مقالة منهجية

تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

DOI:

10.3791/54405

⸱

أغسطس 31, 2016

 ,  , 
1Cell and Developmental Biology, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تم وصف تقنية جديدة للكشف عن المستقبلات الداخلية منخفضة الوفرة الموجودة في أجنة الزرد. لقد أطلقنا عليه اسم AFLIP لأنه يتكون من تسمية تقارب للمستقبل بواسطة الترابط المرتبط بالترسيب المناعي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> من خلال الجمع بين قوى Affinity Labeling و Immunoprecipitation (AFLIP) ، تم تنفيذ تقنية للكشف عن المستقبلات منخفضة الوفرة في أجنة أسماك الزرد. تستفيد هذه التقنية من الانتقائية والحساسية التي يمنحها وضع العلامات على التقارب لمستقبل معين بواسطة الترابط الخاص به مع خصوصية الترسيب المناعي. لقد استخدمنا AFLIP للكشف عن مستقبلات TGF-β من النوع الثالث (TGFBR3) ، المعروف أيضا باسم بيتا جليكان ، أثناء التطور المبكر لأسماك الزرد. كان AFLIP مفيدا في التحقق من صحة فعالية النمط الظاهري لأسماك الزرد المتحولة TGFBR3. في الخطوة الأولى ، يتم تحضير مستخلصات بروتين الجنين واستخدامها لتوليد 125مركبا I-TGF-β2-TGFBR3 يتم تنقيتها عن طريق الترسيب المناعي. في وقت لاحق ، يتم ربط هذه المجمعات تساهميا ويتم الكشف عنها باستخدام فصل SDS-PAGE والكشف عن التصوير الشعاعي الذاتي. تتطلب هذه التقنية توافر رابط مصنف وجسم مضاد محدد ضد المستقبل المراد اكتشافه ، ويجب تكييفها بسهولة لتحديد أي عامل نمو أو مستقبل سيتوكين يلبي هذه المتطلبات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مطلوب الكشف المحدد للبروتينات المعبر عنها أثناء التطور الجنيني للتحقق من صحة ملفات تعريف التعبير التي تم الحصول عليها عن طريق قياس mRNAs المماثلة باستخدام RT-PCR أو التهجين في الموقع (ISH). يتم تحقيق ذلك بشكل شائع عن طريق لطخة غربية من مستخلصات الأجنة متبوعة بالكشف عن الأجسام المضادة المحددة. ومع ذلك ، يصعب تطبيق هذا النهج على البروتينات المنخفضة جدا ، أو التي لها خصائص تعيق نقلها الكمي أثناء نشافها. بيتا جليكان ، المعروف أيضا باسم مستقبلات عامل النمو المحول من النوع β الثالث (TGF-β) (TGFBR3) ، هو مثال على هذه الصعوبات. TGFBR3 عبارة عن بروتيوغليكان غشائي بدوام جزئي يربط TGF-β من خلال البروتين الأساسي1 ، مع تقارب أعلى بشكل ملحوظ للشكل الإسوي TGF-β2 ، وهي خاصية تميزه عن أي بروتين آخر ملزم ب TGF-β2. يتم التعبير عن TGFBR3 في أسماك الزرد من 8 حصان f فصاعدا ، ويصل إلى الحد الأقصى بمقدار 72 حصانا ، كما تم اكتشافه بواسطة RT-PCR من mRNA3.

