يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

8.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54421

⸱

سبتمبر 18, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> في نموذج التهاب القولون الذي يحركه المستضد ، تم نقل خلايا OT-II CD4 + T التي تعبر عن بروتين فلوري أحمر بالتبني إلى فئران RAG - / - التي تعبر عن بروتين فلوري أخضر في الخلايا البلعمية أحادية النواة (MPS). واجه المضيفون تحديا مع الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية) التي تعبر عن بروتين البيضاوي (OVA) المدمجة في بروتين فلوري سماوي (CFP).

الملخص

مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو التهاب مزمن يصيب الجهاز الهضمي (GIT). واحدة من أفضل الطرق لدراسة الآليات المناعية المتضمنة أثناء المرض هي نموذج نقل الخلايا التائية لالتهاب القولون. في هذا النموذج ، يتم إعادة تكوين الفئران التي تعاني من نقص المناعة (متلقي RAG - /- ) بخلايا CD4 + T الساذجة من مضيفين من النوع البري الأصحاء.

يسمح هذا النموذج بفحص الأحداث المناعية المبكرة التي تؤدي إلى المرض والالتهاب المزمن ، عندما يستمر التهاب الأمعاء ولكنه لا يعتمد على مستضد محدد. لدراسة الدور المحتمل للخلايا العارضة للمستضد (APCs) في عملية المرض ، من المفيد أن يكون لديك نموذج مرض يحركه المستضد ، حيث يؤدي مستضد محدد مشتق من المستضد إلى التهاب القولون. ومن ثم تم تطوير نموذج التهاب القولون المدفوع بالمستضد. في هذا النموذج OT-II CD4 + الخلايا التائية ، التي يمكنها التعرف على حواتم محددة فقط في بروتين OVA ، يتم نقلها إلى مضيفات RAG - / - التي تواجه تحديا مع CFP-OVA التي تعبر عن الإشريكية القولونية. يسمح هذا النموذج بفحص التفاعلات بين APCs والخلايا التائية في الصفيحة الخاصة.

المقدمة

الأمعاء هو أكبر سطح الجسم الذي يتعرض للبيئة الخارجية. واسعة ومتنوعة من الميكروبات المقيمين استعمار أمعاء الإنسان لتشكيل الجراثيم المعوية (أو البكتيريا). ويقدر هذا ليصل قوامها إلى 100 ​​تريليون خلية الميكروبية ويشكل واحدا من الموائل البكتيرية الأكثر اكتظاظا بالسكان المعروف في علم الأحياء 1-3. في الجهاز الهضمي البكتيريا استعمار كوة المعوية حيث البقاء على قيد الحياة والتكاثر 4. وفي المقابل، فإن الجراثيم يمنح المضيف مع ميزات وظيفية إضافية غير المشفرة على الجينوم 1. على سبيل المثال الجراثيم يحفز تكاثر الخلايا الظهارية، وتنتج الفيتامينات التي تستضيف لا يمكن ان تنتج من تلقاء نفسها، وينظم عملية الأيض، ويحمي ضد مسببات الأمراض 4-6. ونظرا لهذا علاقة مفيدة، وقد اقترح بعض الكتاب أن البشر هم "فائقة الكائنات" أو "holobionts" التي هي مزيج من البكتيريا والإنسان جينات 7،8. وبالنظر إلى التأثير الإيجابي للالجراثيم على (الإنسان) المضيف، يحتاج نظام المناعة المعوية على تحمل الميكروبات المتعايشة لتمكين وجودها في لمعة ولكن أيضا قتل مسببات الأمراض التي تغزو من الجانب اللمعية 9-11. وقد وضعت جهاز المناعة المعوية آليات للتمييز بين الميكروبات اللمعية غير ضارة ويمكن أن تكون ضارة. لكن هذه الآليات ليست جيدا حتى الآن فهم 12. المحافظة على سلامة الأمعاء يتطلب توازن المناعة ينظم بإحكام للحفاظ على التوازن بين التسامح والحصانة 13. خلل في توازن المناعة يساهم في تحريض الأمراض المعوية مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) 3،14.

هناك نوعان رئيسيان من مرض التهاب الأمعاء: مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC). المرضى الذين يعانون من هذه الأمراض عادة تعاني من نزيف المستقيم، والإسهال الشديد وآلام في البطن 15،16. لسبب واحد من IBD لا يزالغير معروف، ولكن مجموعة من العوامل الوراثية والتأثيرات البيئية والاستجابات المناعية dysregulated قد يكون الحدث الرئيسي لتطور المرض 15.

وقد استخدمت النماذج الحيوانية للمرض التهاب الأمعاء لأكثر من 50 عاما. في العقود القليلة الماضية تم تطوير أنظمة نموذج IBD جديدة لاختبار مختلف الفرضيات عن التسبب في مرض التهاب الأمعاء 17،18. نموذج أفضل وصف لالتهاب القولون المزمن هو نموذج نقل T-الخلية التي يدفع اختلال التوازن تي خلية 19،20. ويتضمن هذا النموذج نقل خلايا T ساذجة من الفئران مناعيا في مضيفين التي تفتقر إلى T والخلايا البائية (مثل الفريق الاستشاري - / - والفئران SCID) 16،21. تتم مراقبة تطور المرض في هذا النموذج ل3-10 أسابيع من خلال تقييم وجود الإسهال، وانخفاض النشاط البدني، وفقدان وزن الجسم. وهذا ما يسمى متلازمة الهزال 16. بالمقارنة مع الفئران صحي في انسجة القولون الجنود المزروعة هي thicke لص، وأقصر وأثقل 16. عن طريق نقل الخلايا نموذج T، فمن الممكن أن نفهم كيف تختلف T السكان الخلية يمكن أن تسهم في التسبب في مرض التهاب الأمعاء 22. نقل خلية نموذج T لا تحليل التفاعلات بين ناقلات الجنود المدرعة وخلايا T في عملية المرض بطريقة مستضد معين. وقد تبين أن التفاعل بين خلايا الدم النخاعي والخلايا اللمفاوية يمكن أن يكون مسؤولا عن تطوير التهاب الأمعاء 23. وعلى الرغم من توضيح جوانب عديدة من مرض التهاب الأمعاء، والأحداث الأولية التي تؤدي إلى تطور المرض لا تزال بحاجة إلى أن تفهم بوضوح.

وقد تبين أنه في حالة عدم وجود نقل الجراثيم التهاب القولون لا يمكن تأسيس 24. في الآونة الأخيرة، العديد من النظريات تشير إلى أن مرض التهاب الأمعاء يمكن أن يكون نتيجة لاستجابة مناعية ضد البكتيريا المتعايشة 25. وقد اقترح المؤلفان أيضا أن البكتيريا المتعايشة ضرورية للحث على التهاب في الأمعاء القاصي26. وفي الجرثومية مجانية (GF) الحيوانات ويضعف الجهاز المناعي المعوي عموما 27،28، ولكن الاستعمار من هذه الفئران مع خليط من خالية محددة الممرض البكتيريا النتائج في تطوير نظام المناعة في الأمعاء، كامل الأهلية 29. وبالتالي، فإن الجراثيم ويبدو أن عنصرا رئيسيا في التسبب في مرض التهاب الأمعاء، إما على شكل الآلية التي يهيئ لأو يحمي من تطور التهاب الأمعاء 30،31. وتشير النظريات الحالية التي IBD هو نتيجة لعدم التوازن الميكروبي، ودعا dysbiosis، في المرضى الذين يعانون راثيا 32، ولكن ليس من الواضح بعد ما اذا كان dysbiosis هو سبب أو نتيجة للمرض 12. النظر في دور الكائنات الدقيقة في تطوير مرض التهاب الأمعاء، في التجارب المختبرية أظهرت أن خلايا CD4 + T يمكن تفعيلها من خلال ناقلات الجنود المدرعة نابض مع البكتيريا المعوية 33،34.

وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن المستضدات منمختلفة الأنواع البكتيرية المتعايشة، مثل E. القولونية، باكتيرويديز، الجرثمة والمتقلبة، قادرة على تنشيط خلايا CD4 + T 35. هذا يدل على أن تقديم المضادات البكتيرية إلى T الخلايا من أهمية لتطوير مرض التهاب الأمعاء. للحد من تعقيد مستضدات متعددة مشتقة من النباتات الدقيقة في عملية المرض، تم إنشاء سلالة القولونية التي تنتج المستضد OVA. وكان المستحث نقل التهاب القولون عن طريق حقن خلايا T OVA محددة إلى الفريق الاستشاري - / - الحيوانات المستعمر مع، معربا عن OVA E. القولونية.

ويستند هذا النموذج على أدلة حديثة تشير إلى أن CX 3 CR1 + النواب، مجموعة فرعية الخلايا الرئيسية في الصفيحة المخصوصة القولون (CLP) 36، تتفاعل مع خلايا CD4 + T خلال نقل التهاب القولون 37. نواب عينة لمعة الأمعاء للمستضد الجسيمات، مثل البكتيريا، وذلك باستخدام التشعبات 36، 38،39. الدراسات السابقةأثبتت أن النواب ويمكن أيضا تناول المضادات القابلة للذوبان، مثل البيض، وإدخالها في الامعاء التجويف 40،41. وبالنظر إلى وفرة من CX 3 CR1 + النواب في قانون ممارسة مهنة المحاماة، فمن الممكن أن هذه الخلايا يمكن أخذ عينات البكتيريا اللمعية وتتفاعل مع خلايا CD4 T. التصوير متحد البؤر من الفئران زرعها مع خلايا CD4 + T-OVA محددة المستعمر مع E. القولونية CFP-OVA، وتبين أن CX 3 CR1 + النواب على اتصال مع خلية OT-II CD4 + T خلال تطوير التهاب القولون يحركها المستضد. يتيح هذا النموذج دراسة عملية تقديم المستضد بين ناقلات الجنود المدرعة المعوية وخلايا T معينة فقط لبعينها البكتيريا، معربا عن مستضد في لمعة الأمعاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

كانت ولدت الفئران وأبقى تحت (SPF) شروط معينة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوان من جامعة أولم (أولم، ألمانيا). وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للمبادئ التوجيهية للاستخدام الحيواني المحلي ولجنة الرعاية وقانون رعاية الحيوان الوطنية.

1. بناء على pCFP-OVA البلازميد

  1. تضخيم الكامل الجينات حجم البويضات باستخدام بادئات Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') وOva_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 استخدام البلازميد PCI-OVA (الأمبيسلين مقاومة) 42 كقالب. استنساخ منتج PCR (أي تسلسل الترميز OVA) إلى فج منتصف ناقلات المتاحة تجاريا باستخدام SpeI وCLAI القيود مواقع الاشعال وناقلات لتحقق محدد OVA-البلازميد.
  2. تضخيم الجين CFP الترميز جنبا إلى جنب مع المروج التأسيسية قوي ف فرط استخدام البلازميد الوسادة 1 -cCFP (الكلورامفينيكول مقاومة) 43 كقالب والاشعال CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') وCFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. استنساخ الجين CFP الترميز في OVA-البلازميد محددة (مقاومة الأمبيسلين) باستخدام تقييد مواقع SpeI وساسي من الاشعال وناقلات 37. هذا يقدم فاصل من 6 بقايا الجلايسين بين CFP الترميز من OVA الترميز تسلسل.

2. بناء القولونية pCFP-OVA

  1. تنمو القولونية سلالة DH10B في 100 مل من لوريا Bertani (LB) المتوسطة هوائيا عند 37 درجة مئوية على شاكر دوارة بين عشية وضحاها.
  2. مزيج 800 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية مع 200 ميكرولتر من الجلسرين لخلق الأسهم الجلسرين ومخزن في -80 درجة مئوية.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من القولونية سلالة DH10B من المخزون الجلسرين في 5 مل من LB المتوسطة وزراعتها هوائيا عند 37 درجة مئوية على الامد شاكر دوارةrnight.
  4. نقل الثقافة في حيرة قارورة 1 لتر مخروطي مع 250 مل من LB المتوسطة عند 37 درجة مئوية في هزة الدوار.
  5. تنمو البكتيريا إلى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) 0.5 ثم هدئ الثقافة على الجليد لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. بكتيريا و resuspend مع 100 مل من الجليد الباردة العقيمة H 2 O وأجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 البكتيريا درجة مئوية و resuspend مع 100 مل من الجليد الباردة 10٪ الجلسرين وأجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة الأخيرة مرتين.
  7. بعد الخطوة غسل النهائي، و resuspend البكتيريا في 700 ميكرولتر من 10٪ الجلسرين. تجميد 50 مكل في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
  8. ذوبان الجليد قسامة 50 ميكرولتر على الجليد ونقل إلى كوفيت Electroporation للما قبل المبردة (2 مم الكهربائي عن بعد).
  9. إضافة 5 ميكرولتر من البلازميد (100 نانوغرام) إلى 50 ميكرولتر E. القولونية أليكوالخبر. أداء Electroporation للمع نبضة واحدة في 25 μF، 200 أوم (Ω) و 2.5 كيلو فولت.
  10. البكتيريا resuspend في 1 مل قبل تحسنت SOC المتوسط ​​(5 جرام / لتر خلاصة الخميرة، 2 غرام / لتر تريبتون، 10 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي كلوريد المغنيسيوم، و 10 ملي كبريتات المغنيسيوم) واحتضان عند 37 درجة مئوية هوائيا لمدة 1 ساعة.
  11. البكتيريا لوحة على لوحات LB-أجار تستكمل مع الأمبيسلين 100 ميكروغرام / مل (إضافة 100 ميكرولتر من 100 ملغ / مل الأسهم الأمبيسلين إلى 100 مل من LB أجار)، واحتضان بين عشية وضحاها هوائيا عند 37 درجة مئوية.
  12. اختيار المستعمرات واحد وإعادة متتالية، منها في لوحات LB-أجار تستكمل مع الأمبيسلين 100 ميكروغرام / مل. احتضان بين عشية وضحاها هوائيا عند 37 درجة مئوية.
  13. اختيار المستعمرات واحد وتنمو عليها بين عشية وضحاها في 10 مل من وسائل الاعلام LB تستكمل مع الأمبيسلين 100 ميكروغرام / مل لعزل البلازميد. استخدام المتاحة تجاريا البلازميد صغيرة عدة الإعدادية وأزل DNA البلازميد مع 30 درهم ميكرولتر 2 O (الماء المقطر) وفقا لالصانع؛ ق البروتوكول. تحقق من البلازميدات عن طريق تحليل تقييد و37،42،43 تسلسل الحمض النووي.
  14. إنشاء ثقافة من الحيوانات المستنسخة إيجابية من E. القولونية pCFP-OVA في 100 مل من LB المتوسطة تستكمل مع الأمبيسلين 100 ميكروغرام / مل. تنمو هوائيا عند 37 درجة مئوية على ليلة وضحاها شاكر دوارة.
  15. مزيج 800 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية مع 200 ميكرولتر من الجلسرين النقي ومخزن في -80 درجة مئوية.
  16. أجهزة الطرد المركزي لبقية الثقافة بين عشية وضحاها في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) و resuspend بيليه في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ضع 10 ميكرولتر من تعليق على شريحة زجاجية، وتغطي مع ساترة.
  17. مراقبة العينات في المجهر مضان القياسية لتأكيد مضان تعبير عن CFP-OVA (CFP الإثارة في 450 نانومتر، والانبعاثات في 480 نانومتر). تحليل البكتيريا تبدأ مع التكبير 400X.
  18. الطرد المركزي 1 مل من البكتيريا من الثقافات بين عشية وضحاها في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة، RT. Resuspend وبيليه في 40 ميكرولتر منبرنامج تلفزيوني ويغلي عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  19. الطرد المركزي العينات في 30000 x ج لمدة 10 دقيقة واستخدام supernatants للتحليل لطخة غربية 37. استخدام مكافحة OVA بولكلونل الأجسام المضادة التي أثيرت أرنب المخفف 1: 400.

