مقالة منهجية

مقاربة بسيطة لالتلاعب الأوكسجين المذاب لملاحظات سلوك الحيوان

9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54430

⸱

يونيو 28, 2016

 , 
1Department of Biology, Juniata College

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة بروتوكول بسيطة وقابلة للتكرار في استغلال الظروف الأوكسجين المذاب في إعداد مختبر للدراسات سلوك الحيوان. ويمكن استخدام هذا البروتوكول في كل من إعدادات التدريس ومختبرات البحوث لتقييم استجابة العضوي من macroinvertebrates، أسماك، أو البرمائيات للتغيرات في تركيز الأكسجين المذاب.

الملخص

القدرة على التعامل مع الأوكسجين المذاب (DO) في إعداد مختبر لديها تطبيق كبير للتحقيق في عدد من الأسئلة السلوك البيئي والعضوي. بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة بسيطة وقابلة للتكرار، وتسيطر على التلاعب DO لدراسة استجابة سلوكية في الكائنات المائية الناتجة عن نقص الأوكسجين وظروف نقص الأكسجين. أثناء أداء degasification من الماء مع استخدام النيتروجين عادة في بيئة معملية، لا توجد طريقة صريحة لتطبيق البيئي (المائية) موجود في الأدب، وهذا البروتوكول هو أول من وصف بروتوكول لdegasify المياه لمراقبة استجابة العضوي. وقد وضعت هذه التقنية وبروتوكول التطبيق المباشر لmacroinvertebrates المائية؛ ومع ذلك، والأسماك الصغيرة، والبرمائيات، والفقاريات المائية الأخرى يمكن أن تكون بديلا بسهولة. انها تسمح للتلاعب السهل من مستويات DO تتراوح من 2 ملغم / لتر إلى 11 ملغم / لتر مع الاستقرار لمدة تصل إلى فترة الحيوان الملاحظة 5 دقائق.أبعد من فترة الملاحظة 5 دقائق بدأت درجة حرارة المياه في الارتفاع، وفي DO 10 دقيقة أصبحت مستويات غير مستقر للغاية للمحافظة عليه. البروتوكول هو تحجيم للكائن الحي الدراسة، قابلة للتكرار، وموثوق بها، والسماح للتنفيذ السريع إلى مختبرات التدريس التمهيدية وتطبيقات بحثية عالية المستوى. النتائج المتوقعة من هذا الأسلوب الذي ينبغي أن تتعلق بحل التغييرات الأكسجين إلى الاستجابات السلوكية للكائنات الحية.

المقدمة

تركيز الأكسجين المذاب (DO) معلمة الفيزيائية الأساسية المهمة في التوسط في عدد من العمليات البيولوجية والبيئية في النظم الإيكولوجية المائية. التعرض لنقص الأكسجين شبه قاتلة الحاد والمزمن تقلل من معدلات النمو في بعض الحشرات المائية والحد من بقاء حشرات التي تتعرض 1. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتوفير طريقة تسيطر على التعامل مع مستويات DO في الماء تيار لمراقبة آثار على سلوك الحيوان. منذ بقاء جميع الكائنات المائية الهوائية "يعتمد على تركيز الأوكسجين من أجل العيش والتكاثر، وغالبا ما تنعكس التغييرات في تركيز DO في التغيرات السلوكية التي الكائنات الحية. وقد لوحظ المزيد من اللافقاريات والأسماك المائية المحمول للرد على تركيزات الأكسجين منخفضة (ميتة) من خلال السعي لغات مع ارتفاع DO 2،3. للكائنات المائية النقالة أقل، التكيف السلوكي لزيادة تناول DO قد يكون الخيار الوحيد القابل للتطبيق. ترتيب macroinvertebrate المائية من PLECوقد لوحظ optera (stonefly) لأداء حركات "دفع ما يصل" لزيادة تدفق المياه، وامتصاص الأكسجين، عبر الخياشيم الخارجية من 4-6. وقد لوحظت هذه السلوكيات التكيفية في البيئات الطبيعية وفي التجارب المعملية.

