مقالة منهجية

يعاير سلوكيات التغذية المفترسة في

10.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54404

⸱

سبتمبر 4, 2016

 ,  ,  , 
1Department for Evolutionary Biology, Max-Planck Institute for Developmental Biology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

توفر المقايسات السلوكية

أدوات قوية لفهم وظيفة الخلايا العصبية. نقدم هنا العديد من البروتوكولات لقياس سلوك التغذية المفترسة الموجود في نموذج الديدان الخيطية Pristionchus pacificus وأقاربها. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم طرقا لتحليل تكيفات التغذية المفترسة بما في ذلك هياكل الفم والأسنان.

الملخص

يوفر هذا البروتوكول طرقا متعددة لتحليل وقياس سلوكيات التغذية المفترسة في الديدان الخيطية. تظهر العديد من أنواع الديدان الخيطية بما في ذلك Pristionchus pacificus سلوكيات معقدة ، وأكثرها لفتا للانتباه هو افتراس يرقات الديدان الخيطية الأخرى. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه السلوكيات غائبة في الكائن الحي النموذجي Caenorhabditis elegans ، فقد تم وصفها حتى الآن بالتفصيل مؤخرا جنبا إلى جنب مع تطوير فحوصات سلوكية موثوقة 1. تعتمد هذه السلوكيات المفترسة على أشكال الفم البلاستيكية الظاهرية ولكن الثابتة مما يجعل التحديد الصحيح لهذه وتصنيفها أمرا ضروريا. في P. pacificus هناك نوعان من الفم ، الورم الضيق والورم الفغري 2 ، مع وجود الفغر العريض فقط الذي يحتوي على سن إضافي ويكون قادرا على قتل يرقات الديدان الخيطية الأخرى. من خلال عزل وفرة من يرقات الفرائس المتطابقة مع الحجم والتعرض اللاحق للديدان الخيطية المفترسة ، يمكن إجراء فحوصات بما في ذلك كل من "فحوصات الجثة" و "فحوصات العض" على الديدان الخيطية التي تم تحديدها بشكل صحيح. توفر هذه المقايسات وسيلة لتحديد معدلات نجاح الافتراس بسرعة وتوفير تحليل سلوكي مفصل للديدان الخيطية الفردية المشاركة في أنشطة التغذية المفترسة. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام كاميرا عالية السرعة ، من الممكن أيضا تصور التغييرات في نشاط البلعوم بما في ذلك ديناميكيات الأسنان والضخ.

المقدمة

وقد أثبتت الديدان الخيطية مع الجهاز العصبي صغيرة ولكنها معقدة من أدوات قوية لفهم العديد من جوانب علم الأعصاب بما في ذلك السلوك. وقد ركزت معظم هذه البحوث على الكائن الحي نموذج ايليجانس انواع معينة فيها مجموعة كبيرة من السلوكيات مختلفة تم تشريح بنجاح وتحليلها. وتشمل هذه ميكانيكية حسية 3، 4 الكيميائي، منجذب للحرارة 5،6 وmagnetotactic 7 التأثير على التزاوج 8،9، والتعلم 10 و التغذية السلوكيات 11. ومع ذلك، عرض أنواع النيماتودا الأخرى ذات الصلة أكثر بعيدة السلوكيات التي لا تراعى في rhabditid C. ايليجانس أو بدلا من ذلك تظهر مستويات إضافية من التعقيد، مما يثير التساؤلات ذات الصلة بشأن تطور وتنظيمها. أحد الأمثلة على ذلك يمكن ملاحظتها في الديدان الخيطية diplogastrid بعيدة الصلة Pristionchus pacificus، والذي يعرض أكثر تعقيدا التغذية يكونhaviors والإيقاعات من لوحظ في C. ايليجانس 1. هذا على الرغم من النوعين تقاسم الخلايا العصبية البلعوم المتجانسة (12). وبالتزامن مع هذه السلوكيات تغذية إضافية، P. يعرض pacificus أيضا مجموعة والغذائية الموسعة، كما هي الحيوانات المفترسة متعطشا، قادرة على استكمال نظامهم الغذائي البكتيري عن طريق تغذية أيضا على يرقات الديدان الأخرى. لحسن الحظ، P. وقد تم تطوير pacificus كنموذج لعلم الأحياء التطوري المقارن والتكاملي، وبالتالي العديد من الأدوات الجزيئية والجينية متوفرة الآن. وتشمل هذه التسلسل الكامل والمشروح الجينوم 13، الأدوات الجزيئية والجينية بما في ذلك الجينات المحورة 14 و كريسبر / Cas9 15،16 فضلا عن نسالة مفصلة ومشروحة بشكل جيد 17 مع أكثر من 25 نوعا وثيق الصلة بما في ذلك الأنواع شقيقة اكتشف حديثا. بالإضافة إلى ذلك، علم البيئة من العديد من الأنواع Pristionchus بما في ذلك P. pacificus هو أنناوقد تم الآن وصف ليرة لبنانية محددة مع العديد من الأنواع تقاسم جمعية necromenic مع الخنافس الجعل، مضيفة أنهما يشتركان في كثير من الأحيان مع أنواع النيماتودا أخرى 18. ب. بالتالي يوفر pacificus نظام نموذجا ممتازا التي لتشريح تطور السلوكيات الجديدة وأهميتها البيئية.

