Method Article

الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية

DOI:

10.3791/54416

⸱

August 16th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Neurophysiologie (CP601), ULB Neuroscience Institute (UNI), Université Libre de Bruxelles, 2Medical Molecular Sciences, Centre for Biomolecular Sciences, University of Nottingham, 3School of Life Sciences, University of Nottingham, 4Division of Cancer and Stem Cells, Centre for Biomolecular Sciences, School of Medicine, University of Nottingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نصف طريقة كيميائية مناعية حساسة لرسم خرائط التوزيع المكاني لمشتقات أكسدة 5 مللي متر مكعب بناء على استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع البيروكسيداز وتضخيم إشارة التيراميد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
عادة >jove_content<ما يرتبط مثيلة قواعد السيتوزين (5-ميثيل السيتوزين ، 5 ميثيل سيتوزين ، 5 مللي مكعب) التي تحدث في جينومات الفقاريات بإسكات النسخ. 5-هيدروكسيل ميثيل سيتوزين (5 جم مكعب) ، 5-فورميل سيتوزين (5 فلوريج مكعب) ، و 5-كربوكسيل سيتوزين (5 كاليفورنيا) هي قواعد السيتوزين المعدلة المكتشفة حديثا والتي تنتجها الأكسدة الأنزيمية ل 5 مللي متر مكعب ، والتي تظل وظائفها البيولوجية غامضة نسبيا. تم استخدام عدد من الأساليب التي تتراوح من التقنيات الكيميائية الحيوية إلى التقنيات القائمة على الأجسام المضادة لدراسة التوزيع الجيني والمحتوى العالمي لهذه التعديلات في مختلف الأنظمة البيولوجية. على الرغم من أن بعض هذه الأساليب يمكن أن تكون مفيدة للتقييم الكمي لهذه الأشكال المعدلة ل 5mC ، إلا أن معظم هذه الطرق لا توفر أي معلومات مكانية فيما يتعلق بتوزيع تعديلات الحمض النووي هذه في أنواع الخلايا المختلفة ، المطلوبة للفهم الصحيح لأدوارها الوظيفية. نقدم هنا طريقة حساسة للغاية للكشف الكيميائي المناعي للأشكال المعدلة من السيتوزين. تسمح هذه الطريقة بالكشف المشترك عن هذه العلامات اللاجينية مع علامات سلالة البروتين ويمكن استخدامها لدراسة توطينها النووي ، وبالتالي المساهمة في فك تشفير أدوارها البيولوجية المحتملة في سياقات تجريبية مختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مثيلة من قواعد السيتوزين في الحمض النووي (5mC) يمثل علامة جينية كبيرة وجدت في الجينوم الفقاريات المرتبطة النسخي إسكات 1. ويجري عرض 5mC والتي تحتفظ بها ميثيل الحمض النووي 2-5، وثبت أنها تلعب أدوارا هامة في عدد من العمليات البيولوجية بما في ذلك يطبع الجينومية، تعطيل كروموسوم اكس، والتمايز الخلوي، والتنمية 3 و 6. وبالتالي، فإن اختلال ويرتبط 5mC أنماط الجينومية مع عدد من الأمراض 7، 8-11. على الرغم من التقدم في فهم دور 5mC في التنمية والمرض، فإنه لا تزال مجهولة إلى حد كبير الطريقة التي يتم بها إزالة هذه العلامة في تطوير وأنسجة البالغين. وقد اقترحت عدة آليات محتملة لنزع الميثيل الحمض النووي مؤخرا بما في ذلك آليات الايجابي والسلبي نزع الميثيل 12، 13، 14، 15. ديسكفري لمنتجات 5mC الأكسدة متتابعة بوساطة-1011 النبات انزيماتوفاق (tet1 / 2/3) مثل 5 hydroxylmethylcytosine (5hmC)، 5-formylcytosine (5fC)، و 5 carboxylcytosine (5caC) في حقيقية النواة DNA 16، 17، 18، 19 ودفعت التكهنات عما إذا كانوا قد تكون وسيطة من عمليات نزع الميثيل الحمض النووي أو علامات جينية بمثابة مستقرة في حد ذاتها (13). في حين أن مظاهرة المكون من إصلاح الختان قاعدة، glycosylase الثايمين الحمض النووي (TDG) يمكن ربط وإزالة كل من 5fC و5caC من الحمض النووي 19، 20 يشير إلى وجود دور للمشتقات 5mC تعديل في نزع الميثيل الحمض النووي النشط. الأدلة الأخيرة تبين أن 5fC / 5caC يمكن أن تعدل معدل نقاط processivity RNA الثاني لتورط محتمل من هذه العلامات في تنظيم النسخي 29. ونظرا لهذه الأهمية البيولوجية المحتملة من أشكال المؤكسد من 5mC، وقد تم توظيف مجموعة من التقنيات الحيوية والأجسام المضادة القائمة على دراسة التوزيع الجيني والمحتوى العالمي 16، 19-24.

