في هذه الدراسات، ونحن نقدم منهجية للرواية، حديثي الولادة، السقالات القلب الفئران للاستخدام في الدراسات التجدد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حديثي الولادة القلب السقالات: مصفوفات رواية للدراسات التجدد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العلاج النهائي الوحيد لفشل القلب في المرحلة النهائية هو زراعة القلب التقويمية. في كل عام ، تشير التقديرات إلى أن هناك حاجة إلى أكثر من 100,000 قلب متبرع لإجراءات زراعة القلب في الولايات المتحدة1-2. نظرا للأعداد المحدودة للمتبرعين ، يتم إجراء ما يقرب من 2,400 عملية زرع فقط كل عام في الولايات المتحدة2. تم تنفيذ العديد من الأساليب ، من دراسات العلاج الخلوي إلى زرع أجهزة المساعدة الميكانيكية ، إما بمفردها أو مجتمعة ، في محاولة لإقناع القلب بإصلاح نفسه أو إراحة القلبالفاشل 3. على الرغم من هذه الجهود ، لا تزال أجهزة المساعدة البطينية تستخدم إلى حد كبير لغرض سد الزرع ، ولا تزال فائدة العلاجات الخلوية ، على الرغم من أنها تحمل بعض الوعود العلاجية ، تقتصر على التجارب السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت محاولة زرع الأعضاء الأجنبية مباشرة ولكن النجاح كان محدودا بسبب الرفض المناعي. من الواضح أن هناك حاجة إلى استراتيجية أخرى لإنتاج أعضاء إضافية للزرع ، ومن الناحية المثالية ، ستكون هذه الأعضاء ذاتية المنشأ لتجنب المضاعفات المرتبطة بالرفض وتثبيط المناعة مدى الحياة. إزالة الخلايا هي عملية إزالة الخلايا المقيمة من الأنسجة لفضح المصفوفة الأصلية خارج الخلية (ECM) أو السقالة. يوفر نزع الخلايا بالتروية الحفاظ الكامل على البنية ثلاثية الأبعاد للأنسجة ، مع ترك الجزء الأكبر من الخصائص الميكانيكية للأنسجةسليمة 4. يمكن استخدام هذه السقالات لإعادة توطين الخلايا السليمة لتوليد نماذج بحثية ، وربما الأعضاء التي تشتد الحاجة إليها للزرع. لقد عرضنا السقالات من الفئران حديثي الولادة (P3) ، المعروفة بالاحتفاظ بقدرات رائعة على تجديد القلب ، 5-8 لإزالة الخلايا بوساطة المنظفات وأعدنا ملء هذه السقالات بخلايا قلب الفئران. تدعم هذه الدراسات جدوى هندسة بنية قلب حديثي الولادة. كما أنها تسمح بالتحقيق فيما إذا كانت ECM لقلوب ما بعد الولادة المبكرة قد تحتوي على إشارات من شأنها أن تؤدي إلى تحسين استراتيجيات إعادة الخلية.
المقدمة
فشل القلب هو شائع وقاتل. وهو مرض التدريجي الذي يؤدي إلى انقباض انخفضت من القلب، الذي يعوق تدفق الدم إلى الأعضاء ويترك مطالب التمثيل الغذائي في الجسم تتم تلبيتها. ويقدر أن 5.7 مليون أميركي يعانون قصور القلب وهذا هو السبب الرئيسي في المستشفى في الولايات المتحدة 9. تكلفة الجماعية لعلاج المرضى في فشل القلب في الولايات المتحدة يتجاوز 300 مليار $ دولار سنويا 9-10. العلاج النهائي الوحيد للفشل نهاية المرحلة القلب هو مثلي زرع القلب. في كل عام، وتشير التقديرات إلى أن هناك حاجة إلى أكثر من 100،000 قلوب المانحة لعمليات زرع القلب في الولايات المتحدة الأمريكية 1-2. ويرجع ذلك إلى عدد محدود من الجهات المانحة، ي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع التجارب الماوس وفقا لقانون رعاية الحيوان الولايات المتحدة وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة مينيسوتا.
1. طريقة للماوس القلب العزلة
- الموت ببطء الماوس حديثي الولادة عن طريق قطع الرأس مع استخدام شفرة واحدة.
- مسحة الصدر مع 70٪ من الإيثانول.
- تشريح الجلد من الصدر عن طريق قطع بعيدا عن جدار الصدر مع مقص القياسية في حين سحب الجلد أفقيا مع زوج من ملقط # 5.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
Decellularization
في المتوسط، والوقت لdecellularization من قلب P3 باستخدام هذا البروتوكول ما يقرب من 14 ساعة. يعطى متوسط وزن القلب من 23 ملغ لحديثي الولادة P3.
Acellularity
يوضح الشكل 3A قلب الأطفال حديثي الولادة P3 سليمة تماما (كامل جبل). ويوضح الشكل 3B نفس ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
اعتماد هذه التقنية على تروية دموية متكررة من القلب يجعل تلافي حدوث الانسداد عنصر حاسم في تحقيق نتائج ناجحة. من القسطرة الأولية للقلب في خطوات 2،2-2،6، إلى التغييرات من حل بين خطوات 2،8-2،14، هناك التلاعب التي يمكن أن تسمح مقدمة من فقاعات الهواء التي حل وسط تدفق سائل الإرواء في عضلة القلب. نظرا لضآلة حجم قلب الأطفال حديثي الولادة، حتى فقاعات دقيقة في الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى احتشاء الفني، مما يجعل decellularization غير مكتملة. بالإضافة إلى ذلك، في خطوات غسل لاحقة، يمكن نضح .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يعرب المؤلفون عن تقديرهم للسيدة سينثيا ديكاي لإعداد الأرقام.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
5. طريقة لأنسجة الأنسجة< / قوي> ديكون
من من شوكة < td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>1. مواد لعزل قلب الفئران < / قوي > | |||
| P1 (كما هو موضح ؛ ب 6 ؛ D2-Tg (Myh6 * -mCherry) 2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | أو ما يعادلها |
| 60 مم طبق استزراع | BD Falcon | 353004 | أو ما يعادله |
| من محلول ملحي مخزن بالفوسفات درجة الحموضة 7.4 (معقم) | Hyclone | SH30256.01 | أو ما يعادله |
| شفرة تستخدم مرة واحدة | Stanley | 28-510 | أو ما يعادلها |
| المقص القياسي | Moria Bonn (أدوات العلوم الدقيقة) | 14381-43 | أو ما يعادلها |
| مقص زنبركي 10 سم | أدوات العلوم الدقيقة | 15024-10 | أو ما يعادلها |
| مقص زنبركي Vannas - 3 مم أدوات | العلوم الدقيقة | المتطورة 15000-00 | أو ما يعادلها |
| # 5 ملقط | Dumnot (أدوات العلوم الدقيقة) | 11295-00 | أو ما يعادلها |
| 2. مواد لإزالة الخلايا < / قوي > | |||
| مدخل | محول Chemglass | CG-1013 | قابل للتعقيم |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | قابل للتعقيم |
| 1/8 بوصة. معرف × 3/8 OD C-Flex الأنابيب | Cole-Parmer | EW-06422-10 | قابل للتعقيم |
| ذكر لوير إلى 1/8 "خرطوم شائكة | محول McMaster-Carr | 51525K33 | قابل للتعقيم |
| أنثى لوير إلى 1/8 "خرطوم | محول McMaster-Carr | 51525K26 | Prolene |
| 7-0 خياطة جراحية | Ethicon | 8648G | أو ما يعادله |
| من حامل الحلقة | Fisher Scientific | S47807 | أو ما يعادله |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | أو ما يعادله |
| حامل المشبك | العادي Fisher Scientific | 05-754Q | أو ما يعادله |
| 60 سم مكعب برميل حقنة ؛ | Coviden | 1186000777T | أو ما يعادله |
| من دورق | Kimble | 14000250 أو ما يعادله | |
| 22 جم × 1 إبرة حقنة | BD | 305155 أو ما يعادلها | |
| 12 سم مكعب حقنة | Coviden | 8881512878 | أو ما يعادلها |
| من 3 اتجاهات توقف الديك | سميث ميديكال | MX5311L | أو ما يعادلها |
| من أنابيب PE50 | BD كلاي آدامز إنترميديك | 427411 | يجب أن تكون قابلة للتشكيل بالحرارة. يوصى باستخدام البولي إيثيلين. |
| يوصى باستخدام 1٪ SDS | Invitrogen | 15525-017 | درجة فائقة النقاء. اصنع محلولا جديدا وقم بتعقيمه قبل الاستخدام. |
| 1٪ Triton X-100 ؛ | Sigma-Aldrich | T8787 | اصنع محلولا جديدا من مخزون 10٪ وقم بتعقيمه قبل الاستخدام. |
| معقم dH 2< / sub>O | Hyclone | SH30538.02 | أو نظام MilliQ نقية المياه. |