التلاعب مختبر DO في الماء يفتح آفاقا واسعة للدراسات سلوك الحيوان، ولكن وجود ثغرات كبيرة في نشر المنهجي. على سبيل المثال، استخدمت إحدى الدراسات أحواض كبيرة لتقييم الوقت الفسيولوجية رد ارجموث باس (salmoides Micropterus) إلى بيئات ميتة التالية بالغاز مع النيتروجين، ولكن تعطى التفاصيل شحيحة للمنهجية 7. وصفت دراسة أخرى أجريت على حمار وحشي الأسماك (دانيو rerio) باستخدام غاز النيتروجين والحجر التي يسهل اختراقها لتوصيل الغاز إلى المياه وتقليل DO من الماء (8). لالتطبيقات المستندة إلى الكيمياء، وطرق degasification المذيبات الاستفادة المتخصصةجهاز 9-11 لإزالة الأكسجين من المذيبات، لكنها لن تكون مناسبة للدراسات سلوك الحيوان. في حين أن هذه الدراسات تستخدم الطرق لإزالة الأكسجين من الماء، ويمكن تحديد أي المنهج الوصفي الذي من شأنه أن يسمح لتقييم سلوك الحيوان في الاستجابة لتفعل التغيرات.

هذا الأسلوب هو موضح فيما يلي محاولة لوصف بالكامل على بروتوكول للتلاعب DO من المياه عن طريق استخدام غاز النيتروجين. وعلاوة على ذلك، تم تطوير هذه الطريقة من أجل مراقبة العلاقات بين السلوك stonefly (بوشوبس) وفعل ذلك كان يعمل في مختبر البيولوجيا على مستوى طالبة. واحدة من الفوائد الرئيسية لهذه الطريقة هو أنه يمكن أن تتم داخل المختبر مع الأواني الزجاجية والمواد في متناول معظم مؤسسات التعليم الثانوي والعالي المشترك. البروتوكول هو أيضا قابل للتكيف بسهولة، مما يسمح للأفراد لتوسيع نطاق إجراءات لتلبية الأهداف المحددة لتطبيقات البحث أو التدريس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: لم هذه التجربة لا تستخدم الفقاريات، وبالتالي لا تتطلب موافقة معهد جونياتا الكلية لرعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. ولكن بالنسبة للأفراد التكيف مع هذه الطريقة للاستخدام مع الفقاريات، ينبغي التماس موافقة IACUC.

جمع العينات 1. الميدان

  1. تحديد وتقييم المواقع الميدانية الممكنة من اجل القدرة على جمع وتخزين ونقل stoneflies بسرعة للحد من وقت في عملية عبور مع الحد الأقصى الموصى به وقت في عملية عبور من 1 ساعة.
  2. أداء أخذ العينات من ركلة الصافية في موقع الحقل المحدد وفقا للإجراءات ركلة صافية قياسية مرات كافية لجمع ما لا يقل عن 35 stoneflies 12.
  3. جمع 50 لتر من الماء تيار والصخور التي يبلغ قطرها الحد الأقصى من 2 سم من تيارات.
  4. وضع أحواض السمك في الثلاجة لتعيين درجة حرارة الموقع تيار. توزيع الصخور التي تم جمعها في موقع تيار في أحواض السمك وملء مع 4 لتر من الماء تيار في الحوض. ضع 20-30 stoneflies جمعت في الحوض ووضع حجر محتدما تعلق على الفوار الحوض في كل خزان وتشغيل الفقاعات لإضافة باستمرار هواء الغرفة إلى الماء.
  5. السماح للstoneflies على التكيف مع البيئة الجديدة في أحواض السمك لمدة 48 ساعة.

