مقالة منهجية

تقييم سريع ومحدد من Halogenating البيروكسيد آخر في عينات الدم التخصيب خلايا الدم البيضاء

DOI:

10.3791/54484

⸱

يوليو 28, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول التخصيب السريع للكريات البيض من عينات الدم الصغيرة لتحديد محدد لاحق لنشاط البيروكسيديز المهلوجني داخل الخلايا. يمكن تطبيق الطريقة على المواد البشرية وغير البشرية وقد تساهم في تقييم علامات الالتهابات الجديدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة يوصف بروتوكول لإثراء سريع وموحد من الكريات البيض من عينات الدم كلها صغيرة. ويستند هذا الإجراء على تحلل منخفض التوتر من كريات الدم الحمراء ويمكن تطبيقها على عينات الإنسان، وكذلك للدم من مصدر غير إنساني. حجم العينة الأولي صغيرة من حوالي 50 إلى 100 ميكرولتر يجعل هذه الطريقة تنطبق على اخذ عينات من الدم المتكررة من حيوانات المختبر الصغيرة. وعلاوة على ذلك، ويتحقق تخصيب الكريات البيض في غضون دقائق ومع الجهود المواد منخفضة المتعلقة بالمواد الكيميائية والأجهزة، مما يجعل هذه الطريقة قابلة للتطبيق في بيئات المختبرات متعددة.

يتم الجمع بين تنقية موحدة من الكريات البيض مع طريقة انتقائية للغاية تلطيخ لتقييم النشاط البيروكسيديز halogenating من مستخلصات الهيم، الميلوبيروكسيديز (MPO) والبيروكسيديز الحمضات (EPO)، أي تشكيل من تحت الكلور وحمض hypobromous (HOCL وHOBr). في حين أن الخطة الرئيسية للعمليات أعرب بقوة في neut غيرrophils، والأكثر وفرة المناعي نوع من الخلايا في الدم البشري وكذلك في وحيدات، وأعرب عن انزيم ذات الصلة EPO حصرا في الحمضات. وتعالج النشاط halogenating هذه الانزيمات باستخدام فلوريسئين تقريبا HOCl- وHOBr محددة صبغ aminophenyl (APF) والبيروكسيديز الأساسي بيروكسيد الهيدروجين الركيزة. على تحليل التدفق الخلوي لاحق كل الخلايا البيروكسيديز الإيجابي (العدلات، وحيدات، الحمضات) يمكن تمييزها، ويمكن كميا نشاطهم البيروكسيديز halogenating. منذ APF تلطيخ يمكن الجمع بين تطبيق علامات سطح الخلية، وهذا البروتوكول يمكن أن تمتد إلى معالجة على وجه التحديد الكريات البيض كسور الفرعية. هذه الطريقة تنطبق على كشف HOCL وHOBr إنتاج في كل من الإنسان وفي الكريات البيض القوارض.

ونظرا للدور المناعية التي نوقشت على نطاق واسع وبتنوع هذه المنتجات الأنزيمية في الأمراض الالتهابية المزمنة، قد يسهم هذا البروتوكول إلى فهم أفضل للأهمية المناعية من مستخلصات الهيم المشتقة من خلايا الدم البيضاء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكريات البيض النوى (PMNs، وتسمى أيضا المحببة) وحيدات تمثل المكونات الخلوية الهامة من نظام المناعة الفطري في 1،2 الدم. لأنها تسهم في الدفاع الأول ضد الجراثيم وكذلك لتفعيل نظام المناعة المكتسبة والشروع في الاستجابة الالتهابية الجهازية 2-4. بعد خصوصا العدلات، النوع الأكثر وفرة من المحببة، وحيدات أيضا تسهم إلى حد كبير في التنظيم وإنهاء أحداث الالتهابية الحادة 5. لذلك قد تكون هذه الخلايا أيضا أن تلعب دورا هاما في الأمراض الالتهابية المزمنة مثل التهاب المفاصل الروماتويدي 6،7. في الواقع، والربو، ومرض مجرى الهواء التهابي مزمن، وتتميز الخلايا ضعاف الحمضات، والنوع الثاني الأكثر محببة في الدم 8. إلا أن موت الخلايا المبرمج للالمحببة وإزالة سريعة من قبل الضامة هما خطوتان أساسيتان أثناء إنهاء الخلويالتهاب 9-11.