| 1x قلم / بكتيريا | Corning CellGro | 30-001-Cl | أو ما يعادلها |
| <قوي>3. مواد لتقدير كمية الحمض النووي < / قوي > | |||
| البروتيناز K | فيشر | BP1700 | >30 نشاط U / mg |
| KCl | سيجما ألدريتش | P9333 | أو ما يعادلها |
| MgCl2< / sub>&# 183 ؛ 6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | أو ما يعادلها |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | أو ما يعادله |
| من قاعدة تريس / هيدروكلوريد | Sigma-Aldrich | T1503 / T5941 | أو ما يعادلها |
| من طقم فحص Pico-Green dsDNA | Life Technologies ؛ | يتطلب P7589 | مقياس الفلور لقراءة |
| 4. طريقة تثبيت وتقسيم الأنسجة < / قوية > | |||
| بارافورمالدهايد | سيجما-ألدريتش | P6148 | أو ما يعادلها |
| من الجيلاتين من النوع A من جلد الخنازير | يجب أن يكون Sigma-Aldrich | G2500 | 300 إزهار أو أكبر |
| قوالب التبريد 10 × 10 × 5 مم | Tissue-Tek | 4565 | أو ما يعادلها |
| Cryostat | Hacker / Bright | Model OTF | أو ما يعادلها |
| من شرائح المجهر 25 × 75 × 1 مم | فيشر Scientific | 12-550-19 | أو ما يعادلها |
| Hematoxylin 560 ؛ | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | أو ما يعادلها |
| من مختبرات | الإيثانول | 2701 | أو ما يعادلها |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | أو ما يعادله |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | أو ما يعادله |
| Eosin الكحولي Y 515 ؛ | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | أو ما يعادلها |
| من بديل الزيلين 83 للفورمولا | CBG Biotech | CH0104B | أو ما يعادلها |
| Permount Mounting Medium | فيشر للكيماويات | SP15-500 | أو ما يعادله |
| من الكولاجين الرابع الأجسام المضادة | Rockland | 600-401-106.1 | أو ما يعادلها |
| من ألفا ؛ الأكتينين الأجسام المضادة | Abcam | AB9465 | أو ما يعادلها |
| من mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | أو ما يعادلها |
| NKX2.5 الأجسام المضادة | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | SC-8697 | أو ما يعادلها |
| من الحمار المضاد للفأر AF488 تقنية حياة الأجسام | المضادة A21202 | أو ما يعادلها | |
| من الحمار المضاد للدجاج AF594 الأجسام المضادة | جاكسون للبحوث المناعية | 703-585-155 | أو ما يعادلها |
| الحمار المضاد للماعز CY5 الأجسام المضادة | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | أو ما يعادله |
| من Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | أو ما يعادله |
| Prolong Gold Antifade Mountant مع DAPI | ThermoFisher | P36930 | أو ما يعادله |
| 6. عزل خلايا عضلة القلب البطينية لحديثي الولادة باستخدام الطلاء المسبق < / قوي > | |||
| HBSS (Ca ، خال من المغنيس) | Hyclone | SH30031.02 | أو ما يعادله |
| HEPES (1 M) Corning | CellGro | 25-060-Cl | أو مصفاة الخلايا المكافئة |
| BD Falcon | 352340 | أو ما يعادلها | |
| 50 مل أنبوب | BD Falcon | 352070 | أو ما يعادله |
| Primeria 100 مم لوحات Corning | 353803 | Primeria سطح يعزز ارتباط الخلايا الليفية وتعزيز نقاء أعلى للخلايا | |
| العضلية التربسين | Difco | 215240 | أو ما يعادلها |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | أو ما يعادلها |
| DMEM (الحد الأدنى من الوسائط الأساسية من Delbecco) | Hyclone | SH30022.01 | أو ما يعادلها |
| فيتامين B12 & nbsp ؛ | Sigma-Aldrich | V6629 | أو ما يعادلها |
| من ألواح الطلاء ب Fibronectin ؛ | BD Bioscience | 354501 | أو ما يعادله |
| مصل الأبقار الجنينية | Hyclone | SH30910.03 | أو ما يعادلها |
| الأواني الزجاجية للمفاعل الحيوي للقلب | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | يجب أن تكون قابلة للتعقيم عن طريق التعقيم أو الغاز. |
المراجع
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