figure-protocol-1
الشكل 1. إعداد للتلاعب الأكسجين الذائب. (A) 1) تركيب لأنابيب النحاس إلى الذكور خرطوم اذع 2) موقع ختم سدادة لفحص للتأكد جيدا ختم قارورة. (ب) 1) 2 L الجانب الذراع قارورة مليئة 1.9 لتر من الماء 2) أنبوب الغاز والفوار الهواء (الأزرق) لاستخدامها في فقاعات النيتروجين وغرفة محتدما الهواء، على التوالي 3) خزان النيتروجين والقيم قياس 4) 2 لتر قارورة مليئة 0.4 لتر ​​من الماء مع أنبوب فراغ المغمورة 5) المذاب متر الأوكسجين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. مجموعة التجريبية حتى

  1. على قمة مقاعد البدلاء، وتوصيل أنبوب فراغ الجدران قياسية لذراع الجانب من 2 L الجانب الذراع قارورة كما هو مبين (1 في الشكل 1B).
  2. ملء قارورة مع 1.9 لتر من الماء تيار من الحاويات البلاستيكية 3 L عقد المياه تيار جمعها في الثلاجة لتعيين 12 درجة مئوية.
  3. ضع قارورة والأنابيب على صينية كبيرة بما يكفي لعقد حمام الثلج حول القارورة الجانب الذراع بدون حجب الرؤية من الداخل قارورة وملء علبة مع الثلج.
  4. حفر اثنين من الثقوب قطرها 3 مم في سدادة مطاطية للسماح بمرور 1) أنابيب النحاس لتوصيل الغاز إلى السفينة و2) التحقيق من المتر DO في 2 L الجانب الذراع قارورة (1 في الشكل 1B) .
  5. جعل شق الجانبي من على حافة السدادة إلى واحدة من الثقوب للسماح للجلوس السلك لجنة التحقيق DO في سدادة.
  6. ربط مقرنة مع خرطوم الذكور 3 مملاذع على قطعة من 2 ملم أنابيب قطرها النحاس (1 في الشكل 1A). تأكد من أن هذه الأنابيب طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى داخل 10 سم من أسفل القارورة حين التوصل من خلال سدادة.
  7. وضع أنبوب مع مقرنة على الرغم من أن الحفرة الثانية في سدادة حتى طول من الجزء السفلي من سدادة يكفي للوصول إلى داخل 10 سم من أسفل القارورة.
  8. توصيل 0.75 م طول، أنبوب الغاز البولي ايثيلين رقيقة الجدران التي يبلغ قطرها 3 مم إلى مقرنة على الأنابيب.
  9. حرك كل من التحقيق DO والأنابيب النحاسية في قارورة وختم قارورة مع سدادة.
  10. تحقق من وجود ختم آمنة بين سدادة والقارورة، وكذلك نوبة دافئ بين الأنابيب والأسلاك التحقيق داخل سدادة.
  11. ملء قارورة 1 لتر مع 0.4 لتر من ماء الصنبور ووضع المتاخمة للعلبة مع حمام الثلج وقارورة فراغ.
  12. غمر الأنبوب البولي اثيلين القادمة من قارورة فراغ كبير في المياه في قارورة 1 لتر. تأمينأنبوب مع الشريط بحيث ستبقى المغمورة من خلال التجربة.
  13. ربط خط الغاز بقطر 3 ملم من قارورة فراغ إلى حوض للماء فوار غرفة الهواء. تبدأ في فقاعة الماء في قارورة 2 لتر عن طريق توصيل في الفوار الحوض، والذي يدخل هواء الغرفة والأوكسجين إلى الماء.
  14. مراقبة تركيز DO و درجة حرارة الماء مع متر DO لمدة 5 دقائق أو حتى يتم تأسيس توازن DO داخل غرفة مثل هذا التغيير قليلا في DO يحدث.