من أجل تحليل سلوكيات التغذية المفترسة في أنواع النيماتودا مثل P. pacificus وضعنا عدة فحوصات السلوكية جديدة لمراقبة سهلة وتقدير من الإجراءات المفترسة. كما P. يعرض pacificus بنية الفم ديمبرافيك، الأمر الذي يؤثر بشدة سلوك المفترسة، وتحديد نمط شكلي الصحيح ضروري 1،2. يحتوي ضعهن stenostomatous الفم ضيق واحد الأسنان ظهري حادة ولا تشارك في أي تغذية المفترسة. بدلا من ذلك، يتضمن ضعهن eurystomatous الفم واسعة مخلب شكل أكبر من ذلك بكثير الأسنان ظهري ومبلغ إضافي معارضةالأسنان الفرعية بطني، والتي تعمل معا لفتح بكفاءة إهاب من فرائسها. تختلف نسبة eurystomatous المفترسة إلى النموذج stenostomatous غير المفترسة بين الأنواع Pristionchus وأيضا داخل P. pacificus، ومع ذلك، فإن نسبة من الفم eurystomatous تتحول في في P. pacificus البرية نوع سلالة (PS312) هو عادة 70-90٪ 2. بالإضافة إلى ذلك، نسب شكل الفم يمكن أن تتقلب حسب اختلاف التأثيرات البيئية (وكلاهما معروف، بما في ذلك الموت جوعا وبعض جزيء صغير يشير فضلا عن عوامل غير معروفة)، وتحديد بالتالي الصحيح وعزل شكل الفم eurystomatous المفترسة أمر ضروري لفحوصات المفترسة ناجحة.

جنبا إلى جنب مع وصف لشكل الفم المفترسة وضعنا "فحص لدغة" لالملاحظة المباشرة وتقدير من السلوكيات المفترسة بما في ذلك عض، مما أسفر عن مقتل وتغذية الأحداث. هنا يتم عزل النيماتودا فريسة من خلال فلترجي الثقافات تجويع حديثا ويتعرض إلى الكبار المفترسة P. pacificus، الذي لوحظ معا خلال فترة زمنية قصيرة. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وضعنا أيضا عالية الإنتاجية "فحص الجثة" لتسهيل الفحص السريع للسلوك المفترسة من خلال الملاحظة المباشرة للأحداث المفترسة. هذا يستفيد من وجود جثث اليرقات كأداة للكشف عن الافتراس. توفر كل من المقايسات طرق سهلة وقابلة للتكرار للغاية لمراقبة وقياس السلوك المفترسة في أنواع النيماتودا مثل P. pacificus.