في الخلايا المناعية المسماة اثنين من الانزيمات وترتبط ارتباطا وثيقا، وهي الميلوبيروكسيديز (الخطة الرئيسية للعمليات، العدلات وحيدات) والحمضية البيروكسيديز (EPO، الحمضات) ويمكن الاطلاع 12،13. وهذه بيروكسيديزات الهيم المرتبطة تقليديا إلى الاستجابة المناعية الخلطية لأنها يومين إلكترونيا أكسدة (الزائفة) هاليدات للفراش لا تسبب المقابلة (الزائفة) الأحماض halous التي هي معروفة لخصائص جراثيم من 14-16. في ظل الظروف الفسيولوجية MPO أساسا أشكال حمض تحت الكلور (HOCL) وhypothiocyanite (- OSCN)، في حين تتشكل حمض الأخير وhypobromous (HOBr) من خلال المكتب الأوروبي للبراءات 17-19. وتشير النتائج الجديدة أن هذا (الزائفة) نشاط انزيم halogenating قد تسهم أيضا في تنظيم الاستجابات الالتهابية وإنهاء التفاعلات المناعية 20،21. في الواقع، عرضت على إنتاج HOCL من الخطة الرئيسية للعمليات والمنتجات المشتقة منها لقمع تي خلية القاعدة الاستجابات المناعية التكيفية 22-24.

من أجل كسب المزيد من الضوء على دور مناعي من الكريات البيض من نظام المناعة الفطري في الأمراض الالتهابية المزمنة وتحديد مساهمة الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات لهذه الوظيفة الفسيولوجية قمنا بتطوير طريقة لإثراء بسرعة الكريات البيض من عينات دم صغيرة لأغراض محددة لاحق تقرير النشاط halogenating البيروكسيديز في هذه الخلايا. لاستنزاف كرات الدم الحمراء اخترنا طريقة موحدة بما في ذلك الخطوات تحلل ناقص التوتر اللاحقة مع اثنين من الماء المقطر، الأمر الذي يؤدي إلى تخصيب الكريات البيض سريع في تكاليف المواد منخفضة. لقرار لاحق من الخطة الرئيسية للعمليات halogenating والنشاط EPO تم استخدام HOCl- وHOBr محددة صبغ aminophenyl فلوريسئين (APF) 25-27. وعلى النقيض من تطبيق أساليب تلطيخ البيروكسيديز غير محددة 28،29، وهذا النهج يسمح للكشف انتقائي من النشاط halogenating البيروكسيديز، والتي غالبا ما تضعف في infl شديدammation 30،31.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم الحصول على جميع عينات الدم الإنسان من المتطوعين الأصحاء، وبروتوكول تخصيب الكريات البيض تطبيق يتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات كلية الطب في جامعة لايبزيغ. وتمت الموافقة على التجارب مع دم الفئران من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية المسؤولة (Landesdirektion سكسونيا، Referat 24)، وفقا للمبادئ التوجيهية الألمانية على رعاية الحيوانات واستخدامها.

1. إعداد التجريبية

ملاحظة: كما في إجراء تحلل منخفض التوتر لاستنزاف كرات الدم الحمراء من عينات الدم هو إجراء الوقت الحرج، وإعداد جميع التجهيزات الضرورية (على سبيل المثال، مخازن) لهذا الجزء من البروتوكول مقدما.

