلوين الحمض النووي ، عند الكشف عن وجود SYPRO Ruby ، استخدم الطول الموجي للإثارة البالغ 488 نانومتر والطول الموجي للانبعاث 532 نانومتر
SYPRO RubyMolecular ProjectesS-12000صبغة فلورسنت لتلوين البروتين ، عند الكشف مع وجود SYBR Green II ، استخدم الطول الموجي للإثارة البالغ 457 نانومتر والطول الموجي للانبعاث 670 نانومتر
شبكات نحاسيةعلوم المجهر الإلكترونيG400-CP
سريع كوكتيل مثبط الكلى

المراجع

  1. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  2. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  3. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  4. Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
  5. Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
  6. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  7. Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
  8. Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
  9. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  10. Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
  11. Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
  12. Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
  13. Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
  14. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  15. Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
  16. Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
  17. Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

IgG Sepharose TEV SDS PAGE
تنقية مجمعات الأصلية للدراسة الهيكلية باستخدام طريقة العلامة جنبا الى جنب الانجذاب
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.