3. اختبار استقرار التجريبية تعيين لأعلى

  1. اختبار كل الإعداد لDO الاستقرار قبل إضافة stoneflies.
  2. إضافة ثلاثة أو أربعة الصخور إلى قارورة 2 لتر بحيث stoneflies يكون الركيزة مواتية لبوشوبس.
  3. بدء محاكمة التلاعب DO عن طريق قطع أنبوب الغاز من الفوار وإرفاقها إلى خط غاز النيتروجين.
  4. بدء محتدما النيتروجين بنسبة 20 قدم مكعب في الساعة (CFH) لحوالي 40ثانية إلى 1 دقيقة.
  5. مرة واحدة انخفض DO في حدود 0.5 ملغم / لتر من تركيز الهدف، والحد من تدفق إلى 15 CFH والسماح للتركيز لخفض إلى الهدف.
  6. وقف تدفق النيتروجين فورا بمجرد الوصول إلى تركيز الهدف.
  7. استخدام الحوض الفوار غرفة الهواء لإعادة تركيز لتركيز الهدف إذا يقلل من DO أقل من الهدف.
  8. إذا كان DO غير مستقر خلال اختبار مجموعة المتابعة ثم تحقق من حجم المياه لا تزال عند 1.9 L ولا ماء وقد انفجر بها، ودرجة حرارة المياه مستقرة ولا تتغير، وتظهر الأختام على جميع التجهيزات لتكون ضيقة ومغلقة.
  9. مرة واحدة وقد أجريت ثلاث تجارب والمجرب لديه ثقة في القدرة على التحكم DO، ونعلق خط الغاز إلى الفوار وفقاعة إلى التوازن مرة أخرى.
  10. فقاعة إلى التوازن عن طريق ربط خط الغاز بقطر 3 مم إلى الفوار الحوض والبدء في إضافة هواء الغرفة إلى الماء حتى تركيزالأكسجين في الماء لا يزيد أو تغيير لمدة 3 دقائق.
  11. مرة واحدة على التوازن، والتوقف عن السطح وفضها القارورة.

4. تجربة دفع ما يصل Stonefly

  1. تقسيم العدد الإجمالي للstoneflies من قبل عدد من المراقبين لتحديد عدد من التجارب لأداء.
  2. تحديد مستويات DO مختلفة ما بين 2 و 10 ملغ / لتر لتقييم الاستجابة السلوكية للstoneflies (عدد بوشوبس).
  3. إعداد قارورة واحدة في محاكمة وإضافة عدد متساو من stoneflies كما أن هناك مراقبين في قارورة (4 stoneflies في هذا التصميم)، ومكان التحقيق والأنابيب مرة أخرى في قارورة، ثم ختم القارورة مع سدادة مطاطية.
    ملاحظة: دلالة أولية DO تركيز 10 مجم / تم اختيار L كنقطة الملاحظة الأولى منذ كان تركيز DO للتيار من حيث أخذت عينات من stoneflies.
  4. وبمجرد أن المياه في 10 ملغم / لتر من السطح يلي الخطوات 2،10-2،11، تسجيل درجة حرارة الماء تبدأ والسماح للstoneflies إرفاق الركيزة الصخرية في قارورة.
  5. تعيين مراقب واحد فقط لمشاهدة stonefly واحد لضمان عد دقيق لسلوك دفع ما يصل، وهو حركة الجسم صعودا وهبوطا التي أظهرتها stonefly.
  6. عد وتسجيل عدد من دفع عمليات لوحظ على مدى فترة الملاحظة 3 دقائق.
  7. التلاعب DO إلى مستوى DO التجريبي التالي وكرر فترة الملاحظة 3 دقائق لمستويات التجريبية إضافية.
    ملاحظة: وفي هذا التصميم التجريبي، تم تقييم ثلاثة مستويات DO مختلفة.