ومع ذلك ، على الرغم من توفر جسم مضادمحدد للغاية 3 ، إلا أن كل محاولة لاكتشاف منتجها المترجم بواسطة اللطخة الغربية أثبتت فشلها. بالنظر إلى أن طبيعة البروتيوغليكان ل TGFBR3 ، بالإضافة إلى الوفرة المنخفضة المفترضة قد تكون مسؤولة عن هذا الفشل ، تم ابتكار طريقة الكشف ، AFLIP ، التي تستفيد من التقارب العالي TGFBR3 ل TGF-β2. في هذه الطريقة ، يسمح لمستخلص البروتين من الأجنة المجمعة بربط 125TGF-β2 المسمى على وجه التحديد ويتم تنقية مجمعات المستقبلات والترابط عن طريق الترسيب المناعي وربطها قبل الفصل بواسطة SDS-PAGE. كشفت أنماط الهجرة التي لوحظت بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي للمواد الهلامية عن وجود وطبيعة أنواع المستقبلات المسماة. يجمع هذا النهج بين خصوصية الترابط لوضع العلامات على التقارب مع الترسيب المناعي بواسطة أجسام مضادة محددة ، مما يزيد من نطاق الكشف ، وتجنب نشاف النقل غير الفعال ل TGFBR3. نظرا لخصائصه المتأصلة ، فإن اختبار AFLIP ليس اختبارا كميا ولكن يمكن استخدامه لقياس الاختلافات التجريبية النسبية في المستقبل الذي تم تحليله بثقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان المعملية واستخدام الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (UNAM)، تحت رقم CICUAL-البروتوكول: FLC40-14. (CICUAL: "COMITE Institucional الفقرة شرم CUIDADO ذ الالتزام بتعميم الخدمات دي لوس Animales دي ابوراتوريو ديل معهد Fisiologìa متنقل، الجامعة الوطنية المستقلة للمكسيك").

1. إعداد استخراج الجنين البروتين

  1. جمع 100-200 الأجنة لكل حالة للمقارنة (morphants مقابل النوع البري) في المرحلة المطلوبة، على سبيل المثال 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF).
  2. مكان الأجنة في أطباق بتري تحتوي على أسماك المياه (انظر الجدول 1) وdechorionate أجنة باستخدام ملقط غرامة الرؤوس يدويا. تجنب استخدام pronase خلال هذه الخطوة (أو أي البروتيني الآخرين في جميع أنحاء بروتوكول) لأنها قد هضم مستقبلات المستهدفة.
  3. مكان الأجنة في أنبوب 1.5 مل microfuge وغسل الأجنة TWالجليد مع حل العازلة 1X الفوسفات (PBS) (انظر الجدول 1).
  4. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة deyolk (انظر الجدول 1).
  5. إطلاق سراح أكثر من صفار قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا (حوالي 30 - 40 مرة) الأجنة في الحل. لمدة 72 HPF و 48 الأجنة HPF استخدام الأزرق والأصفر نصائح ماصة، على التوالي. قد تحتاج إلى خفض قليلا لتجنب تدمير الأجنة نصائح الصفراء. الإفراج صفار ناجحة يمكن التحقق من خلال مراقبة الأجنة تحت المجهر.
  6. جمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 ثانية.
  7. تجاهل طاف بعناية باستخدام الماصة.
  8. غسل الأجنة مرتين مع 500 العازلة غسل ميكرولتر (انظر الجدول 1) قبل vortexing بلطف على أقل سرعة.
  9. جمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 ثانية.
  10. بدءا من هنا، ومواصلة الإجراء في 4 درجات مئوية.
  11. تجاهل طاف بعناية باستخدام الماصة.
  12. الأجنة resuspend في 350 ميكرولتر من تحلل العازلة (انظر الجدول 1) والتجانس باستخدام مدقة البلاستيكية.
  13. احتضان الأجنة هي lysed 30 دقيقة مع التحريض على الكرسي الهزاز أنبوب اختبار في 4 درجات مئوية.
  14. هي lysed الطرد المركزي الأجنة في 11000 x ج لمدة 15 دقيقة من أجل إزالة الحطام غير قابلة للذوبان.
  15. نقل مسح طاف باستخدام الماصة لأنبوب جديد.
  16. تحديد البروتين الكلي من قبل برادفورد البروتين فحص 4، أو غيرها من الإجراءات المناسبة. إذا تم استخدام برادفورد مقايسة، نفذ منحنى المعايرة في وجود تركيزات ما يعادل المنظفات يعرض في المخزن المؤقت تحلل، لأنها تتسبب في التقليل من البروتين القياسية 4.

2. الكشف عن البروتين الذاتية مستقبلات

  1. تقارب وصفها ومناعي (كل هذه الخطوات في 4 درجة مئوية)
    1. ضع 400-500 ميكروغرام من البروتين الكلي الجنين في أنبوب 1.5 مل microfuge وتمييع إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع العازلة 1 (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: من أجل الحصول على 500 ميكروغرام من البروتين الكلي جنين، حوالي 100-200 الأجنة يجب أن تتم معالجتها في البداية. 72 HPF الأجنة تسفر بشكل روتيني ~ 5 ميكروغرام من البروتين الكلي الجنين، وهو ما يكفي لكشف betaglycan.
    2. إضافة إلى حجم ما يكفي من المسمى الأسهم TGF-β2 للوصول إلى تركيز النهائي من 150 م واحتضان مع الإثارة في أنبوب اختبار الروك 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. يجب أن يكون المسمى TGF-β2 قبل بدء AFLIP، مع 125 أنا من طريقة تي الكلورامين كما وصفها Cheifetz وآخرون. 5.
      تنبيه: استخدام وقائية للحد من التعرض أثناء التعامل مع 125 أنا المسمى يجند.
    3. إضافة إلى حجم ما يكفي من الأجسام المضادة غير مخفف ضد مستقبلات الفائدة من أجل التوصل إلى التخفيف 1: 100 وتستمر الحضانة لمدة 2 ساعة أخرى في 4 درجات مئوية (قد تكون حضانة O / N). هذا هو تخفيف الأمثل للمصل رقم 31، وتستخدم في هذه الدراسة، ووصف أماكن أخرى 3، ولكن هذا يتوقف على نوعية علىtibody، قد يكون تخفيف أكبر أو أصغر الأمثل.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من الخرز ملزمة المناعي مناسب (على سبيل المثال، G-البروتين سيفاروز، الذي سبق معايرتها في TNTE ومعلق 1: 5 من حجمه الأصلي في TNTE)، واحتضان لمدة 50 دقيقة مع التحريض على الكرسي الهزاز أنبوب اختبار في 4 درجات C.
    5. استرداد الخرز التي microcentrifugation في 11000 x ج لمدة 20 ثانية.
    6. تجاهل طاف في حاوية القمامة المشعة المناسبة.
    7. غسل حبات IP ثلاث مرات مع 1 مل من غسل العازلة IP (انظر الجدول 1)، قبل vortexing وmicrocentrifugation في 11000 x ج لمدة 20 ثانية في كل مرة.
    8. و resuspend IP-الخرز في 250 ميكرولتر من غسل العازلة IP.
    9. إضافة 1.5 ميكرولتر من disuccinimidyl suberate (مفاجآت صيف دبي، وحلت في DMSO في 10 ملغ / مل). إعداد الحل مفاجآت صيف دبي قبل استخدامه في هذه الخطوة.
    10. احتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الإثارة.
    11. من أجل إخماد رد فعل يشابك، إضافة 500 ميكرولتر سغسل العازلة و IP، على أن تستكمل مع ما يكفي من الأسهم تريس الكلورين ودرجة الحموضة 7.4 لتصل إلى 25 ملي تريس الكلورين. المجموعات الأمينية الحرة في تريس التقاط DSS غير المتفاعل.
    12. أجهزة الطرد المركزي في 11000 x ج لمدة 20 ثانية لجمع IP-الخرز وتجاهل طاف.
    13. و resuspend IP-الخرز في 30 ميكرولتر من الحد عازلة Laemmli.
    14. عينات يغلي مدة 5 دقائق في 94 درجة مئوية.
    15. اختياريا، تحليل العينات في عداد جاما باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة.
  2. تحليل عينة
    1. العينات تخضع لتغيير طبيعة SDS-PAGE. استخدام بولي أكريلاميد في نسبة ملائمة لكتلة المستقبل وتشغيل هلام تحت الإجراء العادي.
    2. تزج جل في حل تثبيتي (انظر الجدول 1) لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. غسل هلام مع المياه المقطرة لمدة 15 دقيقة.
    4. وضع الجل في ورق الترشيح رطب سابقا، وتغطي مع فيلم ساران التفاف.
    5. هلام الجافة في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. فضح الجل على أفلام ا phosphorimager الأبيضأون في RT O / N.
    7. مسح الشاشة يتعرض باستخدام phosphorimager باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1 نتيجة ممثل حصلت مع AFLIP. إشارات في حارة 1 تأتي من 125 I-يجند مرتبطة تساهميا إما إلى الزرد البروتين betaglycan الأساسية (BG الأساسية، تحت علامة كيلو دالتون 150) أو جوهر BG التي تم تجهيزها لشكله بروتيوغليكان عن طريق الحجز من الجليكوسامينوجليكان (GAG، لطخة تتراوح بين 170 كيلو دالتون إلى الجزء العلوي من هلام). هذا النمط من الهجرة، وهو بروتين الأساسية حاد بالإضافة إلى بروتيوغليكان طخت (بسبب عدم التجانس في طول ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام البقع الغربية مع الأجسام المضادة المحددة ضد بروتين من الفائدة هو أداة قيمة لدراسة التعبير عنها 7 خلال مرحلة التطور الجنيني. ومع ذلك، لم يكن immunoblotting من البروتينات عالية الغليكوزيلاتي ناجحة للغاية نظرا لنقلهم عدم الكفاءة وضعف ملزم لالنيتروسليلوز أو PVDF الأغشية 8،9.

البروتيوغليكان هي مثال جيد على هذا القصور، بسبب قيودهم تعلق تساهمي جلايكان (GAG) التي يتم سالبة الشحنة ولا تربط جي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون جيلبرتو موراليس على رعاية الأسماك وصيانتها ، والدكتورين كلوديا ريفيرا وهيكتور مالاغون (مرفق IFC-UNAM للحيوانات) لمساعدتهم في تحصين الأرانب. ودعم هذا العمل بمنح من 131226 المجلس الوطني للاتصالات وبرنامج

الأمم المتحدة لتقديم المساعدة إلى أفغانستان ومنظمة الأمم المتحدة للاتصالات والتنمية في IN204916.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ديسوكسينيمديل سوبيرات (DSS) ThermoFisherScientific21555
Protein G Sepharose 4 Fast FlowGE Healthcare Life Sciences17-0618-01
جل مجفف موديل 583   ؛BIO-RAD1651745
إعصار 9400GE Healthcare LifeSciences 63-0055-78
Cobra II Auto gamma counterPackard
Exposure CassetteDynamicsMolecular 63-0035-44
NaClJT Baker3624
KClJT Baker3040
Na2HPO4JT Baker3828
K2HPO4JT Baker3246
CH3OHJ.T. Baker9070
CH3COOHJ.T. Baker9508
HCHOJ.T. Baker2106
SDSسيجما ألدريتشL4509
EDTAسيجما ألدريتشED
تريتون X-100سيجما ألدريتشT9284
CaCl2< / sub> سيجماألدريتشC3306
NaHCO3< / sub> فيشرScientificS233
PMSFسيجما ألدريتشP7626
كريستال سي مارين ميكسللمشاريع البحرية الدوليةhttp://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
  2. Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
  3. Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
  4. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  5. Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
  6. López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  8. Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).
  9. Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
  10. Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).
  11. Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
  12. Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).
  13. Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).
  14. Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).
  15. Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).
  16. Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TGFBR3SDS PAGE

مقالات ذات صلة