وبالنظر إلى أن معظم رانه الفقاريات الأجهزة تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا وأن توزيع قواعد السيتوزين المعدلة والأنسجة والخلايا من نوع محدد 16-18، 20، 23، 25-27، وتحديد التوزيع المكاني للمشتقات 5mC أكسدة في الأنسجة المختلفة تصبح مهمة تجريبية مهمة ضرورية لإزاحة الستار عن الوظائف البيولوجية. معظم النهج البيوكيميائية والأجسام المضادة على أساس لا توفر أي معلومات المكانية فيما يتعلق بتوزيع استمارات معدلة من 5mC في الأنسجة المختلفة، وخلية أنواع. في المقابل، يمكن أن تقنيات كيمياء المناعة أساس توفير أداة سريعة لتقييم التوزيع المكاني وتوطين النووية من 5mC 28 ومشتقاتها أكسدة لها 20. وقال إن وذكرت وفرة منخفضة جدا من 5fC (20 في كل 10 6 السيتوزين) و5caC (3 من كل 10 6 السيتوزين) في جينوم الفأر 18 تمثل تحديا كبيرا للكيمياء المناعة القياسية.

هنا،نحن تصف طريقة immunochemical حساسة للغاية التي توفر قوة والكشف السريع عن شكل المؤكسد من السيتوزين في أنسجة المخ لدى الثدييات. من خلال دمج الأجسام المضادة الثانوية البيروكسيديز مترافق إلى جانب خطوة تضخيم الإشارات، وهذه الطريقة تلتف تحديات الكشف عن كميات قليلة جدا من 5fC و5caC. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها للمشاركة في الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين مع علامات محددة النسب، واستكمال فعالية المناهج الأخرى في توضيح الوظائف البيولوجية لهذه علامات جينية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ كافة الإجراءات والتي تشارك الحيوانية وفقا للجامعة نوتنغهام في مجلس المراجعة الأخلاقية.

1. اختيار تحضير الأنسجة مناسبة للالمناعية

  1. توليد قسم جزءا لا يتجزأ من البارافين البرية من نوع الأجنة CD1 الماوس وأنسجة المخ الكبار كما هو موضح سابقا 25. استخدام مقاطع أنسجة المخ ثابتة مع أي 4٪ الفورمالديهايد (FA) أو 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لالمناعية طريقة 25.
    ملاحظة: استخدام البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام الأنسجة تتطلب دي الصبح قبل وضع العلامات الأجسام المضادة. منذ العلاج 2-4 M حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) المستخدمة في بروتوكول لتغيير طبيعة الحمض النووي غير متوافق مع معظم استراتيجيات استرجاع مستضد، من المستحسن استخدام أي من أقسام cryo- أو مشراح للمشاركة في الكشف عن المشتقات الأكسدة 5mC مع البروتين علامات.