5. التحليل الإحصائي

  1. لأداء الإحصائي استخدام تحليل متوسط ​​عدد دفع عمليات عبر stoneflies أربعة عبر مجموعة لمحاكمة DO معين.
  2. استخدام المجاني R الإحصائي برنامج الحوسبة 12 إلى إجراء تحليل التباين (ANOVA) على عدد من تمارين الضغط وتركيزات DO باستخدام ترتيب كل محاكمة التجريبية (DO مستوى) ودرجة الحرارة كما COVariates. تحليل DO عن مستويات منفصلة من عامل واحد.
  3. استخدام اختبار الحياة الطبيعية أندرسون دارلينج على مخلفات للتحقق من الوضع الطبيعي 13.
  4. إجراء الانحدار الخطي على البيانات من قبل المتهم بالتآمر في متوسط ​​عدد دفع عمليات ضد تجمعات DO.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم إجراء ست محاكمات من الإعداد وصفها 24 المبتدئون طلاب المرحلة الجامعية في إعداد التدريس المختبر لتحديد عدد من دفع عمليات stoneflies أداء ردا على تركيز DO مختلفة في الماء. تم تجميع متوسط ​​عدد دفع عمليات التي تتم في حدود مستوى DO وداخل كل محاكمة لمؤامرة دفع عمليات ضد مستوى DO في الشكل (2). وقد أجري ANOVA في البداية باستخدام تركيز DO، ترتيب تسلسلي للمحاكمات، ودرجة الحرارة، وكذلك التفاعلات بين جميع المتغيرات. وتشير النتائج إلى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الحاسمة
يوفر هذا الإجراء وسيلة بسيطة وفعالة لمعالجة DO في إعداد مختبر لإجراء الدراسات السلوكية على الكائنات المائية. لقد وجدنا أن يكون هناك العديد من الخطوات / البنود الهامة أن تكون على علم عند تنفيذ هذه التجربة التي تتعلق مباشرة إلى النتائج. ضمن محاكمة، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على ضغط الغرفة لتجنب التغيرات في الضغط الجزئي للغازات فوق الماء، وبعدها DO التقلبات. باتباع الخطوات الموضحة في "اختبار استقرار الإعداد التجريبية" القسم الفرعي لبروتوكول أمر بالغ ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أولا أن يكرموا جميع الطلاب من مختبر وحدة علم الأحياء 121 في كلية جونياتا لمساعدتهم في توليد البيانات المستخدمة في هذه الدراسة. نود أيضا أن نشكر الدكتور راندي بينيت وكريس وولز وشيري إيزنبرغ وتايلور كوكس على مساعدتهم في الحصول على المواد اللازمة لتطوير هذه المنهجية. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر الدكتور نوريس موث والدكتور جون أنجر على نصائحهم بشأن التطوير المنهجي والدكتورة جيل كيني وقسم الأحياء على دعمهم لهذا المسعى. نود أيضا أن نشكر المراجعين المجهولين الذين ساعدوا في تشكيل هذه المخطوطة وتركيزها. أخيرا وليس آخرا ، أود أن أشكر Hudson Grant على مساعدته في مجموعة الذبابة الحجرية الأولية لاستخدامها في تطوير هذه التقنية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قارورة فلتر 2 لترPyrex5340
سدادة مطاطية مقاس 6Sigma-AldrichZ164534
Nalgene 180 أنابيب بلاستيكية شفافةThermo Scienfitic8001-1216
Whisper 60 مضخة هواءTetra
أنابيب خط هواء مرنةقياسية Penn PlaxST25
0.25 بوصة أنابيب نحاسيةLowes تحسين المنزل23050
ذكر خرطوم شوكةGrainger5LWH1
أنثى موصلGrainger20YZ22
عداد الأكسجين المذاب للخدمة الشاقةExtech407510
غاز النيتروجينMatheson TRIGAS
Radnor AF150-580 منظمAirgasRAD64003036

المراجع

  1. Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
  2. Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
  3. Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
  4. Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
  5. McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
  6. Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
  7. Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
  8. Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
  9. Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. , 3,853,500 (1974).
  10. Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. , 6,258,154 (2001).
  11. Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
  12. Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
  13. Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
  14. Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
  15. Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
  16. Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
  17. Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
  18. Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة