Method Article

تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

DOI:

10.3791/54421

⸱

September 18th, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> في نموذج التهاب القولون الذي يحركه المستضد ، تم نقل خلايا OT-II CD4 + T التي تعبر عن بروتين فلوري أحمر بالتبني إلى فئران RAG - / - التي تعبر عن بروتين فلوري أخضر في الخلايا البلعمية أحادية النواة (MPS). واجه المضيفون تحديا مع الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية) التي تعبر عن بروتين البيضاوي (OVA) المدمجة في بروتين فلوري سماوي (CFP).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو التهاب مزمن يصيب الجهاز الهضمي (GIT). واحدة من أفضل الطرق لدراسة الآليات المناعية المتضمنة أثناء المرض هي نموذج نقل الخلايا التائية لالتهاب القولون. في هذا النموذج ، يتم إعادة تكوين الفئران التي تعاني من نقص المناعة (متلقي RAG - /- ) بخلايا CD4 + T الساذجة من مضيفين من النوع البري الأصحاء.

يسمح هذا النموذج بفحص الأحداث المناعية المبكرة التي تؤدي إلى المرض والالتهاب المزمن ، عندما يستمر التهاب الأمعاء ولكنه لا يعتمد على مستضد محدد. لدراسة الدور المحتمل للخلايا العارضة للمستضد (APCs) في عملية المرض ، من المفيد أن يكون لديك نموذج مرض يحركه المستضد ، حيث يؤدي مستضد محدد مشتق من المستضد إلى التهاب القولون. ومن ثم تم تطوير نموذج التهاب القولون المدفوع بالمستضد. في هذا النموذج OT-II CD4 + الخلايا التائية ، التي يمكنها التعرف على حواتم محددة فقط في بروتين OVA ، يتم نقلها إلى مضيفات RAG - / - التي تواجه تحديا مع CFP-OVA التي تعبر عن الإشريكية القولونية. يسمح هذا النموذج بفحص التفاعلات بين APCs والخلايا التائية في الصفيحة الخاصة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأمعاء هو أكبر سطح الجسم الذي يتعرض للبيئة الخارجية. واسعة ومتنوعة من الميكروبات المقيمين استعمار أمعاء الإنسان لتشكيل الجراثيم المعوية (أو البكتيريا). ويقدر هذا ليصل قوامها إلى 100 ​​تريليون خلية الميكروبية ويشكل واحدا من الموائل البكتيرية الأكثر اكتظاظا بالسكان المعروف في علم الأحياء 1-3. في الجهاز الهضمي البكتيريا استعمار كوة المعوية حيث البقاء على قيد الحياة والتكاثر 4. وفي المقابل، فإن الجراثيم يمنح المضيف مع ميزات وظيفية إضافية غير المشفرة على الجينوم 1. على سبيل المثال الجراثيم يحفز تكاثر الخلايا الظهارية، وتنتج الفيتامينات التي تستضيف لا يمكن ان تنتج من تلقاء نفسها، وينظم عملية الأيض، و....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت ولدت الفئران وأبقى تحت (SPF) شروط معينة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوان من جامعة أولم (أولم، ألمانيا). وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للمبادئ التوجيهية للاستخدام الحيواني المحلي ولجنة الرعاية وقانون رعاية الحيوان الوطنية.

1. بناء على pCFP-OVA البلازميد

  1. تضخيم الكامل الجينات حجم البويضات باستخدام بادئات Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') وOva_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنشاء نموذج التهاب القولون يحركها مستضد وE. سلالة القولونية تم بناؤها الذي يحتوي البلازميد التي يتم تنصهر جين لCFP إلى تسلسل الترميز للبروتين ألبومين البيض والدجاج وبناء الانصهار وأعرب تحت سيطرة القوي المروج التأسيسية ف فرط (الشكل 1A). يظهر الفحص المجهري الفلورسنت أن E. المؤتلف القولونية pCFP-OVA، ولكن ليس E. الوالدين القولونية DH10B، عن CFP

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو الحال مع كل نموذج آخر، نموذج التهاب القولون يحركها مستضد المذكورة أعلاه قد تقدم عدد قليل من القضايا التي المحقق أداء هذه التقنية يجب أن تكون على علم. عندما حقن OT-II / أحمر + CD4 + T + CD62L الخلايا في الدولة المضيفة، يجب أن يكون محقق لطيف جدا ودقيق لادخال الإبرة في التجويف البريتوني. قد يؤدي عدم القيام بذلك سيؤدي في تمزق في الأمعاء من الفأرة التي قد تؤدي إلى الوفاة، أو إدارة تحت الجلد من الخلايا التي لا تحفز اي مرض.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JHN مدعوم من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية (SNSF 310030_146290).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مرق LB ، ميلر (لوريا بيرتاني)Difco244620
روتاري شيكريس لابوربيدرف إي كيه.نموذج 3020 GFL
2 مم فجوة couvettes Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell system BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar ، Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
طقم عزل البلازميد عالي النقاءRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & amp Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
حمض الخليك الجليديSigma-Aldrich537020 
غرفة جل PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
تحميل صبغةThermo FisherR0611
GeneRuler 1 كيلو بايت DNA سلم  Thermo FisherSM0312
محلول بروميد الإيثيديومCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
نظام توثيق الصور  Decon Science Tech GmbHDeVision G 
تسلسل الحمض النووي MWG-Biotech GmbH
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) BiochromL182-50
مجهر الفلورسنت  ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas ، سانت ليون روت ، ألمانيا
IstanBlue SolutionExpedeon ، كامبريدجشاير ، المملكة المتحدة
غشاء النيتروسليلوز   ؛Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
نشاف كهربائي Biometra GmbH846-015-600
ألبومينات مصل الأبقار (BSA)سيجما-ألدريتشA6003-25G
الأجسام المضادة للبيضا الألبومين  Abcamab181688
مكافحة الأرانب IgG & nbsp ؛ HRPسيجما ألدريتشA0545 
بيرس ECL Plus الركيزة الغربية النشافبيرس التكنولوجيا الحيوية ، ثيرمو فيشر العلمية32132
فورينأبوت2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
مصافي خلايا الصقرفيشر العلمية & nbsp ؛08-771-2
كلوريد الأمونيومسيجما ألدريتش254134-5G
تريس بيسسيجما ألدريتش10708976001
CD4 < سوب > + < / سوپ > CD62 L < سوپ > + < / سوپ > طقم عزل T   ؛Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS Columns Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Columns Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS فاصلMiltenyi Biotec130-042-302
فاصل MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
إبرة التغذية 20GSouthPointe Surgical Supply، IncFN-7903
محلول فورمالين ، محايد مخزن مؤقت ، 10٪سيجما ألدريتشHT501128
بارافينسيجما ألدريتش1496904
هيماتوكسيلينسيجما ألدريتشH9627
Eosin yسيجما ألدريتش230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
الكولاجيناز نوع الثامنسيجما ألدريتشC-2139
معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) متوسطAppliChemA2044 ، 9050
أزيد الصوديومسيجما ألدريتش438456
الماوس BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC مترافق mAb V & szlig ؛ 5.1 ، 5.2 & nbsp ؛BD Pharmingen553189
ملزمة mAb مترافقة APC CD4 GK1.5   ؛eBioscience17-0041-83
FACS Calibur BD Biosciences
FCS Express V3 برنامجDeNovo
Meta مسح مجهر متحد البؤر  زايسLSM 710 
محطة عمل زايسLSM7
Zeiss ZEM software Zeissv4.2.0.121
لوحات مناعية Maxisorp NUNC ، روسكيلد442404
ستربتافيدين الفوسفاتيز القلوي المترافقجاكسون للأبحاث المناعية016-050-084
ركيزة الفوسفاتيز القلوية 4-نيتروفينيل فوسفات ملح ثنائي الصوديوم سداسي هيدراتسيجما ألدريتش71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2   ؛BD Biosciences554410
TECAN microplate-ELISA readerTecan
EasyWin برنامجTecan
DNase I المؤتلف4536282001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antigen Driven Colitis ModelT Cell Transfer ModelColonic Lamina PropriaAntigen Presenting CellsOT II CD4 T CellsCFP OVA Expressing E coliFlow Cytometry AnalysisConfocal Microscopy ImagingCell Isolation ProtocolTissue Digestion Method

Related Articles