مقالة منهجية

جزيء واحدة سوبر قرار تصوير فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate في غشاء البلازما مع رواية المسابر نيون

DOI:

10.3791/54466

⸱

أكتوبر 15, 2016

 , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PI (4،5) ف 2 تنظم مختلف الوظائف الخلوية، ولكن من المفهوم منظمة النانوية في غشاء الخلية البلازما سيئة. بوصف PI (4،5) ف 2 مع التحقيق الذي تجريه الفلورسنت ثنائي اللون تنصهر إلى المجال Pleckstrin التماثل، ونحن تصف نهجا جديدا لدراسة PI (4،5) ف 2 التوزيع المكاني في غشاء البلازما على مقياس متناهي الصغر .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phosphoinositides في غشاء الخلية تشير إلى الدهون ذات الوظائف الخلوية المتعددة. فوسفاتيديلينوسيتول 4،5-ثنائي الفوسفات (PI (4،5) P2) هو فوسفوفينوزيتيد محدد لغشاء البلازما (PM) ، وهو مطلوب لتعديل القنوات الأيونية ، وديناميكيات الأكتين ، وإفراز الخلايا ، والالتقام الخلوي ، والإشارات داخل الخلايا ، والعديد من العمليات الخلوية الأخرى. ومع ذلك ، فإن التنظيم المكاني ل PI (4،5) P2 في PM مثير للجدل ، وتوزيعه النانوي غير مفهوم جيدا بسبب القيود التقنية لأساليب البحث. هنا من خلال استخدام الفحص المجهري لتوطين الجزيء الفردي ومجسات الفلورسنت ثنائية اللون القائمة على مجال Pleckstrin Homology (PH) ، نصف طريقة جديدة لتصور التوزيع النانوي ل PI (4،5) P2 في PM في صفائح الأغشية الثابتة بالإضافة إلى الخلايا الحية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسهم Phosphoinositides إلى جزء صغير من الدهون الكلية الغشاء، ولكن تلعب أدوارا حاسمة في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. وتشمل سبعة أعضاء المستمدة من الفسفرة عكسها أو نزع الفسفات من الحلقات إينوزيتول في الثالث 3 و 4 و ال مواقف ال 5 +1. فوسفتيدلينوستول 4-الفوسفات (PI4P) وفوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate (PI (4،5) ف 2) هما phosphoinositides الكبرى التي تعمل بشكل مستقل نسبيا مثل الدهون المحدد من غشاء الخلية البلازما (بعد الظهر) 2،3. فوسفتيدلينوستول (3،4،5) -trisphosphate (PIP 3) وهو أقل انتشارا بكثير من PI4P وPI (4،5) ف 2، لكنه لا يملك ظائف فريدة من نوعها في العمليات الخلوية المختلفة بما في ذلك السرطان والسكري 4 5. هذه الدهون لها التفاعلات الجزيئية المعقدة مع المؤثرات الخاصة والعديد من البروتينات الأخرى. ولذلك، من المهم أن نفهم التنظيم المكاني لهذه هواتفsphoinositides في رئيس الوزراء على مقياس متناهي الصغر.

وقد أظهرت أدلة متزايدة على أن المجمعات البروتين أو الكتل جزيء في المناطق PM تقتصر يمكن أن تكون بمثابة إشارات النقاط الساخنة (6). على سبيل المثال، syntaxin 1A، وهو بروتين الرئيسي الذي ينظم الغشاء الانصهار 7-9، يعرض تنظيم العنقودية في PM. متميزة عن رأي توافقي المنظمة مجموعة من syntaxin 1A، والتوزيع المكاني للphosphoinositides في PM مثير للجدل. وتتراوح أنماط PI (4،5) ف 2 توزيع من الزي 10-12، بقع كبيرة 13،14، إلى كثيفة مجموعات 14-18، اعتمادا على أنواع الخلايا والطرق التجريبية المستخدمة. التنظيم المكاني للPI (4،5) ف 2 في دقة أعلى هو أيضا غير متناسقة. دراسة استخدام حفز الانبعاثات استنفاد (STED) المجهري 19 قد كشفت عن وجود عدد كبير من PI كثيفة (4،5) ف 2 نانو مجموعات (~ 73 نانومتر في القطر) في رئيس الوزراء ورقة من PC-12 زنزانة 20 . هذه النتيجة مختلفة من الدراسات باستخدام المجهر سريعة تجميد الإلكترون (EM) 21،22، وهو النهج الذي يحفظ PM بنية سليمة من الخلايا الحية أفضل بكثير من التثبيت الكيميائية. وأظهر هذا الأخير حمامات متميزة من PI (4،5) ف 2. PI مركزة نسبيا (4،5) ف 2 في caveolae والمغلفة حفر وكذلك توزيع موحد على المنطقة PM مسطحة. وعلاوة على ذلك، PI النانو (4،5) ف 2 المنظمة في ورقة الغشاء قد تختلف في الخلايا الحية والثابتة. التحقيق عملنا مؤخرا هذه المسألة في الخلايا INS-1 الثابتة والعيش على حد سواء باستخدام جزيء واحد توطين المجهري (SMLM) 23.

ويستند SMLM على التحول عشوائيا على مجموعة فرعية صغيرة فقط من fluorophores في أي وقت معين بحيث يمكن أن تكون مترجمة fluorophores الفردية بدقة عالية. وقد وضعت العديد من المناهج التصوير فائقة الدقة باستخدام مبادئ مماثلة لتجاوز الحد حيود المجهر الضوئي التقليدية، مثل هذاالصورة تنشيط ضوئي توطين المجهري (النخيل) 24، مضان تنشيط ضوئي توطين المجهري (FPALM) 25، ستوكاستيك إعادة البناء الضوئي المجهري (STORM) 26،27 وSTORM المباشر (dSTORM) 28. مع الصور للتحويل أو fluorophores photoactivatable (الأصباغ أو البروتينات الفلورية)، وتقنيات SMLM تسمح للعلماء للهياكل البيولوجية الصورة في قرار نانومتر 24،29،30 مع معدل الفيديو في الخلايا الحية 31،32.

باستخدام PI (4،5) ف 2 كمثال على ذلك، قدمنا نهج SMLM لدراسة توزيع النانو من phosphoinositides على رئيس الوزراء. المجال PH من PLCδ1 (فسفوليباز C δ1) الذي يربط خصيصا لPI (4،5) ف 2 هو التحقيق راسخة للتصوير PI (4،5) ف 2 توزيع فرعية الخلوي وديناميات 33،34 في PM . لقد الموسومة راثيا هذا المجال مع اثنين من البروتينات الفلورية، PAmCherry1 35 و 36 iRFP لإنتاج ثنائي اللون الانصهار البروتين (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (الشكل 1A-B). يقدم PAmCherry1 كما التحقيق photoactivatable المجال PH للنخلة ويخدم iRFP كمؤشر عام لتحديد الخلايا transfected قبل اكتساب PALM . نحن نطبق هذا ثنائي اللون الفلورسنت التحقيق للتصوير SMLM في الأوراق غشاء ثابتة. للتصوير PALM الحية، ونحن الموسومة mEOS3 37 بدلا من PAmCherry1 إلى المجال PH PLCδ1 لتوليد PLCδ1 التحقيق mEOS3.1-PH للتحسين الكفاءة الفوتون والسطوع (الشكل 1C-D).

كشفت SMLM التصوير مع هذه التحقيقات الجديدة في رئيس الوزراء من إفراز الأنسولين INS-1 خلايا 38 العلامات متجانس من PI (4،5) ف 2 في معظم المناطق PM فضلا PI المركزة (4،5) ف 2 microdomains التي اختلط قليلة في PM مسطحة وبعض هياكل تشبه أرجل كاذبة خيطية 23. ثمتوزيع noscale من PI (4،5) ف 2 يوفر قاعدة الهيكلية لإعادة التفكير كيف يعمل في الخلايا الحية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. غشاء رقة إعداد والتثبيت

  1. إعداد ورقة الغشاء المسمى مع iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1
    1. تحضير الحمض النووي ترميز البلازميد iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية.
    2. ثقافة INS-1 الخلايا على # 1.5 18 ملم coverslips جولة قبل المغلفة مع 30 ميكروغرام / مل فبرونيكتين إلى 50-70٪ confluency التالية القياسية INS-1 بروتوكولات زراعة الخلايا 38،39. Transfect الخلايا بعد يوم واحد يتم التوصل إلى 50-70٪ confluency.
    3. خلايا Transfect مع iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 باستخدام الحويصلية كاشف ترنسفكأيشن التالية بروتوكولات الشركة المصنعة. بعد ترنسفكأيشن، تسمح للخلايا أن تنمو لمدة 48 ساعة.
    4. في يوم من التجربة، coverslips معطف (على جانب واحد) مع ~ 0،5-1 مل من 500 ميكروغرام / مل بولي-D-ليسين (PDL، مخففة في DH 2 O) لمدة 1-2 ساعة. ثم تصفى PDL عن طريق وضع المناديل الورقية علىحافة ساترة. ضع لل coverslips على ما قبل المبردة (4 درجة مئوية) لوحة معدنية لاستخدامها لاحقا.
    5. يغسل قبل transfected-INS-1 نمو الخلايا coverslips على مع ~ 0،5-1 مل الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1 مم EGTA. تكرار غسل ثلاث مرات واستنزاف برنامج تلفزيوني.
    6. ضع لل coverslips مع الخلايا المستزرعة (الجانب خلية لأسفل) على لل coverslips المغلفة PDL على لوحة معدنية قبل المبردة مع زوج من ملاقط. ترك لوحة في الثلاجة (4 درجات مئوية) لمدة 7-10 دقائق للسماح للخلايا إرفاق لل coverslips المغلفة PDL (الشكل 2).
      ملاحظة: يجب أن تكون فترة حضانة في حدود 7-10 دقيقة لمرفق أفضل من الخلايا إلى السطح المطلي PDL. البيئة الثلاجة جافة، وينبغي أن الحضانة لا تكون طويلة جدا.
    7. إزالة لوحة معدنية من الثلاجة. تقشر بلطف ساترة تحتوي على خلايا transfected قبل باستخدام الملقط. وهذا ينتج طبقة رقيقة من ورقة غشاء الخلية علىساترة PDL المغلفة. غسل بلطف ورقة الغشاء مع ~ 0.5 - برنامج تلفزيوني 1 مل الجليد الباردة ومن ثم اصلاحها مع ~ 0.5 - 1 مل الجليد الباردة٪ امتصاص العرق 4 (PFA) + 0.2٪ غلوتارالدهيد (GA) في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      تحذير: لامتصاص العرق وغلوتارالدهيد سامة. التعامل معها في غطاء الدخان مع الجلد وحماية العين.
    8. بعد التثبيت، صورة ورقة غشاء فورا (انظر القسم 3) أو تخزين في ~ 0،5-1 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بعد تحديد ورقة الغشاء، لن يكون هناك توازن ملزم من تحقيقات PH من العصارة الخلوية إلى PI (4،5) ف 2. سوف تحقيقات PH ملزمة تنأى تدريجيا من ورقة الغشاء ومنتشر في حل (على الرغم من أنه قد يستغرق عدة أيام أو أسابيع). ولذلك، فمن المستحسن أن صورة العينات ثابتة مباشرة بعد إعداد العينات.
  2. إعداد ورقة الغشاء لPI (4،5) ف 2 محددة الأجسام المضادة الوسم
    1. ثقافة INS-1 الخلايا على # 1.5، 18 ملم coverslips جولة قبل المغلفة مع 30 &# 181؛ ز / مل فبرونيكتين إلى 50٪ -70٪ التقاء. خلايا Transfect مع DNA البلازميد في اليوم التالي كما هو موضح في الخطوة 1.1.3.
    2. كرر الخطوات من 1.1.4 إلى 1.1.7 كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: تنفيذ الإجراءات التالية عند 4 درجات مئوية.
    3. غسل لل coverslips تحتوي PM أوراق ثابتة ثلاث مرات مع ~ 0.5 - برنامج تلفزيوني 1 مل الجليد الباردة التي تحتوي على 50 ملي NH 4 الكلورين. إخماد الأوراق مع ~ 0،5-1 مل 0.1٪ بوروهيدريد الصوديوم في برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق، ويغسل مع ~ 0،5-1 مل PBS (دون 50 ملي NH 4 الكلورين).
    4. منع العينات مع ~ 0،5-1 مل عرقلة الحل (حل برنامج تلفزيوني تحتوي على 5٪ (ت / ت) العادي مصل الماعز، 5٪ (ت / ت) زلال المصل البقري و 50 ملي NH 4 الكلور) لمدة 45 دقيقة. ثم، واحتضان مع ~ 0،5-1 مل PI الأساسي (4،5) ف 2 الأجسام المضادة (1: 300 تمييع) في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة. يغسل ثلاث مرات (10 دقيقة في كل مرة) مع ~ 0،5-1 مل برنامج تلفزيوني يحتوي على 50 ملي NH 4 الكلورين.
    5. احتضان عينات مع ~ 0،5-1 مل الثانوي F (أ ب ') 2-الماعز المضادة للماوسالأجسام المضادة مترافق مع fluorophores (1: 300) في عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة. يغسل ثلاث مرات مع ~ 0،5-1 مل برنامج تلفزيوني.
    6. عينات ما بعد الإصلاح مع PFA 4٪ + 0.2٪ GA لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (7 دقائق في كل مرة). انتقل إلى القسم 3 للتصوير أو تخزينها في ~ 0.5 ~ 1 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: إعداد العينات عند 4 درجات مئوية. استخدام PFA 4٪ + 0.2٪ GA تثبيتي للحفاظ على توزيع الفسيولوجي للphosphoinositides في PM. إعداد RT أو تثبيت مع PFA 4٪ وحدها قد يسبب القطع الأثرية الهامة (الشكل 4).

2. إعداد خلية ثقافة التصوير الخلية الحية مع mEOS3.1-PH PLC δ1

  1. إعداد DNA البلازميد ترميز δ1 mEOS3.1-PH PLC كما هو موضح سابقا 23.
  2. ثقافة INS-1 الخلايا على # 1.5 18 ملم جولة coverslips قبل المغلفة مع 30 ميكروغرام / مل فبرونيكتين حتى تصل إلى 50٪ -70٪ confluency التالية القياسية INS-1 بروتوكولات زراعة الخلايا 38،39.
  3. في اليوم التالي، transfect INS-1 الخلايا التي تحتوي على mEOS3.1-PH PLC δ1 DNA البلازميد باستخدام الحويصلية كاشف ترنسفكأيشن بعد بروتوكول للتصنيع. احتضان لمدة 48 ساعة قبل التصوير.

3. PALM الحصول على الصور من صفائح الأغشية والخلايا الحية

  1. PALM الحصول على الصور من صفائح الأغشية
    ملاحظة: هنا، والانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهر نظام SMLM أساس (النفط 100X، APO، NA = 1.49، WD 0.12 ملم) يتم استخدام 23 لجميع الحصول على الصور.
    1. قبل التصوير، وتمييع 1 ميكرولتر من محلول حبة فلوري في برنامج تلفزيوني مل 10 + 50 ملي MgCl 2. إضافة 200 ميكرولتر المخفف حل في عينات من الخلايا التي تحتوي على غرفة التصوير (من خطوات 1.1.8 / 1.2.6) لمدة 10 دقيقة. ثم، ويغسل مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    2. بدء تشغيل نظام PALM التصوير. في برنامج التصوير المرتبطة بها، حدد "قناة iRFP &# 34؛ زر (642 نانومتر ليزر الإثارة، 700/75 نانومتر الانبعاثات). العثور على غشاء الخلية التعبير عن تحقيقات PH في قناة iRFP.
      ملاحظة: يجب أن يكون ورقة غشاء حبة الفلورية في مكان قريب. هذا مطلوب لتصحيح الانحراف في وقت لاحق.
    3. استخدم زر "لقطة" لجمع صورة TIRF التقليدية من غشاء الخلية في قناة iRFP كمرجع لإعادة بناء صورة المستقبل. تعيين زاوية TIRF العادية (أي بعد الوصول إلى الزاوية الحرجة، وتحويل 1.5 درجة أخرى) عن طريق الكتابة في 2140 في TIRF زاوية وضع للتصوير. استخدام هذه الزاوية وضع لجميع الخطوات ما لم يذكر خلاف ذلك.
      ملاحظة: في نظام TIRF الموصوفة هنا، 3500 هو زاوية عمودية تصل، 2200 هي الزاوية الحرجة TIRF، و2140 هي زاوية TIRF العادية، وهو 1.5 درجة أكثر بعد TIRF الزاوية الحرجة. زاوية TIRF الضيقة المذكورة أدناه في 3.2.3 من 2120، والذي هو 2 درجة أخرى بعد التوصل TIRF الزاوية الحرجة.
    4. التبديل إلى قناة PAmCherry1 عن طريق النقر عشرالبريد زر القناة طلب تقديم العروض (561 نانومتر الإثارة، 600/50 نانومتر تصفية الانبعاثات). ضبط شريط التمرير في لوحة "AOTF" على طول الطريق إلى الحق في الحصول على إضاءة القوة الكاملة ليزر 561 نانومتر لمدة 10-20 ثانية لتبييض مضان غشاء الخلفية.
    5. تعيين إعداد الكاميرا الأمثل (2X2 binning) في "تنسيق" علامة التبويب وبروتوكول اكتساب سريع في علامة التبويب "ND تسلسل حيازة" (عادة 10،000-40،000 الصور في 20 هرتز).
    6. بدء الحصول على الصور PAmCherry1 (561 نانومتر ليزر في السلطة الكاملة، 50 ميللي ثانية / الإطار) مع تفعيل ليزر 405 نانومتر في وقت واحد على مستوى منخفض (0.1٪ - 1٪) عن طريق النقر على زر "تشغيل الآن". ضبط شدة من 405 نانومتر ليزر بحيث نقاط فردية معزولة مكانيا في كل إطار يمكن تمييزها بسهولة.
      ملاحظة: عدد الجزيئات PAmCherry1 activatable يتناقص تدريجيا خلال الاستحواذ. ينبغي زيادة 405 كثافة الليزر نانومتر تدريجيا للحفاظ على كثافة المثلى للإشارات الجزيء الفردية في كلهيكل.
    7. مواصلة الحصول على الصور حتى يتم تفعيل أي إشارة PAmCherry1 جزيء واحد.
  2. التصوير النخيل في الخلايا الحية
    1. قبل التصوير، وتمييع الخرز الفلورسنت في غرفة التصوير لمدة 10 دقيقة كما هو موضح في الخطوة 3.1.1. ثم تبدأ PALM التصوير عن طريق فتح برنامج التصوير المرتبطة بها.
      ملاحظة: استخدام الإفراج السريع غرفة التصوير المغناطيسي لتصوير الخلايا الحية. الحفاظ على وسط الميدان التصوير في 35 درجة مئوية مع وحدة تحكم في درجة الحرارة تحت نضح مستمر مع عازلة خارج الخلية (خارج الخلية الحل: 135 مم كلوريد الصوديوم، 5.6 ملي بوكل، 2.6 ملي CaCl 2، 1.2 ملي MgCl 2 و 3 ملي الجلوكوز، و 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة = 7.3).
    2. اختر زر قناة GFP (525/50 نانومتر الانبعاثات). التعرف على غشاء الخلية التعبير عن تحقيقات الفلورسنت على أساس الفلورية الخضراء من mEOS3 تحت 488 نانومتر الإثارة ليزر. تأكد من أن حبات الفلورسنت قريب مدرجة أيضا أثناء التصوير لأن هذا مطلوب في وقت لاحق لحديد الاختزال المباشر حالياتصحيح قدم.
    3. انقر على زر "لقطة" لجمع صورة TIRF من غشاء الخلية في قناة (الأخضر) mEOS3 كصورة مرجعية. استخدام الضحلة زائل إضاءة موجة الإثارة (بعد الوصول إلى الزاوية الحرجة، وتحويل 2 درجة أخرى) عن طريق الكتابة في 2120 في زاوية TIRF وضع للتصوير الخلايا الحية.
      ملاحظة: هذا يقلل من مضان من غير منضم mEos3-PH في العصارة الخلوية المتاخمة لغشاء البلازما.
    4. التبديل إلى "قناة RFP" زر (561 نانومتر الإثارة، 600/50 نانومتر الانبعاثات). استخدام كامل قوة 561 نانومتر ليزر لتبييض مضان الخلفية من ورقة الغشاء لمدة 10 ~ 20 ثانية مع شريط التمرير في "وسادة AOTF" (انظر 3.1.4).
    5. بدء الحصول على الصور من خلال النقر على زر "تشغيل الآن" في القناة الحمراء (561 نانومتر السلطة الكاملة، وضعت في 10 ميللي ثانية / الإطار في "الكاميرا" وضع علامة التبويب) مع تفعيل ليزر 405 نانومتر في وقت واحد. ضبط كثافة الليزر 405 نانومتر لتفعيل النقاط المنفصلة مكانيافي كل إطار.
      ملاحظة: كما عائدات الاستحواذ، الامم المتحدة وتحويلها-mEOS3.1-PH PLC δ1 عدد جزيء ينخفض ببطء. تدريجيا زيادة قوة الليزر 405 نانومتر لتحسين إشارة جزيء واحد. طول اكتساب التصوير يعتمد على الغرض التجريبية. الحصول على الصور بشكل مستمر لمدة 5 دقائق في الظروف العادية. إذا كنت بحاجة لشراء أطول، وجمع العديد من مداخن صورة بدلا من واحد، كومة صورة كبيرة. وينبغي ألا يتجاوز حجم ملف كل كومة صورة 4 غيغابايت أو أنها سوف تؤثر على برامج التحليل في وقت لاحق.

4. SMLM معالجة الصور والإعمار

  1. نقل ملفات الصور (. TIF مداخن صورة) إلى محطة تحليل الصور. إطلاق برنامج إعادة الإعمار صورة (مكتوبة خصيصا) في Matlab كما هو موضح سابقا (37) وتحميل كومة الصورة عن طريق النقر فوق علامة التبويب "ملف" في القائمة الرئيسية، ثم "فتح"، ثم "ملف جديد".
  2. تحديد والمحلىليز الأحداث الجزيئية الفردية من كل إطار. تعيين تصفية عتبة كثافة مع عدد عتبة (1-10) في "المويجات". تحقق من إعدادات المعلمة المثلى للكشف عن نقطة بصريا قبل عملية إعادة الإعمار. ثم انتقل إلى علامة التبويب "بالم" وانقر على "خطوة عملية واحدة" لبدء إعادة الإعمار صورة.
    ملاحظة: عتبة كثافة للكشف عن هذه النقطة هي تعسفية وتعتمد على الخبرة الشخصية. قد تكون هناك حاجة العديد من التجارب لتوليد عتبة الكشف المثلى التي لا تلتقط الكثير من غير المؤهلين (قاتمة) نقاط ولا بتصفية الكثير من المؤهلين (مشرق) نقطة. ضبط معايير أخرى لتحسين تحليل البيانات. هنا، يتم تعيين المسافة حي (نقطة مضان في إطارات المجاورة على مسافة يتم الجمع بين) إلى 65 نانومتر (1/2 عرض بكسل) وتركيبها كما جزيء واحد. إطارات الفجوة (الأحداث جزيء الفردية التي وقعت ضمن هذه الأطر وحي المسافة كانت مجتمعة ومزودة كحدث جزيء واحد) هيعلى النحو 26 لقطة (1.3 ثانية) للتصوير PAmCherry1 40. ضبط هذه المعلمة وفقا لخصائص تحقيقات جزيء واحد وسعر الشراء لتجنب الإفراط في عد 40 في SMLM. تطبيق تصحيح الانحراف مع حبات الفلورسنت خلال إعادة البناء.
    1. لتصوير الأوراق غشاء ثابتة وصفت من قبل iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1، إعادة بناء مداخن صورة كاملة من ورقة غشاء نفسها إلى فائقة الدقة صورة واحدة 37.
    2. لعينات من الخلايا الحية وصفت من قبل mEOS3.1-PH PLC δ1، فصل كومة الصورة كاملة في عدة أكوام أصغر من 1000 لقطة بحيث يتم بناؤها كومة 1،000 التوالي الإطار كصورة فائقة الدقة واحدة، والتي لديها قرار الزمني لل 10 ثانية. في النهاية، والجمع بين كل الصور السلاسل الزمنية في المرة الأخيرة سلسلة كومة 23.
      ملاحظة: في الخلية الحية التصوير نخلة، وعدد قليل من تحقيقات تنشيط قد نقل أو فصلمن PI (4،5) ف 2 في رئيس الوزراء قبل التبييض. لحساب الإفراط من تحقيقات، والجمع بين إشارات الجزيء الفردية في الأطر المجاورة ضمن 130 نانومتر (بدلا من 65 نانومتر) إلى حدث الانبعاثات واحد خلال تحليل الصور.
  3. بعد الحصول على الصور التي أعيد بناؤها، وإجراء مزيد من التحليل صورة مع برنامج مكتوب خصيصا في Matlab لقياس كثافة جزيء، والكثافة نطاق الصغير / الحجم، والتحليل العنقودي مع زوج من الترابط 41.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حالة عدم اليقين التعريب (σ) من نظام فائقة قرارنا هو 14.73 نانومتر 23. أظهرت مقارنات مباشرة بين TIRF والصور PALM تحسن كبير من القرار المكانية. ويبين الشكل 3A-B المعهد البترولي التمثيلي (4،5) ف 2 صور TIRF المسمى مع PI (4،5) ف 2 الأجسام المضادة وiRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 في أوراق غشاء النموذجية والخلايا الحية. الصور مع المجهر TIRF التقليدية في صفائح الأغشية وتتماثل مع تلك الموجودة في الخلايا الحية سليمة المسمى مع تعزيز البروتين مضان أخضر (EGFP) الموسومة المجالات PH (EGFP-PH PLCδ1) (الشكل 3C). أظهرت جميع العينات حتى توزيع تحقيقات. في المقابل، أدى تثبيت غير الأمثل للعينات في PI الكثيف الحاد (4،5) ف 2 مجموعات وانخفاض في كثافة إشارة (الشكل 4). في ظل ظروف التثبيت الأمثل، روقال انه صور فائقة الدقة من PI (4،5) ف 2 في الخلايا الثابتة (الشكل 5) كشف توزيع متجانس للتحقيقات في جزء كبير من رئيس الوزراء فقط مع التدرجات تركيز محدودة. بعض بقع غشاء المخصب مع PI (4،5) ف 2 تحقيقات وزعت قليلة، وكان أحجام مختلفة. عرض الخلية الحية PALM الصور التوزيع المكاني مماثلة لخلايا ثابتة (الشكل 6). تحليل مفصل لPI (4،5) ف 2 إشارات حول نتائج الوقت في ديناميكية سريعة في المناطق المحلية، من دون تغييرات كبيرة وفرة في مجالات واسعة.

figure-results-1
الشكل 1. مخطط لتحقيقات الفلورسنت المستخدمة في هذه الدراسة. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 التحقيق المستخدمة في التجارب ورقة غشاء ثابتة. أثناء التصوير TIRF التقليدي (A)، ونانومتر 640 يستخدم الليزر لإثارة iRFP (مثال: 692 نانومتر. إم: 713 نانومتر). TIRF الصورة التي اتخذت في هذه الحالة بمثابة صورة TIRF إشارة للتصوير فائقة الدقة التي تم الحصول عليها بواسطة التصوير PALM (B). ويستخدم الليزر 405 نانومتر إلى الصور تفعيل fluorophore PAmCherry1 ويستخدم ليزر 561 نانومتر لإثارة PAmCherry1 (مثال: 564 نانومتر. إم: 595 نانومتر) لتصوير النخلة. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 التحقيق المستخدمة في التجارب الخلية الحية. (C) أثناء التصوير TIRF التقليدية، يتم استخدام الليزر 488 نانومتر لإثارة mEOS3.1 (مثال: 506 نانومتر. إم: 519 نانومتر). (D) بعد photoconversion بواسطة الليزر 405 نانومتر، mEos3.1 يتحول إلى شكل أحمر (مثال: 573 نانومتر. إم: 584 نانومتر). والليزر 561 نانومتر يستخدم لعمليات الاستحواذ PALM الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ق / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg "/>
الشكل 2. مخطط لإعداد ورقة الغشاء من INS-1 الخلايا. (A) ضع ساترة مع الخلايا المستزرعة لأسفل على ساترة المغلفة PDL والانتظار لمدة 7 ~ 10 دقيقة على 4 درجات مئوية للسماح مرفق الخلية إلى PDL- ساترة المغلفة. (ب) انزع ساترة أعلى مع ملاقط وإصلاح ورقة الغشاء تعلق على PDL ساترة قبل المغلفة. (C) صورة العينات مع TIRFM والنخيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 3. PI (4،5) ف 2 التنظيم المكاني مشابه بين صفائح الأغشية والخلايا الحية سليمة تحت المجهر TIRF التقليدية. (أ)صورة TIRF نموذجية من صفائح الأغشية ثابتة عند 4 درجات مئوية مع PFA 4٪ و 0.2٪ GA. وصفت PI (4،5) ف 2 مع PI (4،5) ف 2 الأجسام المضادة المحددة. (ب) ورقة غشاء من الخلية INS-1 التعبير عن iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. صورة (C) TIRF اثنين من الخلايا الحية سليمة معربا عن EGFP-PH PLCδ1 على مختلف المستويات. أشرطة النطاق: (أ): 3 ميكرون. (ب) و (ج): 5 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 4. PI (4،5) ف 2 التنظيم المكاني في ورقة غشاء حساس للشروط التثبيت المشتركة. (A) ورقة غشاء ثابتة عند 37 درجة مئوية مع 4٪ PFA وحدهوصفت مع PI (4،5) ف 2 الأجسام المضادة المحددة (كما في الشكل 3A). ورقة (ب) غشاء ثابتة في RT مع PFA وحده، وصفت مع PI (4،5) ف 2 الأجسام المضادة المحددة. لاحظ أن مجموعات كثيفة من PI (4،5) ف 2 تحقيقات واضحة للعيان تحت المجهر TIRF، وعلى النقيض من أكثر من ذلك بكثير حتى الصور مضان هو مبين في الشكل 3A. أشرطة النطاق: AB: 3 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الرقم 5. PALM التصوير من PI (4،5) ف 2 تحقيقات تكشف توزيع مقياس متناهي الصغر في لPM INS-1 الخلية. (أ) صورة iRFP TIRF من ورقة الغشاء من خلية INS-1 التعبير عن iRFP-PAmCherry1-PH المجلس التشريعي الفلسطينيδ1. (ب) الموافق صورة كف PM في نفس المنطقة على أساس إعادة الإعمار إشارة PAmCherry1. لاحظ PI متجانس (4،5) ف 2 التوزيع المكاني في PM المناطق الرئيسية وعدد من PI (4،5) ف 2 microdomains. (C) وجهة نظر الموسع المنطقة محاصر في (ب). السهام تشير زعت قليلة PM microdomains المخصب مع PI (4،5) ف 2 تحقيقات. أشرطة النطاق: A و B: 3 ميكرون؛ C: 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل التصوير 6. النخيل في حي خلايا INS-1. (أ) صورة TIRF من PI (4،5) ف 2 في حي خلية INS-1 التعبير عن mEos3.1-PH PLCδ1. تم الحصول على صورة بسرعة في القناة الخضراء قبل اكتساب نخلة (35 درجة مئوية). (ب) متتابعة الخلية الحية الصور PALM في 10 فترة ثانية. تظهر الأشكال لمحات كثافة PI المحلي (4،5) ف 2 الكثافة على نفس خط مستقيم 1 موقف في أوقات مختلفة في (ب) و (ج). ملاحظة التغييرات كثافتها كبيرة المحلية في غضون 10 ثانية. (د) وقت مسار متوسط تغيرات كثافة PI (4،5) ف 2 في منطقة واسعة (box2، 3X3 ميكرون)، ودوائر صغيرة (3، 4، و 5، و 500 نانومتر قطر) في (ب) خلال 5 دقيقة من التصوير PALM (إطار / 10 ثانية). ملاحظة التقلبات كثافة السريع لPI المحلي (4،5) ف 2 المسابير (دائرة 3 و 4 و 5) بالمقارنة مع تغييرات طفيفة جدا في منطقة واسعة (مربع 2). الصور (E) الموسع PALM المنطقة box2 في الفقرة (ب) في بعض الأحيان المشار إليها. تشير الأسهم PI (4،5) ف 2 المخصب بقع غشاء تحت عشروط hysiological. أشرطة النطاق: C: 3 ميكرون، E: 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استكشاف الأخطاء وإصلاحها، تحتاج عمليتين اهتمام إضافي: إنتاج ورقة الغشاء وتثبيت عينة. كما هو موضح في البروتوكول، وفترة حضانة لل coverslips في الخطوة 1.1.6 مهم لإنتاج ورقة الغشاء. الأمثل فترة حضانة تحت ظروف تجريبية لدينا هو 7-10 دقيقة (الشكل 2). أطول من 10 دقيقة حضانة وإنتاج خلايا سليمة بدلا من صفائح الأغشية coverslips على PDL وحضانة أقصر سوف يؤدي إلى أي ورقة الغشاء على لل coverslips المغلفة PDL أقل أو. كما هو موضح في البروتوكول، ومثبتات ودرجة الحرارة أثناء تثبيت حاسمة للحفاظ على PI (4،5) ف 2 توزيع في PM. تثبيت في RT أو استخدام 4٪ -PFA وحده يمكن أن يشوه توزيع الدهون الطبيعي في PM.

من خلال تطبيق PALM المجهري لغشاء البحوث الدهون، ونحن قادرون على مراقبة توزيع نطاق نانومتر من PI (4،5) ف 2، فسفوإينوزيتيد الرئيسي الذي يتوسط مأي أنشطة الخلوية الأساسية. هذا التوزيع المكاني للPI (4،5) ف 2 مع التدرجات تركيز محدودة في INS-1 خلايا يوفر إطارا لإعادة النظر في التفاعلات دهون، بروتين والأحداث الإشارات المحلية من PI (4،5) ف 2 في هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تطبق الأساليب المتقدمة في هذا العمل لبحث غشاء فوسفورية أخرى مع تحقيقات سليمة، وبالتالي، توفير أدوات جديدة لدراسة phosphoinositides في العمليات البيولوجية.

استخدام ورقة الغشاء في هذا العمل يتجاوز اثنين من الشواغل الرئيسية في الدراسات المورفولوجية فوسفورية: العلاج المنظفات والتلوث إشارة محتملة من العصارة الخلوية. وغالبا ما تسبب المنظفات تجميع وخسائر كبيرة في إشارة PM فوسفورية. تلوث إشارة عصاري خلوي إشكالية خاصة في حالة انخفاض phosphoinositides فرة على رئيس الوزراء 23، مثل PI (3،4،5) ف 3 و PI (3،4) ف 2. عينات ورقة غشاء قادرة على التعmvent هذه المشاكل دون تعطيل كبير الهياكل المرتبطة غشاء البلازما، مثل شبكه الأكتين القشرية وحفر المغلفة بالكلاذرين 42،43. توزيع متجانس نسبيا من PI (4،5) ف 2 في رئيس الوزراء هو في اتفاق جيد مع دراسات تجميد EM سريعة أخرى باستخدام GST-PH PLC تحقيقات δ1 في غشاء الخلايا الليفية 44.