2. Dewaxing البارافين أقسام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من < / P>

  1. في خزانة السلامة الطبقة تشغيل الثاني، وغسل البارافين أقسام الأنسجة جزءا لا يتجزأ في جرة Coplin مليئة زيلين، 2 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT.
    ملاحظة: من المهم استخدام زيلين جديدة كما إزالة البارافين غير كاملة يمكن أن يؤدي إلى أنماط تلطيخ غير متناسقة.
  2. بعد نزع الشعر بالشمع، ترطيب بسرعة أقسام الأنسجة عن طريق الغسيل على التوالي في 95 و 75، و 50٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT.

3. التثبيت وPermeabilization من Cryo- وأقسام مشراح

  1. إصلاح أقسام الأنسجة ممهى عن طريق وضعها في أي الجليد الباردة PFA 4٪ أو 4٪ اتحاد كرة القدم لمدة 15 دقيقة في RT.
  2. إزالة تثبيتي الزائد عن طريق غسل المقاطع في برنامج تلفزيوني (الفوسفات عازلة المالحة) لمدة 5 دقائق على RT.
  3. Permeabilize أقسام الأنسجة عن طريق وضع في جرة Coplin مليئة PBX (0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة في RT. إزالة مقسم الزائد عن طريق غسل أقسام قريبا في PBT (0.01٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني).
jove_title "> 4. المناعية لOXI-5mC المشتقات