3. الجيل من OT-II / الفئران الأحمر

  1. عبور ذكر / أنثى الفأر OT-II مع الإناث / الذكور الماوس التعبير عن بروتين أحمر فلوري (على حد سواء سلالات متوفر تجاريا) من أجل توليد الفئران OT-II / الأحمر 37.

4. الطحال عزل الخلايا

  1. الموت ببطء OT-II / الفئران الأحمر خلع عنق الرحم بعد التخدير عن طريق الاستنشاق من أي الأثير المهلجنة (تصل إلى 5٪ لتحريض) متاحة تجاريا.
  2. استخدام مقص لقطع جزء من البطن متفوقة الأيسر للفأرة. تحت هذا الجزء البطني هناك الطحال (بيضاوية الشكل مع اللون الداكن والأحمر). استخدام المقص والملقط لحذفها.
    1. استخراج الطحال من OT-II / الفئران الحمراء وتمريرها من خلال 100ميكرومتر مصفاة الخلية موضوعة على أنبوب 50 مل باستخدام المكبس من حقنة 1 مل من أجل الحصول على تعليق وحيد الخلية. غسل مصفاة مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS).
  3. الطرد المركزي تعليق خلية في 390 x ج لمدة 5 دقائق على RT. Resuspend وبيليه مع 5 مل من العازلة قبل تحسنت تحلل (144 ملي NH 4 CL، 17 ملي تريس، ودرجة الحموضة = 7.2) إلى ليز خلايا الدم الحمراء. احتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. غسل العينة مع 25 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ FBS. أجهزة الطرد المركزي في 390 x ج لمدة 5 دقائق على RT. Resuspend وبيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ FBS.
  5. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل التريبان الأزرق. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
    1. تملأ الغرفة عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من الخلايا الملون. عدد الخلايا تحت المجهر في أربعة 1 × 1 مم 2 الساحات من غرفة واحدة وdeterminالبريد متوسط ​​عدد الخلايا لكل متر مربع. تظهر خلايا قابلة للحياة البيضاء والخلايا الميتة تظهر زرقاء. لتحديد عدد الخلايا / مل مضاعفة عدد الخلايا التي كتبها عامل التخفيف. إذا كان يتم عد 2-4 الأرباع، القسمة على عدد من الأرباع.

5. CD4 + CD62 L + T إثراء خلية

  1. نمي خلايا الطحال للخلايا CD4 + CD62L + T عن طريق عدة العزلة المغناطيسية باستخدام مبادئ اختيار سلبية أو إيجابية. هنا، استخدم اختيار السلبية لعزل خلايا CD4 + T واستخدام انتقاء إيجابي لإثراء لCD62L + السكان داخل تجمع خلايا CD4 + T.
    ملاحظة: في إجراءات الاختيار السلبي، والخلايا، والتي سيتم يست معزولة: وصفت مع الأجسام المضادة المحددة إلى جانب ميكروبيدات المغناطيسية (هنا كل خلايا CD4 السلبية). خلال الخطوات غسل العمود خلايا CD4 + T سوف تمر من خلال العمود بحيث أنها يمكن أن تكون EASIجمعت لاي. في الخلايا إجراءات الاختيار الإيجابية أن تكون معزولة وصفت مع الأجسام المضادة المناسبة إلى جانب ميكروبيدات المغناطيسية. خلال الخطوات غسل العمود الخلايا المسمى ستبقى في العمود ويمكن جمعها عن طريق إزالة عمود من الحقل المغناطيسي للأرض والشطف مع المخزن المؤقت.
  2. لإجراءات الاختيار السلبي، و resuspend 10 7 مجموع خلايا الطحال في 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع الزلال 0.5٪ المصل البقري (BSA). إضافة 10 ميكرولتر من البيوتين المسمى الأجسام المضادة كوكتيل المرفق مع عدة العزلة المغناطيسية (أجسام مضادة محددة ملزمة الخلايا غير CD4 + T-)، واحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
    1. إضافة 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA و 20 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة البيوتين. احتضان 20 دقيقة على الجليد.
    2. إضافة إلى عينة 10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5٪ BSA والطرد المركزي في 390 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين. Resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSا.
    3. ضع عمود محدد لإجراءات الاختيار السلبي في الحقل المغناطيسي للأرض وشطف مع 3 مل من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA على العمود. إضافة تعليق الخلية على العمود ويغسل 3 مرات مع 3 مل من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA.
    4. خلايا الطرد المركزي من النفايات السائلة في 390 x ج لمدة 5 دقائق. مرور النفايات السائلة من خلال العمود يحتوي على خلايا CD4 + T غير المسماة. resuspend الكرية في 1 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع٪ BSA 0.5 و عدد الخلايا.
    5. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل التريبان الأزرق. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
      1. تملأ الغرفة عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من الخلايا الملون. عدد الخلايا تحت المجهر في أربعة 1 × 1 مم 2 الساحات من غرفة واحدة وتحديد متوسط ​​عدد الخلايا لكل متر مربع. تظهر خلايا قابلة للحياة البيضاء والخلايا الميتة تظهر زرقاء. لتحديد عدد الخلايا / مل تتكاثر سلعدد لتر من عامل التخفيف. إذا كان يتم عد 2-4 الأرباع، القسمة على عدد من الأرباع.
  3. لإجراءات الاختيار الإيجابي، إضافة 10 ميكرولتر من ميكروبيدات CD62L في 10 7 التخصيب قبل خلية جزء CD4 + T. احتضان 15 دقيقة على الجليد.
    1. إضافة إلى عينة 10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5٪ BSA والطرد المركزي في 390 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين. resuspend في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA.
    2. ضع عمود محدد لإجراءات الاختيار السلبي في الحقل المغناطيسي للأرض وشطف مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA على العمود. إضافة تعليق الخلية على العمود ويغسل 3 مرات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA.
    3. إزالة عمود من الحقل المغناطيسي للأرض ووضعه على أنبوب جمع مناسبة. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5٪ BSA على العمود وطرد خلايا CD4 + T + CD62Lق الاحتفاظ بها في العمود عن طريق دفع بقوة المكبس في العمود.
      ملاحظة: خلايا CD4 + T CD62L + معزولة هي الآن جاهزة لتطبيقات المصب، مثل التجارب في الجسم الحي. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة من CD4 + CD62L + T عدة زنازين العزل، وميكروبيدات ليست سامة. نظرا لحجم صغير (حوالي 50 نانومتر)، فإنها لم تقم بتنشيط الخلايا وأنها لن تشبع الحواتم سطح الخلية. وبالتالي فإن الخلايا المعزولة يمكن نقلها في الفئران العوز المناعي للحث على التهاب القولون 37،44،45.
    4. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل التريبان الأزرق. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
      1. تملأ الغرفة عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من الخلايا الملون. عدد الخلايا تحت المجهر في أربعة 1 × 1 مم 2 الساحات من غرفة واحدة وتحديد متوسط ​​عدد الخلايا لكل متر مربع. خلايا قابلة للحياة appeaص البيضاء والخلايا الميتة تظهر زرقاء. لتحديد عدد الخلايا / مل مضاعفة عدد الخلايا التي كتبها عامل التخفيف. إذا 2 - يتم عدها 4 الأرباع، القسمة على عدد من الأرباع.

6. تحريض التهاب القولون مدفوعة مستضد

  1. حقن داخل الصفاق 3 × 10 5 خلايا OT-II / الأحمر CD4 + CD62L + T إلى CX 3 CR1 GFP / س + الفريق الاستشاري - / - الفئران. لتحريض التهاب القولون مستضد معين، إدارة E. القولونية pCFP-OVA كل يوم الثاني بجرعة 1 × 10 8 حدة تشكيل مستعمرة (كفو) في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني للحيوان بواسطة التغذية الأنبوبية أو تقطير عن طريق الفم وراء القواطع.
  2. مراقبة مرتين أسبوعيا وزن الجسم للفئران زرع وحالة سريرية على (وجود الدم في البراز، وقوام البراز ونشاط الفئران).

7. عينات الأنسجة للفحص النسيجية

  1. أخذ عينات من أنسجة عشرالبريد الأمعاء الغليظة من الفئران، وإصلاح في الفورمالين محايدة مخزنة (10٪) وتضمين في البارافين كما هو موضح سابقا 36،46.
  2. القسم عينات البارافين على مشراح، جبل على الشرائح، وأداء H & E صمة عار 47،48.
  3. تصنيف الأنسجة من الأمعاء الغليظة كما نشرت سابقا 47،48: عادي (يسجل 0)؛ التهاب القولون معتدل (درجة 1)، والتهاب القولون المعتدل (النتيجة 2) والتهاب القولون الحاد (تسجيل 3).

8. عزل خلايا القولون الصفيحة المخصوصة

  1. الموت ببطء الفئران زرعها من قبل خلع عنق الرحم بعد التخدير عن طريق الاستنشاق من أي الأثير المهلجنة (تصل إلى 5٪ لتحريض) متوفرة تجاريا.
  2. وضع الحيوان إلى أسفل مع بطن مواجهة. استخدام ملقط لانتزاع الجلد الأمامية لفتح مجرى البول. استخدام المقص لقطع الجلد على طول خط الوسط بطني من الفخذ في الصدر. سحب الجلد مرة أخرى على الجانبين.
  3. قطع طريق الجدار العضلي البريتوني شفافة ويفتح تجويف الجسم. تحديد القولون الذي يمتد من فتحة الشرج إلى العوراء 49. قطع الأطراف (2) وتحرير الأنسجة من أي دهون.
  4. فتح القولون طوليا باستخدام مقص تشريح. استخدام ملاقط لزعزعة النسيج القولون في طبق بتري تحتوي على 25 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ FBS لإزالة الأنقاض والأغشية المخاطية. قطع القولون إلى 5-8 قطع ملم.
  5. وضع شرائح القولون في أنبوب 50 مل تحتوي على 20 مل من غسل العازلة. المخزن المؤقت غسل يحتوي على 500 مل DPBS، 10MM HEPES و5MM ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA).
  6. دوامة أنبوب لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى.
  7. احتضان الأنبوب مع شرائح القولون في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 10 دقيقة.
  8. بعد الحضانة، ودوامة أنبوب لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى.
  9. تجاهل supernatants ووضع عينات الأنسجة في أنبوب 50 مل جديدة تحتوي على 20 مل من غسل العازلة. كرر الخطوات من 6-9 ثلاث مرات
  10. تجاهل الصورةupernatants ووضع عينات الأنسجة في طبق بتري تحتوي على 25 مل من برنامج تلفزيوني. استخدام ملاقط ليهز بلطف عينات الأنسجة في طبق بتري لبضع ثوان لإزالة الخلايا الظهارية المتبقية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  11. قطع أنسجة القولون إلى 2 × 2 مم 2 قطعة وهضمها من قبل حضانة في 10 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المتوسطة مع 0.5 ملغ / مل نوع كولاجيناز الثامن من كلوستريديوم للنسج و10 U / مل من DNaseI.
  12. دوامة أنبوب لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى.
  13. احتضان شظايا القولون في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 35 دقيقة ودوامة أنبوب لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى كل 5 دقائق.
  14. في نهاية الحضانة دوامة أنبوب لمدة 30 ثانية على سرعة القصوى.
  15. جمع شظايا هضمها من قبل تمريرها من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر المتمركزة على أنبوب 50 مل الجديد.
  16. غسل العينة وذلك بإضافة 20 مل من DPBS وأجهزة الطرد المركزي في 400 غ لمدة 5 دقائق. resuspend ثم رانه الخلايا في 1 مل من DPBS.
  17. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل التريبان الأزرق. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
    1. تملأ الغرفة عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من الخلايا الملون. عدد الخلايا تحت المجهر في أربعة 1 × 1 مم 2 الساحات من غرفة واحدة وتحديد متوسط ​​عدد الخلايا لكل متر مربع. تظهر خلايا قابلة للحياة البيضاء والخلايا الميتة تظهر زرقاء. لتحديد عدد الخلايا / مل مضاعفة عدد الخلايا التي كتبها عامل التخفيف. إذا كان يتم عد 2-4 الأرباع، القسمة على عدد من الأرباع.

9. تلطيخ خارج الخلية لتحليل FCM

  1. أجهزة الطرد المركزي في CLP خلايا 5 دقائق في 390 ز س. Resuspend الخلايا في 1 مل من FACS ألف (PBS تستكمل مع 1٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم)
    ملاحظة: أزيد الصوديوم عالية السمية. ويمكن أن يسبب انخفاض ضغط الدم، انخفاض حرارة الجسم، والتشنجات والصداع أو الموت. تمييع حلول أزيد الصوديوم (00،1-1،0٪) عادة لا تقدم مخاطر غير عادية للمستخدم، لكنها العين والجلد المهيجة. ولذلك، استخدم أزيد الصوديوم فقط في غطاء محرك السيارة الكيميائية في حين يرتدي معطف المختبر وزوج المزدوج للقفازات النتريل المتاح.
  2. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) 2.4G2 موجهة ضد FcγRIII / II CD16 / CD32 (0.5-1 ميكروغرام ماب / 10 6 خلايا) المخفف في نظام مراقبة الأصول الميدانية أ.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من FACS ألف لخلايا وأجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في 390 ز س. كرر هذه الخطوة مرتين. احتضان الخلايا مع 0.5 نانوغرام / 10 6 خلايا ماب ذات الصلة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. تمييع الأجسام المضادة في نظام مراقبة الأصول الميدانية أ.
  4. إضافة 200 ميكرولتر من FACS ألف لخلايا وأجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في 390 ز س. كرر هذه الخطوة مرتين. Resuspend والعينات في 100 ميكرولتر من FACS أ.
  5. تحليل خلايا T من CX 3 CR1 GFP / س + الفريق الاستشاري - / - الفئران تشكيلها مع OT-II / خلايا CD4 T الأحمر في قياس التدفق الخلوي 37.
    6. تحليل البيانات باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا.

تحليل 10. متحد البؤر المجهري

  1. تحليل القولون من CX 3 CR1 GFP / + الفئران تشكيلها أم لا مع OT-II / خلية الأحمر CD4 + CD62L + T وتغذية عن طريق الفم كل يوم الثاني على التوالي مع 1 × 10 8 كفو من E. كولاي سلالة DH10B pCFP-OVA.
  2. إزالة القولون من الفئران باستخدام مقص وملاقط. فتحه طوليا باستخدام مقص تشريح.
  3. قطع قطعة 5-8 ملم من عينة القولون باستخدام مقص، وضعت على الشرائح الزجاجية، وتغطي مع coverslips.
  4. تحليل العينات القولون مع المجهر متحد البؤر في التكبير من 40 / 1.30.
  5. كشف CX 3 CR1 + النواب، وصفت مع الأخضر البروتين فلوريسئين (GFP)، وذلك باستخدام فلتر مع مجموعة الإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات في 509 نانومتر.
  6. الكشف عن خلية CD4 + T التعبير عن بروتين أحمر باستخدام فلتر مع مجموعة الإثارة في 554 نانومتر، والانبعاثات في 586 نانومتر.
  7. كشف القولونية pCFP-OVA باستخدام فلتر مع مجموعة الإثارة في 450 نانومتر، والانبعاثات في 480 نانومتر.
  8. تحديد مساحة من الاهتمام وتوليد الرسوم البيانية مبعثر كما هو موضح سابقا 50 لإجراء التحليل شارك في التعريب. 2 استخدام صيغ مختلفة: معامل التداخل وفقا لManders ومعامل بيرسون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إنشاء نموذج التهاب القولون يحركها مستضد وE. سلالة القولونية تم بناؤها الذي يحتوي البلازميد التي يتم تنصهر جين لCFP إلى تسلسل الترميز للبروتين ألبومين البيض والدجاج وبناء الانصهار وأعرب تحت سيطرة القوي المروج التأسيسية ف فرط (الشكل 1A). يظهر الفحص المجهري الفلورسنت أن E. المؤتلف القولونية pCFP-OVA، ولكن ليس E. الوالدين القولونية DH10B، عن CFP

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كما هو الحال مع كل نموذج آخر، نموذج التهاب القولون يحركها مستضد المذكورة أعلاه قد تقدم عدد قليل من القضايا التي المحقق أداء هذه التقنية يجب أن تكون على علم. عندما حقن OT-II / أحمر + CD4 + T + CD62L الخلايا في الدولة المضيفة، يجب أن يكون محقق لطيف جدا ودقيق لادخال الإبرة في التجويف البريتوني. قد يؤدي عدم القيام بذلك سيؤدي في تمزق في الأمعاء من الفأرة التي قد تؤدي إلى الوفاة، أو إدارة تحت الجلد من الخلايا التي لا تحفز اي مرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

JHN مدعوم من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية (SNSF 310030_146290).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرق LB ، ميلر (لوريا بيرتاني)Difco244620
روتاري شيكريس لابوربيدرف إي كيه.نموذج 3020 GFL
2 مم فجوة couvettes Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell system BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar ، Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
طقم عزل البلازميد عالي النقاءRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & amp Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
حمض الخليك الجليديSigma-Aldrich537020 
غرفة جل PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
تحميل صبغةThermo FisherR0611
GeneRuler 1 كيلو بايت DNA سلم  Thermo FisherSM0312
محلول بروميد الإيثيديومCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
نظام توثيق الصور  Decon Science Tech GmbHDeVision G 
تسلسل الحمض النووي MWG-Biotech GmbH
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) BiochromL182-50
مجهر الفلورسنت  ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas ، سانت ليون روت ، ألمانيا
IstanBlue SolutionExpedeon ، كامبريدجشاير ، المملكة المتحدة
غشاء النيتروسليلوز   ؛Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
نشاف كهربائي Biometra GmbH846-015-600
ألبومينات مصل الأبقار (BSA)سيجما-ألدريتشA6003-25G
الأجسام المضادة للبيضا الألبومين  Abcamab181688
مكافحة الأرانب IgG & nbsp ؛ HRPسيجما ألدريتشA0545 
بيرس ECL Plus الركيزة الغربية النشافبيرس التكنولوجيا الحيوية ، ثيرمو فيشر العلمية32132
فورينأبوت2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
مصافي خلايا الصقرفيشر العلمية & nbsp ؛08-771-2
كلوريد الأمونيومسيجما ألدريتش254134-5G
تريس بيسسيجما ألدريتش10708976001
CD4 < سوب > + < / سوپ > CD62 L < سوپ > + < / سوپ > طقم عزل T   ؛Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS Columns Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Columns Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS فاصلMiltenyi Biotec130-042-302
فاصل MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
إبرة التغذية 20GSouthPointe Surgical Supply، IncFN-7903
محلول فورمالين ، محايد مخزن مؤقت ، 10٪سيجما ألدريتشHT501128
بارافينسيجما ألدريتش1496904
هيماتوكسيلينسيجما ألدريتشH9627
Eosin yسيجما ألدريتش230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
الكولاجيناز نوع الثامنسيجما ألدريتشC-2139
معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) متوسطAppliChemA2044 ، 9050
أزيد الصوديومسيجما ألدريتش438456
الماوس BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC مترافق mAb V & szlig ؛ 5.1 ، 5.2 & nbsp ؛BD Pharmingen553189
ملزمة mAb مترافقة APC CD4 GK1.5   ؛eBioscience17-0041-83
FACS Calibur BD Biosciences
FCS Express V3 برنامجDeNovo
Meta مسح مجهر متحد البؤر  زايسLSM 710 
محطة عمل زايسLSM7
Zeiss ZEM software Zeissv4.2.0.121
لوحات مناعية Maxisorp NUNC ، روسكيلد442404
ستربتافيدين الفوسفاتيز القلوي المترافقجاكسون للأبحاث المناعية016-050-084
ركيزة الفوسفاتيز القلوية 4-نيتروفينيل فوسفات ملح ثنائي الصوديوم سداسي هيدراتسيجما ألدريتش71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2   ؛BD Biosciences554410
TECAN microplate-ELISA readerTecan
EasyWin برنامجTecan
DNase I المؤتلف4536282001

المراجع

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
  3. Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
  4. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
  5. Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
  6. Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
  7. Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
  8. Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
  9. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
  10. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
  11. Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111(2011).
  12. Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
  13. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
  14. Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
  15. Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
  16. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
  17. Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
  18. Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
  19. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
  20. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
  21. Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
  22. Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
  23. Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
  24. Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
  25. Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
  26. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
  27. Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
  28. Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
  29. Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
  30. Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
  31. van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
  32. Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
  33. Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
  34. Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
  35. Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
  36. Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  37. Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
  38. Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
  39. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
  40. Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
  41. Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
  42. Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
  43. Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
  44. Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
  45. Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
  46. Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
  47. Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
  48. Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
  49. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
  50. Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
  51. Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
  52. Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
  53. Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404(2012).
  54. Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD4 OT II E coli CFP OVA
تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.