من المهم أن نلاحظ أن الظروف تجهيز العينات غير سليمة يمكن أن تولد نتائج مضللة. أولا، من المهم جدا لتنفيذ الخطوات التثبيت في انخفاض درجة الحرارة (4 درجة مئوية) واستخدام مثبت GA لإنتاج ورقة الغشاء. كما هو مبين في الشكل (3)، ودرجة الحرارة الدافئة ومنهاج العمل التثبيت دون GA لا تكفي لإصلاح phosphoinositides في الخلية PM. وهذا يمكن أن تشوه PI سليمة (4،5) ف 2 توزيع وتوليد مجموعات الحادة التي لا تراعى في الخلايا الحية في ظل الظروف الفسيولوجية. ثانيا، استخدام PAmCherry1 كماالتحقيق SMLM، بدلا من تحقيقات أخرى، أمرا حيويا من أجل التصوير PALM الكمي. صالح تطبيق PAmCherry1 تأتي من خصائصه جيدا اتسم احدة الجزيئية الصورة المادية 35،40،45، مثل السطوع، وارتفاع كفاءة الصورة تفعيل والأهم من ذلك كله، محدودة جدا الصور وامض. هذه الخصائص تمكننا من القضاء على القطع الأثرية مجموعة محتملة من الصور وامض وكميا تحليل كثافة الجزيئية من PI غشاء (4،5) ف 2.

ويتميز هذا النهج أيضا حدوده. أولا، وطريقة ورقة الغشاء المستخدمة في هذه الدراسة قد لا تحاكي تماما التوزيع الفسيولوجي للPI (4،5) ف 2 لأنه عطل الخلية قبل التصوير. ومع ذلك، يظهر لدينا التصوير PALM الحية توزيع متجانس نسبيا مماثل من PI (4،5) ف 2، ودعم النتائج الملاحظة مع عينات ورقة الغشاء. ثانيا، كما ناقشنا في الأعمال السابقة لدينا 23، SMLM يتطلب خبرة التصوير وخارج فيالاحتجاز التابعة لتفادي القطع الأثرية التصوير التي قد تنشأ من عمليات مختلفة، بما في ذلك تحقيقات المستخدمة، وإعداد العينات وتثبيت، وأخذ العينات الصورة وإعادة الإعمار. وأخيرا، على الرغم من تحقيقات والأجسام المضادة على أساس المجال PH استخدمت على نطاق واسع في الدراسات فسفوإينوزيتيد 46،47 أنه لا يزال من الممكن أن ليس كل PI (4،5) ف 2 في الغشاء يمكن الكشف عن هذا النهج. على سبيل المثال، PI (4،5) ف 2 ملزمة البروتينات الذاتية أخرى قد لا تكون في متناول تحقيقات PH أو الأجسام المضادة، وهذا قد يؤدي إلى التقليل من PI (4،5) ف 2 بسبب عائق الفضاء من تحقيق ذاتها. وهناك طريقة بديلة من (4،5) ف 2 العلامات PI أن تستخدم أعلى فلور PI (4،5) P 2 48، وPI وصفت مسبقا (4،5) ف 2 التناظرية مع تعديل على ذيل الأصلي PI (4،5) ف 2. ومع ذلك، فإنه يمكن تحويلها بسرعة إلى أنواع فرعية فسفوإينوزيتيد الأخرى عن طريق سريع استقلاب الخلية الحية منذ حلقة إينوزيتول لها هي نفس endogenouالصورة PI (4،5) ف 2. وهذا يثير قلق ما إذا كان هذا المسمى قبل PI (4،5) ف 2 التناظرية في الخلايا الحية يمكن أن تمثل بأمانة PI (4،5) ف 2 بدلا من المنتجات الأيضية لها. لذلك، على الرغم من بعض القيود، تحقيقات يستند إلى مجال PH لا تزال من بين أفضل تحقيقات التي استخدمت على نطاق واسع لمراقبة PI (4،5) ف 2 توزيع وديناميكية على رئيس الوزراء من الخلايا.