البروتوكول

1. الفم شكل Phenotyping

  1. الفم نموذج تحديد على الاغاروز وسادات
    ملاحظة: من أجل تصور نقرأ الفم الخيطية، لشل حركة الديدان مع العلاج مخدر خفيف على منصات الأغاروس ومراقبة على النحو التالي.
    1. النمو والحفاظ على الثقافات الخيطية مثل P. pacificus في 6 سم وسائط النمو الخيطية القياسية (NGM) لوحات وتتغذى على العشب البكتيرية E. القولونية OP50 19.
    2. جعل منصات الأغاروس بإضافة أولا 0،06 ز الاغاروز إلى 3 مل H 2 O في أنبوب 15 مل لجعل الحل الاغاروز 3 مل 2٪. هذا ويمكن تخزينه لمدة تصل إلى سنة في 4 درجات مئوية.
    3. خلط وإذابة الاغاروز تماما في الميكروويف أو بدلا من ذلك استخدام كتلة الحرارة المتوقع أن> 88 درجة مئوية.
    4. مرة واحدة ذابت تماما، إضافة 10 ميكرولتر من 10٪ محلول أزيد الصوديوم إلى الاغاروز وتخلط جيدا. تنبيه: أزيد الصوديوم الجاف هو رد الفعل وجميع أشكال سامة.
    5. باستخدام 1 ملmicropipette، وضع قطرة من ما لا يقل عن 300 ميكرولتر من مزيج أزيد الاغاروز السائل على منتصف شريحة المجهر والزجاج القياسية.
    6. قبل يبرد أجار، بسرعة وضع شريحة المجهر الثانية على رأس قطرة من أجل لشد الاغاروز التي تشكل وسادة على التبريد. كرر العديد من منصات كما هو مطلوب.
    7. فقط قبل استخدامها، وقشر بعيدا الشرائح الزجاجية المجهر من قبل انزلاق لهم قبالة بعضها البعض. ملاحظة: إذا كنت على استعداد منصات الأغاروس بعيدا جدا مقدما أنها يمكن أن تكون مفرطة الجاف وقد تضر الديدان الخيطية.
    8. لنقل الديدان لمنصات الأغاروس مخدر، ضع قطرة من العازلة M9 (2-3 ميكرولتر) على وسط لوحة. اختيار 2-3 الشباب P. الكبار pacificus في قطرة من M9 قبل وضع زلة غطاء بعناية على لوحة. ف. سيتم يجمد الديدان الخيطية pacificus في الاغاروز وعلى استعداد للتصور.
    9. نقل شريحة المجهر يحتوي على دودة تخدير لالمجهر المناسبالثانية مراقبة تحت البصريات 63X Nomarski. تصنيف هويات ضعهن استنادا إلى الميزات التالية: وجود الأسنان الفرعية بطني إضافية، الموسع الأسنان ظهري وفتح الفم واسعة يدل على eurystomatous الحيوان ضعهن الفم، في حين أن وجود الأسنان ظهري واحد وأضيق فتحة الفم يشير إلى stenostomatous حيوان (الشكل 1).
      ملاحظة: من أجل الحفاظ على صحة الحيوان، وينبغي الحفاظ على الديدان على لوحة أجار لمدة لا تتجاوز 5 دقائق.
    10. بعد تحديد ضعهن الفم، واستعادة الديدان الخيطية إما eurystomatous أو stenostomatous على النحو المطلوب عن طريق إزالة انزلاق الغطاء عن طريق تحريك بلطف قبالة منصة الأغاروس. بعناية اختيار الحيوانات اختيار من لوحة الاغاروز (E. القولونية OP50 يمكن استخدامها على اختيار للمساعدة في جعل ذلك لزوجة) على لوحات NGM الطازجة. السماح التعافي من مخدر حتى استأنفت السلوك متحرك عادي عليها الحيوانات جاهزة للمزيد من فحوصات المفترسة.
    2. <لى> السريع الفم Phenotyping
    ملاحظة: بدلا من ذلك، مع المزيد من الخبرة والفم نوع شكل يمكن يعاير دون الحاجة إلى أي علاج التخدير عن طريق مجهر تشريحي مع التكبير عالية (150X).
    1. مكان الديدان الخيطية على لوحات NGM القياسية مع العشب البكتيرية E. القولونية OP50 على مساحة العرض المجهر.
    2. كشف الفروق في حجم الفم والعرض. ملاحظة: في هذا التكبير لا الأسنان مثل الهياكل يمكن ملاحظتها وبالتالي تحديد ضعهن الفم فقط بناء على أفواه واسعة مقابل أفواه الضيقة.

2. لدغة الفحص

ملاحظة: فحوصات عض تسمح تحليل السلوك المفترسة تفصيلا.

  1. النمو والحفاظ على الثقافات الخيطية على لوحات NGM القياسية (6 سم) وتتغذى على العشب البكتيرية E. القولونية OP50 19.
  2. جعل وحات الفحص من خلال زراعة كمية كبيرة من اختيار فريسة الخيطية اليرقات مثل C. ايليجانس أو الternatively فريسة المناسبة ذات الصلة من الناحية البيئية. ملاحظة: الكبار C. ايليجانس تكون كبيرة جدا ليكون فريسة مناسبة لذلك فمن المهم استخدام مرحلة اليرقات.
    1. الحفاظ على C. ايليجانس أو غيرها من أنواع الفرائس المحتملة على لوحات NGM القياسية وتتغذى على العشب البكتيرية E. القولونية OP50 حتى يتم تجويع السكان حديثا، مما أدى إلى وفرة من اليرقات L1 الشباب.
      ملاحظة: حان الوقت لالجوع يعتمد على العوامل البيئية والتجريبية العديدة، بما في ذلك عدد من الديدان الخيطية المستخدمة لبدء الثقافة، وكمية من E. وأضاف القولونية OP50، ودرجة الحرارة المحيطة.
  3. غسل أربعة أو أكثر من لوحات فريسة تجويع حديثا مع M9 وتمرير حل دودة من خلال اثنين من 20 ميكرون مرشحات لإزالة كل الحيوانات الكبيرة وأي البيض المتبقية قبل جمع في أنبوب 15 مل. فقط يجب أن تبقى اليرقات الصغيرة في الحل.
  4. لتشكيل بيليه اليرقات أجهزة الطرد المركزي الفريسة التي تمت تصفيتها في 377 x ج لمدة 1 دقيقة.
  5. ماصة 3 ميكرولتر من بيليه دودة النقي على طبق من ذهب NGM 6 سم مع عدم وجود E. القولونية OP50 الحاضر وانتظر 30 دقيقة على الأقل ليرقات إلى انتشرت بشكل كاف لتوليد لوحة الفحص.
    ملاحظة: 3 ميكرولتر من بيليه دودة النقي على لوحات الفحص القياسية تحتوي على> 3000 فريسة اليرقات. وهذا يكفي لتوليد اتصال دائم بين الحيوانات المفترسة والفرائس.
  6. شاشة النيماتودا المفترسة لضعهن الفم المطلوبة (بروتوكول 1).
  7. باستخدام دودة اختيار التقنيات القياسية ومجهر تشريحي الخفيف 19، ونقل الحيوانات المفترسة سرية بشكل صحيح على لوحة فحص. الحرص على نقل البكتيريا OP50 أقل قدر ممكن على لوحة فحص عند نقل الحيوانات المفترسة من أجل تقليل التلوث الجرثومي. انتظر 15 دقيقة للسماح للدودة للتعافي من الإجهاد من نقله وتحقق من البرية من نوع السلوك متحركة لضمان لم تتعرض للضرر الديدان من نقل.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لتجويع P. باكificus، كما هي الحيوانات المفترسة ذات كفاءة عالية من يرقات الدودة الخيطية أخرى حتى في الوقت الذي يتغذى جيدا على البكتيريا.
  8. بعد الشفاء، ومراقبة الحيوانات المفترسة باستخدام مجهر تشريحي خفيفة لمدة 10 دقيقة. مع هذه المعدات، ومراقبة وتوصيف الأحداث تغذية متميزة مثل عض، والتي تتميز المفترس تقييد حركة الفريسة. القتل، حيث قبل افتتاح يتم الكشف عن بشرة فريسة. والتغذية، مصنفة من قبل الاستهلاك يمكن ملاحظتها من أحشاء فريسة (الشكل 2A، B والسينما 1).
  9. تكرار الفحص عن طريق فحص ومراقبة ما لا يقل عن 10 النيماتودا المفترسة الفردية لضمان دقة.

3. الجثة الفحص

ملاحظة: فحوصات الجثة تيسير كمي أكثر سرعة من السلوك المفترسة.

  1. النمو والحفاظ على الثقافات الخيطية على لوحات NGM القياسية وتتغذى على لتر البكتيريةعون من E. القولونية OP50 19. توليد يثلث لوحات الفحص المذكورة سابقا (بروتوكول 2،1-2،5).
  2. شاشة النيماتودا المفترسة لضعهن الفم المطلوبة كما هو موضح في بروتوكول 1. باستخدام دودة اختيار التقنيات القياسية ونقل مجهر تشريحي ضوء 5 النيماتودا المفترسة مع ضعهن الفم المطلوبة لكل لوحة الفحص. ترك الحيوانات المفترسة مع فريسة لمدة 2 ساعة.
  3. بعد 2 ساعة شاشة لوحة فحص لوجود جثث أفرغت (الشكل 2B و C). تحديد الجثث بسبب غياب الحركة جنبا إلى جنب مع العيوب الشكلية واضحة بما في ذلك تسريب أحشاء أو مفقودة أجزاء الدودة.

4. تحليل بلعومي وحركة الأسنان

  1. النمو والحفاظ على الثقافات الخيطية على لوحات NGM القياسية وتتغذى على العشب البكتيرية E. القولونية OP50 19. توليد وحات الفحص كما ذكر سابقا (بروتوكول 2،1-2،5). إذا القياسية 6 سملوحات NGM لا تناسب بين الهدف والمسرح المجهر، واستخدام غطاء الصغيرة 35 مم أطباق بتري تحتوي على 2 مل NGM كبديل مناسب.
  2. شاشة النيماتودا المفترسة لضعهن الفم المطلوبة كما هو موضح في بروتوكول 1. باستخدام دودة القياسية اختيار التقنيات ومجهر تشريحي خفيفة، ونقل احد المفترس تصنف بشكل صحيح على لوحة فحص. انتظر 15 دقيقة للسماح للدودة للتعافي من الإجهاد من نقله.
  3. مراقبة الحيوانات المفترسة على المجهر في 40 - 63X Normaski، مع كاميرا عالية السرعة (أفلام 2 و 3). سجل البلعوم الضخ وحركة الأسنان أكثر من 15 ثانية، في 50 هرتز في لا يقل عن 20 الحيوانات لضمان تقدير دقيق. سجلت اعادتها الأفلام في السرعة المطلوبة من أجل الاعتماد مضخات الفردية وأحداث الأسنان.
    لوحظ الضخ في الإحضار، وتقع في وسط البلعوم، في حين أن حركة الأسنان هي التي يمكن اكتشافها في فتحة الفم وهو الوحيد المكشوف: مذكرةخدم من الأسنان الظهرية.

النتائج

وبعد تحديد الناجح لضعهن الفم المناسب في P. pacificus، اختلافات واضحة بين الحيوانات eurystomatous وstenostomatous يمكن الكشف عن (الشكل 3) فقط مع الحيوانات eurystomatous الانخراط في قتل السلوك. في الحيوانات stenostomatous يبدو أن هذا السلوك يمكن منعها تماما. وعلاوة على ذلك، فإن الاختلافات في النشاط الأسنان والبلعوم ضخ الحيوانات eurystomatous على البكتيريا وفريسة (الشكل 4 و أفلام 2 و 3) واضح أيضا. في حين التغذية المفترسة، وخفض معدل الضخ أقل من تلك التي لوحظت خلال الكشف عن التغذية البكتيرية وحركة الأسنان في نسبة إلى واحدة مع ضخ البلعوم. هذا ومن المحتمل أن تكون مؤشرا على الآليات التنظيمية الرئيسية تحوير الاستجابة السلوكية لاختلاف النظام الغذائي.

ق / ftp_upload / 54404 / 54404fig1.jpg "/>
الشكل 1. P. pacificus لديه الفم إزدواج الشكل الذي يؤثر في سلوك التغذية. (أ) شكل الفم eurystomatous قادر على الافتراس، ولها فتحة الفم واسعة مع مخلب شكل كبير ظهري الأسنان (كاذبة اللون الأحمر) و (ب) ربط المنافس على شكل الأسنان واسع الفرعية بطني (كاذبة اللون الأزرق). (C) وشكل الفم stenostomatous هو فقط قادرة على تتغذى على البكتيريا، ولها فتحة الفم أضيق مع الصوان على شكل ظهري الأسنان (كاذبة اللون الأحمر) و (D) لا الأسنان الفرعية بطني (*). صور Normaski هي 63X ويمثل شريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-1
الشكل 2. الافتراس فحوصات. (A) P. pacificus يعض ويقتل يرقات الديدان الخيطية أخرى مثل C. ايليجانس. (ب) لفحوصات لاذعة، وعدد من bitesby الحيوانات المفترسة (*) يمكن ملاحظتها باستخدام مجهر تشريحي خفيفة وقتل ناجحة وتغذية الأحداث المسجلة أيضا. الجثث هي أيضا واضحة للعيان (الدوائر). (C) لفحوصات الجثة، أطر اليرقات (الأسهم) ويمكن بسهولة تحديدها مقارنة اليرقات الحية. يمثل مقياس شريط 1 مم في B و 150 ميكرومتر في C. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 3. النتائج من لدغة والجثة فحوصات على C. ايليجانس الجارحة. (A) هو سلوك العض واضحا فقط في شكل الفم eurystomatous مع هذا السلوك لا يتم عرض في الحيوانات stenostomatous. يمثل شريط خطأ الانحراف المعياري من 10 مكررات. (ب) وتزامنا مع أي سلوك العض واضحا من الحيوانات stenostomatous، كما تكشف فحوصات جثة جثث فقط على لوحات فحص الحيوانات eurystomatous. يمثل شريط خطأ الانحراف المعياري من 5 مكررات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
ويلاحظ الشكل 4. Eurystomatous ضخ حركة السعر والأسنان خلال تغذية مفترسة. حركة الأسنان فقط، بينما تشارك الحيوانات eurystomatous في التغذية المفترسة. ويتزامن ذلك أيضا مع انخفاض في ضخ البلعوم. يمثل شريط خطأ الانحراف المعياري من 10 مكررات. أ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الفيلم 1. مراقبة من قتل السلوك لفحص دغة باستخدام مجهر تشريحي الخفيفة. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

figure-results-5
فيلم فيلم الكاميرا 2. عالية السرعة من P. pacificus قتل C. ايليجانس اليرقات. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

إعلان / 54404 / 54404movie3.jpg "/>
فيلم 3. التكبير كاميرا عالية السرعة من حركة الأسنان أثناء الافتراس. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

المناقشة

توفر الديدان الخيطية نظام قوي لفهم بيولوجيا الأعصاب والسلوك مع C. ايليجانس يجري حتى الآن الأداة الرئيسية. ومع ذلك، أنواع النيماتودا عديدة من بينها P. السلوكيات عرض pacificus، والتي هي غائبة أو تختلف في تعقيدات من نموذج حي C. ايليجانس وبالتالي تثير تساؤلات مثيرة حول تطور وتنظيم هذه السلوكيات. واحد مثل هذا السلوك إضافية وجدت في العديد من أنواع الديدان الأخرى بما في ذلك P. pacificus هو القدرة على تكملة نظامهم الغذائي البكتيري من خلال الانخراط في التغذية المفترسة 1، 20. لقد ولذا وضعت ووصف بروتوكول مفصلة لتوصيف السهل والسريع لهذه السلوكيات المفترسة unanalyzed سابقا في الديدان الخيطية.

أولا، قدمنا ​​طرق للكشف عن تغيرات في تغذية الجهاز داخل الفم الخيطية. تحديد نوع الفم الصحيح هو أول أساسيتيب لفحوصات الافتراس ناجحة، على الأقل داخل جنس Pristionchus فقط الحيوانات eurystomatous قادرة على تغذية المفترسة. فمن الأفضل لتحديد الفم تأخذ أشكالا مختلفة مع بروتوكول "السريع phenotyping الفم" وصفت في بروتوكول 1.2 لأن هذا الأسلوب هو أقل الغازية من ذلك بكثير، وبالتالي فإنه من غير المحتمل أن السلوكيات المفترسة قد أقلقت. ومع ذلك، فمن المستحسن أن تصبح أول مألوفة مع هياكل الفم مختلفة من التماهي مع الحيوانات تخدير على منصات أجار (بروتوكول 1.1).

وبعد التعرف على ضعهن الفم المطلوبة، التي وصفناها تحليلين لقياس التغذية المفترسة. هذه هي السريع، وإنتاجية عالية "فحص الجثة" (بروتوكول 3) والمزيد من الوقت طويلا ولكن أكثر تعمقا التحليل السلوكي من خلال "فحص لدغة" (بروتوكول 2). كل من هذه البروتوكولات هي درجة عالية من المرونة مما يسمح لعدة تعديلات من أجل تحسين فحوصات اعتمادا على التجربهمتطلبات التل. لفحوصات دغة باستخدام P. الحيوانات المفترسة pacificus على C. ايليجانس فريسة، وكانت الملاحظات من التفاعلات السلوكية المفترسة لنافذة زمنية من 10 دقيقة كافية لتحديد كمية كبيرة من لدغات جنبا إلى جنب مع الأحداث التغذية الأخرى. ل "فحوصات جثة" مرة أخرى باستخدام P. الحيوانات المفترسة pacificus على C. ايليجانس فريسة، 5 الحيوانات المفترسة لمدة 2 ساعة أنتجت أرقام جثة قابلة للقياس بسهولة ومتسق يتيح للالتحليل السلوكي السريع. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنواع مختلفة من الخطوة النيماتودا المفترسة بسرعات مختلفة، وتناول الطعام بمعدلات مختلفة وعموما يبرهن على وجود تنوع كبير في السلوكيات الأخرى 1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تؤكل أنواع الفرائس المختلفة بمعدلات مختلفة لأسباب مشابهة. لذا فمن المستحسن لتحسين فحوصات استنادا إلى أنواع النيماتودا اختبارها على حد سواء والحيوانات المفترسة والفرائس، وأيضا عن أي اختلافات في الظروف البيئية. خلال كل من "لدغة" و "فيلقه "المقايسات فمن الأهمية بمكان أن كلا فريسة الحيوانات المفترسة ويتمتعون بصحة جيدة، كما أكد أو والحيوانات المفترسة جرح لا تقتل بكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، لوحات فحص جديدة ضرورية لوحات كبار السن يمكن أن تصبح جفت الذي يؤثر سلبا على صحة النيماتودا مما يؤدي إلى خاطئ المقايسات. ومن المأمول أيضا أن التكرار في المستقبل من هذه المقايسات المفترسة سوف تكون قادرة على الاستفادة من التطورات الحديثة في مجال التكنولوجيا من أجل أتمتة الكثير من التحليلات كما تم انجازه لتحقيق العديد من السلوكيات التي لوحظت في C. ايليجانس 21 و 22. وفي الوقت الراهن ومن المحتمل أن تنشأ في الديدان الخيطية مثل P. pacificus المشاكل كما تظهر أكثر حساسية في الاتصال، مما يجعل العزلة والشلل في غرف ميكروفلويديك المرجح أن تلغي التغذية المفترسة. التغلب على هذا قد يكون صعبا ولكن من شأنه أن يسهل الديدان الخيطية الفردية ليتم عرضه للدهاء المفترسة السلوكيات.

وأخيرا، قدمنا ​​أيضا طرق FOص فحص جهاز التغذية الخيطية نفسه تسهيل المقارنات بين أوضاع التغذية المفترسة والبكتيرية عن طريق قياس الأسنان وضخ البلعوم حركية باستخدام كاميرا عالية السرعة (بروتوكول 4). القياس الكمي لمعدلات البلعوم الضخ في C. وقد استخدمت ايليجانس لمراقبة التغذية لسنوات عديدة 23، ومع ذلك، C. ايليجانس تفتقر إلى أي شكل من أشكال سنينة الفم وأيضا تفتقر إلى السلوكيات المفترسة. من خلال الجمع بين تقدير من بلعومي ضخ مع أن النشاط الأسنان، أي تعصيب للأسنان محددة لالافتراس يمكن ملاحظتها أيضا. ويرجع ذلك إلى التكبير المطلوبة لمراقبة حركة الأسنان الحيوانات في كثير من الأحيان الخروج من الطائرة الاتصال، وبالتالي من الممكن عادة فقط لمراقبة الأسنان للنوافذ زمنية قصيرة. بالإضافة إلى ذلك، على عكس C. ايليجانس، البلعوم من P. pacificus لا تضخ بشكل مستمر، بل يشارك في فترات الضخ والتغذية. لذلك، لدقيق الم البلعوممعدلات بينغ في حين تغذية يحدد لاحقا، فمن المهم لتسجيل 15 ثانية من تغذية مستمرة.

وبالتالي، توفر هذه الأساليب المقدمة هنا في الإطار الأول للتحقيق في السلوكيات المفترسة في أنظمة الخيطية. وعلاوة على ذلك، فإنها قد تكون أيضا قابلة للتكيف لاستخدامها في التحقيق في التفاعلات الأخرى داخل النظام الإيكولوجي الخيطية بما في ذلك تأثير الكائنات الحية بالإضافة إلى ذلك ذات الصلة من الناحية البيئية على الافتراس بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة والفطريات والعث . وبالتالي فإنها توفر وسيلة لتشريح كيف يتم تنظيم هذه السلوكيات المفترسة، وكيف أنها قد تطورت وأيضا أهمية البيئية.

الإفصاحات

ولا يعلن المؤلفون عن وجود مصالح مالية أو متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور دانيال بومبارجر على صورة سلوك الافتراس. تم تمويل هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرشحات النايلون الصافية (20 &# 181; م)Merck Millipore LtdNY2004700تستخدم لتصفية الديدان التي تترك اليرقات لاستخدامها كفريسة.
قمع PP للمرشح (54 مم)دوران292215003يستخدم لتصفية الديدان فقط تاركا اليرقات لاستخدامها كفريسة.
طبق بتري صغير (35/10 مم)Greiner Bio-One 627102للتصوير على كاميرا عالية السرعة
Zeiss SteREO Discovery V12لشكل الفم identificaton
Axio-Imager A1لشكل الفم هوية
الشرائح الزجاجيةRothH869
غطاء زلاتروث657
نطاق الحركة M3 كاميرا عالية السرعةIDTكاميرا عالية السرعة
تكبير الفيديو 44 ENG 1/2 "0.5X إلى 2.4XZeis452984-0000-000تكبير الكاميرا عالية السرعة
الديدان الخيطية المتوسطة (NGM) المكونات:
AgarRoth5210.2CAS-Nr. 9002-18-0
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)روث3957CAS-Nr. 7647-14-5
باكتو تريبتونBD211699الكثير 4316614
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>)سيجما ألدريتشC3306CAS-Nr. 10035-04-8
الكوليسترول من اللانولينسيجما ألدريتشF 26732 00050CAS-Nr. 57-88-5
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدرات (MgSO4< / sub>) ميرك1،058،861،000CAS-Nr. 10034-99-8
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH2< / sub>PO4)ACROS organics271080025CAS-Nr. 7778-77-0
طبق بتري 6 سمGreiner Bio-One628102
3.5 سم طبق بتريGreiner Bio-One627102
M9 المكونات:
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH2< / sub>PO4< / sub>)ACROS organics271080025CAS-Nr. 7778-77-0
هيبتاهيدرات فوسفات هيدروجين الصوديوم (NaHPO4< / sub>)سيجما ألدريتشS9390-500G-DCAS-NR. 7782-85-6
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)روث3957CAS-Nr. 7647-14-5
نمو

المراجع

  1. Wilecki, M., Lightfoot, J. W., Susoy, V., Sommer, R. J. Predatory feeding behaviour in Pristionchus nematodes is dependent on phenotypic plasticity and induced by serotonin. J Exp Biol. 218 (Pt 9), 1306-1313 (2015).
  2. Ragsdale, E. J., Muller, M. R., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. A Developmental Switch Coupled to the Evolution of Plasticity Acts through a Sulfatase. Cell. 155 (4), 922-933 (2013).
  3. Goodman, M. B. Mechanosensation. WormBook. , 1-14 (2006).
  4. Rankin, C. H. Nematode behavior: the taste of success, the smell of danger! Curr Biol. 16 (3), R89-R91 (2006).
  5. Beverly, M., Anbil, S., Sengupta, P. Degeneracy and neuromodulation among thermosensory neurons contribute to robust thermosensory behaviors in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 31 (32), 11718-11727 (2011).
  6. Kimata, T., Sasakura, H., Ohnishi, N., Nishio, N., Mori, I. Thermotaxis of C. elegans as a model for temperature perception, neural information processing and neural plasticity. Worm. 1 (1), 31-41 (2012).
  7. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. Elife. 4, (2015).
  8. Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
  9. Sherlekar, A. L., Lints, R. Nematode Tango Milonguero - the C. elegans male's search for the hermaphrodite vulva. Semin Cell Dev Biol. 33, 34-41 (2014).
  10. Sasakura, H., Mori, I. Behavioral plasticity, learning, and memory in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 23 (1), 92-99 (2013).
  11. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  12. Bumbarger, D. J., Riebesell, M., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. System-wide Rewiring Underlies Behavioral Differences in Predatory and Bacterial-Feeding Nematodes. Cell. 152 (1-2), 109-119 (2013).
  13. Dieterich, C., et al. The Pristionchus pacificus genome provides a unique perspective on nematode lifestyle and parasitism. Nature Genetics. 40 (10), 1193-1198 (2008).
  14. Schlager, B., Wang, X. Y., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular Cloning of a Dominant Roller Mutant and Establishment of DNA-Mediated Transformation in the Nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47 (5), 300-304 (2009).
  15. Witte, H., et al. Gene inactivation using the CRISPR/Cas9 system in the nematode Pristionchus pacificus. Dev Genes Evol. 225 (1), 55-62 (2015).
  16. Lo, T. W., et al. Precise and Heritable Genome Editing in Evolutionarily Diverse Nematodes Using TALENs and CRISPR/Cas9 to Engineer Insertions and Deletions. Genetics. 195 (2), 331-348 (2013).
  17. Sommer, R. J., McGaughran, A. The nematode Pristionchus pacificus as a model system for integrative studies in evolutionary biology. Molecular Ecology. 22 (9), 2380-2393 (2013).
  18. Herrmann, M., et al. The nematode Pristionchus pacificus (Nematoda : Diplogastridae) is associated with the oriental beetle Exomala orientalis (Coleoptera:Scarabaeidae) in Japan. Zoological Science. 24 (9), 883-889 (2007).
  19. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
  20. Serobyan, V., Ragsdale, E. J., Sommer, R. J. Adaptive value of a predatory mouth-form in a dimorphic nematode. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 281, 20141334(2014).
  21. Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
  22. Yeminin, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nat Methods. 9 (10), 877-879 (2013).
  23. Raizen, D. M., Lee, R. Y. N., Avery, L. Interacting Genes Required for Pharyngeal Excitation by Motor Neuron MC in Caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (4), 1365-1382 (1995).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Pristionchus pacificus M9 OP50
يعاير سلوكيات التغذية المفترسة في
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.