يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طعم الفحص تفضيل الكبار

9.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54403

⸱

سبتمبر 8, 2016

 , 
1Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine-South Bend

في هذه المقالة

ملخص

الذوق هو عملية حسية مهمة تسهل الانجذاب إلى المواد المفيدة وتجنب المواد السامة. يصف هذا البروتوكول مقايسة ابتلاع بسيطة لتحديد ذبابة الفاكهة التفضيل الذوقي لمركب كيميائي معين.

الملخص

يعد الإدراك الشمي والذوقي للبيئة أمرا حيويا لبقاء. التطبيق الأكثر وضوحا لهذه الحواس الكيميائية هو القدرة على التمييز بين مصادر الغذاء الجيدة ومصادر الغذاء التي يحتمل أن تكون خطرة. يتطلب Gustation الاتصال الجسدي بمركب كيميائي قادر على الإشارة من خلال مستقبلات التذوق التي يتم التعبير عنها على سطح الخلايا العصبية. في الحشرات ، يمكن أن تكون هذه الخلايا العصبية الذوقية موجودة في جميع أنحاء جسم مما يسمح للذوق بلعب دور مهم في العديد من السلوكيات المختلفة. تفضل الحشرات عادة المركبات التي تحتوي على السكريات ، بينما يتم تجنب المركبات التي تعتبر ذات مذاق مر. نظرا للأهمية البيولوجية الأساسية للذوق ، هناك اهتمام شديد بفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الطريقة الحسية. نصف اختبار طعم ذبابة الفاكهة البالغ الذي يعكس تفضيل لمركب تاستانت معين. يمكن تطبيق هذا الاختبار على من أي خلفية وراثية لفحص تفضيل الذوق للمركب القابل للذوبان المطلوب.

المقدمة

الحيوانات تستخدم chemosensation للتمييز الشروط المواتية بصرف النظر عن ظروف الحرمان. هذا التصور يمكن أن تكون حاسمة لأشياء مثل تحديد أفضل المصادر الغذائية، وتجنب المواد السامة أو تحديد أفضل التزاوج شريك 1. وغالبا ما تنقسم Chemosensation إلى عنصرين الحسية: حواس الشم والحواس الذوقية. وهناك سمة مميزة الرئيسية لهذه الحواس هي أن الشم (الرائحة) يستخدم لأخذ عينات من البيئة الكيميائية الغازية المحيطة بينما ذوق حاسة (طعم) يتطلب اتصال جسدي مع الركيزة غير قلق. كلا طرائق الحسية تحفز الاستجابات العصبية التي يتم تجهيزها وفك الشفرة في الدماغ لإنتاج جذابة أو مثير للاشمئزاز السلوك المناسب 2. هذه الحواس هي بالتالي حاسمة لبقاء الحيوان.

ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة هو كائن النموذج الذي لا تزال تنمو في شعبية للاستخدام في فهمجي كيف تنظر الحشرات الشم والذوق. ذبابة الفاكهة توفر مزايا هائلة على النظم نموذج الأخرى نتيجة للثروة من الأدوات الجينية المتاحة للتشريح المسارات الجزيئية الخلوية، والسلوكية. وقد تم العمل على مدى السنوات ال 15 الماضية بشكل خاص دور فعال في تشخيص هويات الخلوية محددة، مستقبلات الخلايا العصبية، ويشير الآليات التي تشارك في كل من الشم والذوق. الآن، يتم استخدام قوة الوراثة ذبابة الفاكهة لزيادة توضيح كيف يتم ترميز هذه العمليات على مستوى الخلايا العصبية واحدة ودائرة واحدة 3-6. وبالتالي، المقايسات التي توفر سجل بسهولة قراءات من التعديلات على مسارات الحسية هي حيوية للتقدم المستمر في هذه المجالات.

في حين أن الكثير معروف حول كيفية إشارات الشم يتم ترميز ومعالجتها في الدماغ، ومن المفهوم أقل بكثير عن آليات مماثلة في مسار الذوقية. نحن هنا وصف بروتوكول والتي يمكن استخدامها للتأكد preferen الذوقم في ذبابة الفاكهة. ذبابة الفاكهة، مثل الثدييات، يفضلون عموما المركبات تذوق الحلو بدلا من المركبات تذوق مرارة. ويمكن استخدام أي مزيج من هذه المصادر الغذائية في هذا التصميم التجريبي لتحديد كيفية تأثير تغيرات جينية معروفة الاختيار الذوق. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بالمثل استراتيجيات التدخل الدوائي يتم تقييم لآثارها على تفضيل طعم الحيوانات. سهولة ومرونة هذا الاختبار يجعلها نموذجا مفيدا لفهم طبيعة الإدراك الذوقي في ذبابة الفاكهة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. المجاعة

  1. إعداد يطير قارورة المجاعة التي تشبع القطن الكرة مع 18.2 MΩ الماء في قاع القارورة الطيران القياسية. بدلا من ذلك، تشبع بالمثل شريط صغير من ورق الترشيح مع 18.2 MΩ المياه ومكان في زاوية داخل القارورة.
  2. جمع الذباب في مجموعات من ~ 100 الحيوانات على وسادة CO 2 ثم قم بإضافة الذباب إلى قارورة المعدة.
    ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج مع الحيوانات التي هي أقل من 5 أيام من العمر. ومع ذلك، فإن العمر الدقيق للحيوانات يمكن التحكم كمتغير تجريبي لتحديد التغيرات في تفضيل طعم مر الزمن.
  3. استخدام القطن الكرة أو رغوة سدادة لتأمين قارورة مغلقة. ضع قارورة الى جانبهم في حاضنة تسيطر بيئة. الحفاظ على درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية، والرطوبة فوق 70٪. ترك قارورة يمسها لمدة 24 ساعة.

2. طعم تفضيل الفحص

  1. إعداد جميع tastants للفحص في نفس اليوم لالصورة الاختبار.
    ملاحظة: tastants الدقيقة لاستخدامها سوف تختلف اعتمادا على مسألة تجريبية يتم طلب. وفيما يلي مثال tastants المستخدمة في هذا البروتوكول. انظر القسم 4 لأمثل.
    1. إعداد مراقبة منبهة للذوق (1 ملم السكروز) من خلال الجمع بين 10 ميكرولتر من 100 ملي حل السكروز، 13 ميكرولتر من تلوين الطعام الأحمر، و977 ميكرولتر من 18.2 MΩ المياه.
    2. إعداد منبهة للذوق التجريبية (5 ملي السكروز) من خلال الجمع بين 50 ميكرولتر من 100 ملي حل السكروز، 10 ميكرولتر من تلوين الطعام الأزرق، و 940 ميكرولتر من 18.2 MΩ المياه.
  2. جعل غرف الفحص باستخدام 100 ملم × 15 ملم طبق بتري البلاستيكية القياسية التي أعدت على النحو التالي:
    1. وضع ثلاث قطرات 10 ميكرولتر من منبهة للذوق تحكم أقرب حافة لوحة عند 12:00 و 3 قطرات أخرى في 06:00. تأكد من أن تباعد بين قطرات مشابه.
    2. وضع ثلاث قطرات 10 ميكرولتر من منبهة للذوق التجريبية أقرب حافة لوحة في 03:00 وقطرات 3 آخرين في 09:00. تأكد من أن تباعد بين قطرات مشابه.
    3. كرر الخطوات من 2.2.1 و 2.2.2 لأكبر عدد ممكن من مكررات كما تريد.
  3. فارغة 1 قنينة من ~ 100 الذباب جوعا على وسادة CO 2 فقط لفترة كافية لتخدير جميع الحيوانات (حوالي 10 ثانية). فرشاة الحيوانات في وسط غرفة فحص المعدة، وتغطي مع غطاء الطبق.
    وينبغي تجنب فترات أطول من التعرض CO 2 إلى تحسين وقت الانتعاش وتدخل حدود مع سلوك التغذية: مذكرة. التعرض للالجليد (~ 5 دقائق) يمكن أن تستخدم لتخدير لتجنب CO 2 الآثار السلوكية التي قد تنشأ من التعرض حتى محدودة.
  4. وضع غرفة فحص في صندوق من الورق المقوى مبهمة. تأكد من تسمية من خارج منطقة الجزاء مع حالة وراثى التي يجري اختبارها.
  5. وضع الإعداد كامل (غرفة الفحص الواردة في صندوق من الورق المقوى من الخطوة 2.4) إلى 25 درجة مئوية مع حاضنة لا يقل عن 70٪ من الرطوبة لمدة 2 ساعة.
  6. كرر الخطوات من 2.3 خلال 2.5 لجميع مكررات.
  7. بعد 2 ساعة، ضع غرف الفحص، لا يزال الواردة في صناديق من الورق المقوى، مباشرة في الثلاجة -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للالكميات.

3. طعم تفضيل الفحص الكمي

  1. السماح لغرفة الفحص واحدة في عملية الاحماء لدرجة حرارة الغرفة (حوالي 5 دقائق).
  2. تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام فرشاة أو زوج من الملقط، حيوانات المجموعة على أساس لون البطن: الأحمر والأزرق والأرجواني أو واضح (الشكل 1).
  3. تسجيل عدد من الحيوانات في كل مجموعة. النظر في الحيوانات واضحة للم تشارك في الفحص وبالتالي لا تدرجها في أي حسابات.
  4. حساب مؤشر الأفضلية وفقا لواحدة من المعادلات التالية:
    1. إذا تم إضافة منبهة للذوق التجريبية التي تهم صبغ أحمر، ثم استخدم (N أحمر + 0.5N الأرجواني) / (N أحمر + N أزرق + N purplه).
    2. إذا تم إضافة منبهة للذوق التجريبية للصبغة زرقاء، ثم ضبط المعادلة (N الأزرق + 0.5N الأرجواني) / (N الأزرق + N أحمر + N الأرجواني).
  5. تكرار العمليات الحسابية لجميع الظروف التجريبية ومكررات.

4. تحسين الذوق الأفضلية الفحص

  1. تحديد تجريبيا تركيز المؤشرات تلوين الطعام ليتم استخدامها حتى تلوين الطعام لا يؤثر على نتائج الفحص طعم، على النحو التالي:
    1. إعداد 4 tastants باستخدام نفس المجمع قاعدة (على سبيل المثال 5 مم السكروز) كما هو مبين في الخطوة 2.1، ولكن حذفت تلوين الطعام.
    2. إضافة 1.3٪ أحمر تلوين الطعام إلى واحدة من tastants. جعل 3 tastants المتبقية مع تلوين الطعام الأزرق من تركيزات مختلفة في كل أنبوب (على سبيل المثال 0.6٪، 1٪، و 1.3٪).
    3. بروتوكول الكامل الخطوات 2.2 خلال 3.4 لكل زوج منبهة للذوق: 1.3٪ مقابل 0.6٪ أحمر أزرق؛ 1.3٪ مقابل 1٪ أحمر أزرق و1.3٪ مقابل 1.3٪ أحمر أزرق.
    4. كرر الخطوة 4.1.1-4.1.3 مع نسب مختلفة من تلوين الطعام الأزرق حتى متوسطات مؤشر تفضيل قيمة 0 (الشكل 2).
      ملاحظة: وكنقطة انطلاق، 1.3٪ تلوين الطعام الأحمر إلى جانب 1٪ أزرق تلوين الطعام عادة تؤدي إلى نتائج جيدة. إذا لم يكن هناك تركيز مرضية من تلوين الطعام الأزرق يمكن أن يقابل 1.3٪ صبغة، ثم خطوة 4.1.1 خلال 4.1.3 يمكن أن تتكرر مع تركيزات مختلفة من اللون الأحمر وتركيز ثابت من تلوين الطعام الأزرق.
    5. تحليل جميع الشروط التي سيتم اختبارها بنفس التراكيز تلوين الطعام الأمثل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأظهرت بعض النتائج نموذجية من المقايسات تفضيل طعم أدناه. في معظم التجارب سوف ينظر بعض الاختلاف في شدة التلوين البطن (الشكل 1). يعتبر أي التلوين في البطن سواء مكثفة أو ضعيفة على ابتلاع إيجابي. ولذلك فمن المستحسن للباحثين ليسجل الحيوانات في حين الطرف عن حالة تجريبية وذلك للحد من أي تحيز محتملة.

ومن المهم أيضا اختيار تركيز الأصباغ الغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصفناها بروتوكول بسيطة لكنها فعالة لتحديد طعم الأفضلية في ذبابة الفاكهة. وتستخدم إصدارات هذا الفحص بشكل روتيني في التجارب لتحديد مساهمات من المستقبلات الذوقية (الموارد الوراثية) إلى إدراك نوعيات مختلفة (المر والحلو والحامض والمالح، وأومامي) من المركبات الذوق. جينوم ذبابة الفاكهة يحتوي على حوالي 60 الجينات التي تشفر 68 مستقبلات الذوقية التي تم تحديدها عن طريق الربط البديل 8،9. ومع ذلك، كما تم أظهرت البروتينات الأخرى مثل مستقبلات الغلوتامات ionotropic وق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نود أن نشكر أعضاء مختبر Tessier على القراءة النقدية لهذه المخطوطة والاقتراحات المفيدة أثناء إعداد هذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تلوين الطعام الأزرق (ماء ، بروبيلين جلايكول ، FD & C أزرق 1 وأحمر 40 ، بروبيل بارابين)ماكورميكN / A
صناديق التبريد / الفريزر بدون فواصلفيشر03-395-455
دومون # 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11251-20
حمض الخليك الجليديفيشرBP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X مجهرW. Nuhsbaum، Inc.10446294
طبق بتري (100 مم × 15 مم)BD Falcon351029قابلة لإعادة الاستخدام إذا تم غسلها وتجفيفها
جيدا Quick-Snap MicrotubesAlkali Scientific Inc.C3017
تلوين الطعام الأحمر (ماء ، بروبيلين جلايكول ، FD & سي ريدز 40 و 3 ، بروبيل بارابين)ماكورميكN / A
السكروزIBIIB37160
العلمية

المراجع

  1. Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
  3. Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
  4. Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
  5. Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
  6. Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
  7. Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042(2013).
  8. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  9. Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
  10. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  11. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  12. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  13. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
  16. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  17. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  18. French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
  19. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقايسة التذوق في ذبابة الفاكهةاختبار تفضيل التذوقتحليل تركيز السكروزقياس كمية ملونات الطعامطريقة التخدير بثاني أكسيد الكربونتجهيز أطباق بتريالتحكم البيئي في الحاضنةتقنية التخزين في المجمدالملاحظة بالمجهر التشريحيتجميع مجموعات ألوان البطن
طعم الفحص تفضيل الكبار
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.