ويمكن تمديد تطبيقها في المستقبل من هذه المنهجية لدراسات فسفوإينوزيتيد أخرى، مثل PI (3،4،5) ف 3 و PI (3،4) ف 2. وباختصار، فإن نهج SMLM رواية المستخدمة هنا يفتح طرق جديدة لدراسة فسفوإينوزيتيد في الخلايا. باستخدام PI (4،5) ف 2 كمثال على ذلك، ونحن لشرح خصائص فريدة من نوعها من التصوير PALM في الدراسة المورفولوجية وكمية من جزيئات الغشاء الخلوي، فضلا عن عيوبها. هذا النهج يمكن أن تتكيف مع جزيئات أخرى من المصالح، وسيكون له تطبيقات واسعة في بيولوجيا الخلية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01DK093953 (XL) ، P30NS069271 ، BRFSG-2014-07 (XL.). CJ مدعوم جزئيا من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه الأمريكية للقلب (14PRE20380168 ، إلى CJ).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهرنيكونTi-U
sCMOS الكاميراAndorNeo
الغزل القرصيوكوغاواCSU X-1, 10,000 دورة في الدقيقة 
عالية الطاقة آلة تجميع الليزر المتجانسة SP مع ليزر 405 و 488 و 561 و 642 نانومتر.AgilentMLC400الليزر الأصلي القوى & القوى في نهاية الألياف الضوئية)
405  نانومتر: 15 ميغاواط & أمبير 13  ميغاواط;
488  نانومتر: 45 ميغاواط & أمبير 42  ميغاواط;
561  نانومتر: 45 ميغاواط & أمبير 40  ميغاواط;
640  نانومتر: 35 ميغاواط & أمبير 16  ميغاواط.
100X الهدفنيكونAPO 100X النفط ، NA 1.49 ، WD 0.12   ؛ مم
برنامج اقتناء وتحليل نيكون (عنصر NIS)نيكون
MatlabMathWorks
CoverslipWarner64-0714Round 18  غطاء مم ، # 1.5
FibronectinMilliporeFC010-5MG
Lipofectamin 3000 (كاشف تعداد)InvitrogenL3000-008
المجهرالإلكتروني Glutaraldehyde# 16120
PI (4،5) P2< / sub> 1st< / sup> الأجسام المضادةسانتا كروزsc-53412
الأجسام المضادة الثانوية  F (ab')2-الماعز المضادة للفأر Alexa Fluor 647InvitrogenA-21237
Tetraspeck الخرزInvitrogenT7279
غرفة التصوير المغناطيسي السريع  وارنر إنسترومنتسCat # 641994
وحدة التحكم في درجة الحرارةWarner InstrumentsTC-344C
Poly-D-LysineSigmaP6407
عازلة الفوسفات الملحيةSigmaP4417-100TAB
EGTASigma3780
NH4< / sub>ClSigmaA0171
مصل الماعزسيجماG9023
ألبومين مصل الأبقارسيجماA7906
كلوريد الصوديومسيجماS5886
KClسيجماP5405
CaCl2• 2H2OSigma223506
MgCl2• 6H2< / sub>OSigmaM9272
GlucoseSigmaG7021
HEPESSigmaH4034
ParaformaldyhydeSigmaP6148
علم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, 651-657 (2006).
  2. Hammond, G. R. V., et al. PI4P And PI(4,5)P(2) Are Essential But Independent Lipid Determinants Of Membrane Identity. Science. 337, New York, N.Y. 727-730 (2012).
  3. Nakatsu, F., et al. PtdIns4P synthesis by PI4KIIIalpha at the plasma membrane and its impact on plasma membrane identity. J Cell Biol. 199, 1003-1016 (2012).
  4. Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science. 296, 1655-1657 (2002).
  5. Czech, M. P. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol. 65, 791-815 (2003).
  6. Spira, F., et al. Patchwork organization of the yeast plasma membrane into numerous coexisting domains. Nat Cell Biol. 14, 640-648 (2012).
  7. Barg, S., Knowles, M. K., Chen, X., Midorikawa, M., Almers, W. Syntaxin clusters assemble reversibly at sites of secretory granules in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20804-20809 (2010).
  8. Sieber, J. J., et al. Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science. 317, 1072-1076 (2007).
  9. Knowles, M. K., et al. Single secretory granules of live cells recruit syntaxin-1 and synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) in large copy numbers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20810-20815 (2010).
  10. Milosevic, I., et al. Plasmalemmal phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate level regulates the releasable vesicle pool size in chromaffin cells. J Neurosci. 25, 2557-2565 (2005).
  11. van Rheenen, J., Jalink, K. Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale. Mol Biol Cell. 13 (2), 3257-3267 (2002).
  12. Hammond, G., Schiavo, G., Irvine, R. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinct cellular pools of PtdIns4P and PtdIns (4, 5) P2. Biochem J. 422, 23-35 (2009).
  13. Huang, S., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-rich plasma membrane patches organize active zones of endocytosis and ruffling in cultured adipocytes. Mol Cell Biol. 24, 9102-9123 (2004).
  14. James, D. J., Khodthong, C., Kowalchyk, J. A., Martin, T. F. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates SNARE-dependent membrane fusion. J Cell Biol. 182, 355-366 (2008).