  1. وضع المقاطع permeabilized في 2 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 60 دقيقة في RT لنزع البورينات من الحمض النووي.
    ملاحظة: على الرغم من أن تركيزات أعلى من حمض الهيدروكلوريك (على سبيل المثال، 4 N) تؤدي إلى تغيير طبيعة الحمض النووي أكثر كفاءة، فهي ليست متوافقة للمشاركة في الكشف عن OXI-MCS مع دابي.
  2. وضع المقاطع في 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.5) لمدة 30 دقيقة في RT لتحييد حمض الهيدروكلوريك. بدلا من ذلك، وغسل أقسام ثلاثة مرات لمدة 5 دقائق كل في برنامج تلفزيوني. احتضان المقاطع في PBT لمدة 5 دقائق على RT.
  3. بعناية إزالة السائل من المنطقة المحيطة قسم الأنسجة من دون السماح للقسم الأنسجة حتى يجف تماما في أي خطوة عن طريق هز بلطف الشريحة. استخدام حاجز القلم مسعور لتطويق القسم دون لمس الباب.
    ملاحظة: الحاجز القلم مسعور يقلل من حجم الأجسام المضادة المطلوبة لصبغ الأنسجة، ويمكن السماح عدة مقاطع لتكون ملطخة مع مختلفاالأجسام المضادة ر على نفس الشريحة.
  4. احتضان المقاطع في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل (ألبومين المصل البقري 10٪ في برنامج تلفزيوني) لمدة 1 ساعة على RT في غرفة رطبة.
    ملاحظة: سوف تخطي هذه الخطوة لا تؤثر على كفاءة تلطيخ قواعد السيتوزين تعديلها.
  5. احتضان أقسام الأنسجة في 100 ميكرولتر من 1: 5000 تخفيف من الماوس وحيدة النسيلة المضادة لل5hmC والتخفيف 1: 1000 من الأجسام المضادة الأولية الأرنب بولكلونل مكافحة 5caC في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة على RT في غرفة رطبة. بدلا من ذلك، نفذ الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: أقسام معالجتها دون الأجسام المضادة الأولية يمكن أن تكون الضوابط سلبية مناسبة لإجراء تلطيخ. الأيام 12.5 وظيفة في أقسام الجنينية في الفئران coitum الدماغ المخصب في 5caC، 5fC و5hmC 20 يمكن استخدامها في مراقبة إيجابية.
  6. إزالة الأجسام المضادة الزائدة عن طريق غسل المقاطع في جرة Coplin مليئة PBT ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل في شرطيجرة لين في RT.
    ملاحظة: يمكن زيادة حجم حلول غسل لحد من تلوين الخلفية.
  7. إزالة PBT الزائد، وإذا لزم الأمر، تطويق أقسام مرة أخرى مع قلم حاجز مسعور كما PBT احتواء المنظفات التي يمكن أن تضعف حاجز مسعور.
  8. جعل التخفيف 1: 400 من الماعز المضادة للأرنب الضد HRP مترافق والتخفيف 1: 400 حمار لمكافحة فأر الضد 555 مترافق في عرقلة الحل.
  9. احتضان أقسام الأنسجة في 100 ميكرولتر من خليط الضد الثانوية من الخطوة 4.9 لمدة 1 ساعة على RT في غرفة رطبة.
  10. غسل أقسام الأنسجة في جرة Coplin مليئة PBT ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل في RT.
  11. وضع المقاطع الأنسجة في 100 ميكرولتر من 1: 200 التخفيف من tyramide في المخزن المؤقت التضخيم إشارة tyramide لمدة 2 دقيقة في RT.
  12. على الفور، وإزالة حل tyramide الزائد عن طريق غسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل من PBT.
  13. متأنذ إزالة PBT الزائد وعلى الفور تغطية الفروع مع قطرة من متوسطة تركيب (انظر قائمة المواد).
  14. وضع بلطف ساترة على أقسام الأنسجة وختم على الفور ساترة مع طلاء الأظافر.
  15. تخزين المقاطع الأنسجة عند 4 درجة مئوية لعدة ساعة قبل الفحص المجهري. فحص تحت المجهر الفلورسنت في 405، 488 و / أو 555 نانومتر (10 - 40X التكبير).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد توزيع 5hmC في أقسام أنسجة المخ، أجرينا شارك في الكشف عن هذا التعديل جينية مع علامة لالخلايا العصبية بعد الإنقسامية، NeuN، وتوظيف التجاري الأجسام المضادة لمكافحة 5hmC التي تتفاعل بشكل خاص مع هذه العلامة ولكن ليس مع أشكال أخرى من تعديل كشفت السيتوزين 20، 25. تحليل المناعى التوزيعات 5hmC و5caC في الدماغ البالغ أنه في حين أن 5hmC تلطيخ بارز شارك في يموضع مع خلايا إيجابية NeuN، الخلايا الدبقية NeuN سلبية تمتلك مستويات أقل من 5hmC الجيني (الشكل 1) 20.

وأظهرت لنا مؤخرا أن تيت التي تعتمد على أكسدة 5mC هي المنطوق خلال مواصفات سلالة من الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) 20. على الرغم من كونها غير قابلة للكشف immunochemically في NSCs، 5fC و5caC يحمل المناعية بارز في المراحل المبكرة من NSCs التمايز نحو العصبية ل الثانية الأنساب الدبقية. كل من هذه العلامات تتراكم عابر بالتزامن مع ظهور علامات العصبية المبكرة والتمايز الدبقية 20. لتحديد توزيع 5caC في التفريق NSCs أجرينا شارك في تلطيخ هذه العلامة مع GFAP علامة الدبقية على الثقافات ثابت من NSCs في 3 أيام من تحريض التمايز الدبقية. خلافا لما حدث في NSCs أو النجمية ناضجة (لا تظهر البيانات)، لاحظنا إشارة 5caC قوية في نسبة كبيرة نسبيا من الخلايا معربا عن GFAP في هذه الثقافات (الشكل 2) 20.

figure-results-1
ويبين الشكل 1. المشارك المناعية من 5hmC (الأخضر) مع NeuN (الحمراء) في الأنسجة الكبار الدماغ Counterstained مع دابي (الأزرق). القنوات الفردية والعرض المدمج. الحانات هي مقياس 25 ميكرون.على بياض "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
يتم عرض الشكل 2. المشارك المناعية من 5caC مع GFAP في ثقافة مجلس الأمن القومي في يوم 3 من الدبقية التمايز. القنوات الفردية والعرض المدمج. الحانات هي مقياس 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من وفرة منخفضة ذكرت المشتقات الأكسدة 5mC، 5fC و5caC في بعض الأنسجة سيقدم قيود كبيرة لبروتوكول كيمياء المناعة القياسية، إدراج الأجسام المضادة الثانوية البيروكسيديز مترافق سمح للكشف عن هذه التعديلات السيتوزين في الأنسجة الثابتة والخلايا (الشكل 2) . ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل فترة حضانة الأمثل مع حل tyramide تجريبيا لكل دفعة الفردية tyramide عدة إشارة التضخيم حيث لوحظ وجود علاقة خطية بين كثافة إشارة ومدة tyramide تضخيم الإشارات أساس، لمزيد من التفاصيل يرجى الرجوع إلى الميدا وآخرون. 2012 26 . وبالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة الإشارة / الخلفية يمكن أن تتعزز بشكل كبير من خلال تنفيذ يغسل في جرة Coplin للسماح إزالة فعالة من الأجسام المضادة الزائدة. وبعد الحضانة مع حل tyramide، من المهم التوقف فورا عن رد فعل عن طريق الغسيل في حل PBT إلى دتلوين الخلفية ecrease. فمن الأهمية بمكان عدم السماح المقاطع لتجف في أي وقت أثناء العملية.

كفاءة نزع البورينات الحمض النووي يمكن تحسينها من خلال تنفيذ رد فعل نزع البورينات عند 37 درجة مئوية. أثناء استخدام 4 N حمض الهيدروكلوريك بدلا من 2 N يعزز تلطيخ أشكال معدلة من 5mC باستخدام 4 N حمض الهيدروكلوريك لنزع البورينات الحمض النووي لن تسمح شارك في تلطيخ مع دابي، كما أنه يتفاعل بشكل حصري مع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل.

على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن توفر قوة التقييم نصف الكمية من أشكال معدلة من قواعد السيتوزين حيث كشفها، فإنه لا يمكن أن تستخدم لتقييم المستويات المطلقة لل5mC أو المشتقات الأكسدة. ولذلك، فإننا نوصي باستخدام البعض مكملة ولكن الكمية النهج 16، 19 -24. منذ اكتشاف المشتقات الأكسدة 5mC في جينوم الثدييات، تم وضع العديد من المداخل لدراسة الأدوار البيولوجية 16، 19-24. ورغم أن هذه approaالشطرنج يمكن أن تكون ذات قيمة في تحديد المستويات المطلقة للمشتقات الأكسدة 5mC، فإنها لا تقدم معلومات بشأن التوزيع المكاني من 20 و 26. وقد استخدمنا بنجاح الطريقة الموصوفة هنا لخريطة التوزيع المكاني وتوطين مشتقات الأكسدة 5mC في أنواع مختلفة من الخلايا من البلدان النامية والكبار الدماغ 20

من خلال الكشف عن التوزيع المكاني 20، يمكن أن هذه التقنية قد تكون حاسمة في فهم الآثار البيولوجية ومصير المشتقات المؤكسد من 5mC في مختلف السياقات البيولوجية حيث يمكن الكشف عن هذه المشتقات معدلة من 5mC بما في ذلك التمايز الخلوي والتنمية والمرض. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للطريقة وصفنا هنا تعطي التقييمات شبه الكمية للمشتقات المؤكسد من 5mC في الأنسجة المختلفة عن طريق تقييم حركية رد فعل البيروكسيديز (والذي يتناسب مع كثافة تلطيخ) في بعض الأحيان حضانة مختلفة مع tyramiدي 26.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر وحدة الفحص المجهري المتقدم (كلية علوم الحياة ، جامعة نوتنغهام) وفريق علم الأنسجة التابع لوحدة العلوم الإنجابية البشرية MRC (إدنبرة) ، ومعهد علم الأعصاب في ULB و FNRS على المساعدة والدعم. وأيدت هذا العمل لجنة الرصد الثوري (MR/L001047/1 إلى A.D.J).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
جرة كوبلينكول بارمرUY-48585-30زجاج مصنوع
من الزيليناستخدم فقط في خزانة الأمان من الفئة الثانية
محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) فيشر12821680 الرقمالهيدروجيني 7.5 ، مفلتر قبل الاستخدام
4٪ بارافورمالدهايد (PFA) سيجماألدريتشP6148بمجرد صنعه يمكن تخزينه عند -20 درجة ؛ C في aliquotes لعدة أشهر
4٪ الفورمالديهايد  (FA)سيجما ألدريتشF8775بمجرد صنعه يمكن تخزينه في -20 درجة ؛ C في aliquotes لعدة أشهر
الإيثانول ، اللامائي المشوه ، الصف النسيجيSigma Aldrich64-17-595 ، 75 ، 50٪ في PBS
0.01٪ Tween 20 في PBSSigma AldrichP9416PBT
0.5٪ Triton X-100 في PBSSigmaAldrich X100PBX
2 N HClSigma Aldrich71826تحذير شديد السمية
100 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك & nbsp ؛PromegaH5121الرقم الهيدروجيني المعدل إلى 8.5
قلم حاجز كاره للماءAbcamab2601للكيمياء المناعية
غرفة الرطوبة المنزلقةمختبر الجهاز العلمي197-BL
المضاد للجسم المضاد للفأر 5mCDiagenodeC15200081الجسم المضاد الأولي أحادي النسيلة
المضاد للجسم المضاد 5hmCالنشط الحافز39791الأرنب متعدد النسيلة الجسم المضاد الأولي
المضاد للجسم المضاد 5caCالنشط الحافز61225الأرانب متعدد النسيلة الجسم المضاد الأولي
بيروكسيداز مترافق المضاد للأرانب الأجسام المضادة المضادةداكوK1497
555 الماعز المضاد للجسم المضاد للفأرالمجسات الجزيئيةA-11005  ؛ الأجسام المضادة الثانوية
10٪ BSASigma AldrichA9418محلول حجب
22 × 32 مم زلات غطاء زجاجيBDH406/0188/24
نظام تضخيم إشارة التيراميدPerkin ElmerNEL741001KTاستخدام الأجسام المضادة الثانية المترافقة بالفلوروكوم الأخرى للكشف المشترك عن oxi-5mC & nbsp ؛
  تركيب وسط مع DAPIVector LabsH-1200
طلاء
دجاج متعدد النسيلة مضاد GFAP الأجسام المضادة متعددة النسيلةالحرارية العلميةPA5-185981:400 التخفيف
المضاد للفأر أحادي النسيلةMAB377B:400 التخفيف
متعدد النسيلة يمكن أظافر عديم اللون 1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).">Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
  2. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).">Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
  3. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).">Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
  4. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).">Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
  5. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).">Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
  6. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).">Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
  7. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).">Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  8. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).">Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
  9. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).">Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
  10. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).">Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
  11. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).">Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
  12. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).">Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
  13. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).">Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
  14. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).">Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
  15. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).">Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
  16. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).">Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
  17. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).">Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  18. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).">Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
  19. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).">He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
  20. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).">Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
  21. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).">Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
  22. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).">Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
  23. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367(2010).">Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367(2010).
  24. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181(2010).">Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181(2010).
  25. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).">Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
  26. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).">Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
  27. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905(2013).">Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905(2013).
  28. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).">Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
  29. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).">Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modified Cytosine DetectionImmunohistochemistry ProtocolTyramide Signal Amplification5hmC 5caC AnalysisDNA Methylation StudyEpigenetic Mark DetectionNuclear Localization AnalysisCo detection With MarkersTissue Section ProcessingConfocal Imaging Application

Related Articles