  15. Laux, T., et al. GAP43, MARCKS, CAP23 modulate PI(4,5)P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 149, 1455-1472 (2000).
  16. Aoyagi, K., et al. The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdomains at syntaxin clusters. J Biol Chem. 280, 17346-17352 (2005).
  17. Kabachinski, G., Yamaga, M., Kielar-Grevstad, D. M., Bruinsma, S., Martin, T. F. CAPS and Munc13 utilize distinct PIP2-linked mechanisms to promote vesicle exocytosis. Mol Biol Cell. 25, 508-521 (2014).
  18. Wang, J., Richards, D. A. Segregation of PIP2 and PIP3 into distinct nanoscale regions within the plasma membrane. Biol Open. 1, 857-862 (2012).
  19. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
  20. van den Bogaart, G., et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions. Nature. 479, 552-555 (2011).
  21. van Rheenen, J., Achame, E. M., Janssen, H., Calafat, J., Jalink, K. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. Embo J. 24, 1664-1673 (2005).
  22. Sato, K., et al. Differential requirements for clathrin in receptor-mediated endocytosis and maintenance of synaptic vesicle pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1139-1144 (2009).
  23. Ji, C., Zhang, Y., Xu, P., Xu, T., Lou, X. Nanoscale Landscape of Phosphoinositides Revealed by Specific Pleckstrin Homology (PH) Domains Using Single-molecule Superresolution Imaging in the Plasma Membrane. J of Biol Chem. 290, 26978-26993 (2015).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  27. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339, 452-456 (2013).
  28. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat Methods. 7, 717-719 (2010).
  29. Szymborska, A., et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  30. Pertsinidis, A., et al. Ultrahigh-resolution imaging reveals formation of neuronal SNARE/Munc18 complexes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 2812-2820 (2013).
  31. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc Natl Acad Sci. 109, 13978-13983 (2012).
  32. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  33. Balla, T., Várnai, P. Visualization of Cellular Phosphoinositide Pools with GFP-Fused Protein-Domains. Curr Protoc Cell Biol. 24, 24(2009).
  34. Xu, C., Watras, J., Loew, L. M. Kinetic analysis of receptor-activated phosphoinositide turnover. J Cell Biol. 161, 779-791 (2003).
  35. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 6, 153-159 (2009).
  36. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging. Nature Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  37. Zhang, M., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 727-729 (2012).
  38. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  39. Dyachok, O., Isakov, Y., Sågetorp, J., Tengholm, A. Oscillations of cyclic AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells. Nature. 439, 349-352 (2006).
  40. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 18519-18524 (2013).
  41. Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
  42. Morone, N., et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J Cell Biol. 174, 851-862 (2006).
  43. Peters, K. R., Carley, W. W., Palade, G. E. Endothelial plasmalemmal vesicles have a characteristic striped bipolar surface structure. J Cell Biol. 101, 2233-2238 (1985).
  44. Fujita, A., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Takenawa, T., Fujimoto, T. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9256-9261 (2009).
  45. Durisic, N., Laparra-Cuervo, L., Sandoval-Álvarez, Á, Borbely, J. S., Lakadamyali, M. Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nat Methods. 11, 156-162 (2014).
  46. Thomas, C. L., Steel, J., Prestwich, G. D., Schiavo, G. Generation of phosphatidylinositol-specific antibodies and their characterization. Biochem Soc Trans. 27, 648-652 (1999).
  47. Várnai, P., Balla, T. Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains. Methods. 46, 167-176 (2008).
  48. Honigmann, A., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate clusters act as molecular beacons for vesicle recruitment. Nature Struct Mol Biol. 20, 679-686 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PI 45 P2 TIRF

مقالات ذات صلة