  1. تسمية واحدة 15 مل أنبوب الطرد المركزي للتحلل منخفض التوتر واحد أنبوب عينة 1.5 مل لاحق aminophenyl فلوريسئين (APF) تلطيخ في عينة الدم.
    1. إذا كان سيتم إجراء تخصيب الكريات البيض تحت ظروف معقمة، تنفيذ هذا الوسم تحت تدفقمربع.
  2. إعداد حوالي 12 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 10 ملم) لكل عينة. اعتمادا على ما إذا كان يتم عزل الكريات البيض تحت ظروف معقمة أم لا، وإعداد برنامج تلفزيوني إما باستخدام محلول معقم جاهز من مورد أو عن طريق إذابة أقراص برنامج تلفزيوني في الماء المقطر. تحقق من قيمة الرقم الهيدروجيني، وإذا لزم الأمر، وضبط لدرجة الحموضة 7.4 باستخدام كميات صغيرة من 0.1 M حمض الهيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم الحلول.
    1. حل أقراص برنامج تلفزيوني (انظر الجدول من المواد) في 200 مل من الماء المقطر للحصول على حل العازلة غير معقمة كافية لحوالي 16 عينة. إذا رغبت في ذلك، وتعقيم هذا الحل عن طريق الترشيح العقيمة.
  3. إعداد حوالي 1 مل هانكس محلول ملحي متوازن (HBSS) تستكمل مع الكالسيوم 2+ لكل عينة.
    1. حل 970 ملغ من الملح HBSS في 100 مل (الحجم النهائي) الماء المقطر المزدوج. قبل ملء تصل إلى الحجم النهائي، والتحقق من قيمة الرقم الهيدروجيني وتعديله لدرجة الحموضة 7.4. نظرا لقدرتها عازلة منخفضة، وإعداد هذا المخزن المؤقت الطازج كل يوم لد أداء ضبط الأس الهيدروجيني مع عناية خاصة باستخدام كميات صغيرة من 0.1 M حمض الهيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم الحلول.
      ملاحظة: محلول معقم يمكن أن تستخدم، اعتمادا على التجربة. يمكن تعقيم الحل عن طريق الترشيح العقيمة.
  4. وبالاضافة الى اثنين من المخازن، والتسمية، وإعداد أنبوب (على سبيل المثال، 50 مل أنبوب الطرد المركزي) أو قارورة (على سبيل المثال، 250 مل قياس كوب) مع الماء المقطر المزدوج لإجراء تحلل منخفض التوتر مقدما. إعداد حوالي 10 مل من الماء لكل عينة.
  5. تحضير وعاء مع الثلج المجروش ل(القسم 3) تلطيخ APF، والتي تتم على الجليد.
  6. إعداد aliquots من APF في وقت مبكر يسمح إعداد سريع للحلول العمل المستخدمة خلال تلطيخ (خطوة 3.2) وتجنب مرارا تجميد والذوبان من الحل APF.
    ملاحظة: يتم الحصول على APF عادة باعتباره 5 ملغ / مل (11.81 ملم) حل الأسهم في خلات الميثيل.
    1. تجميد aliquots من 10-100 ميكرولتر في 0.5 مل أنابيب. لAPF تلطيخ نهائييستخدم تركيز الصبغة من 10 ميكرومتر (الخطوة 3.8).

2. منخفض التوتر تحلل من الكريات الحمر

ملاحظة: نفذ الخطوات تحلل ناقص التوتر (باستثناء الخطوات الطرد المركزي) تحت مقعد تدفق الصفحي لتجنب التلوث. تنفيذ الإجراء بأكمله في درجة حرارة الغرفة. كما تحلل منخفض التوتر هو عملية حاسمة الوقت، وضبط ماصات للمياه (2 مل)، وبرنامج تلفزيوني (5 مل) بالإضافة مقدما وفتح المياه وقوارير برنامج تلفزيوني قبل بدء العملية. تخزين الحل في برنامج تلفزيوني والماء المقطر في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

  1. من كل نقل عينة الدم 100 ميكرولتر إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي المناسب.
    ملاحظة: في تجاربنا عادة ما تحتوي على عينات دم 10 U / مل من الهيبارين من أجل تجنب تجلط الدم. بعد نظرا لمصادر مختلفة من مادة العينة طبيعة وتركيز مكافحة تجلط الدم قد تختلف. وينبغي اختبار تأثيرها على تلطيخ APF التي كتبها comparجي النتائج إلى النتائج التي تم الحصول عليها من عينات الدم تستكمل مع أنواع أو تركيزات مكافحة تجلط الدم الأخرى.
  2. إضافة 2 مل من الماء المقطر وتخلط العينات باستخدام خلاط دوامة تعيين إلى مستوى متوسط. احتضان هذه العينات لمدة 60 ثانية، ثم يضاف 5 مل PBS لكل عينة وتخلط باستخدام خلاط دوامة.
    ملاحظة: ما يصل إلى حوالي 5 عينات يمكن أن تكون مستعدة بشكل متواز. الحفاظ على نموذج النظام نفسه لإضافة الماء وبرنامج تلفزيوني لتحقيق حضانة مرات مقارنة.
  3. بعد تجديد الظروف متساوي التوتر عن طريق برنامج تلفزيوني إضافة (الخطوة 2.2) بيليه خلايا سليمة المتبقية في جميع العينات بواسطة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة و 450 ز س.
  4. إزالة طاف بصب قبل أن تتحول إلى سلة المهملات الجدول. إزالة كسائل أكبر قدر ممكن من أنبوب للقلب الطرد المركزي والاستفادة من فتح على منشفة ورقية. تأكد من أن بيليه خلية جافة قدر الإمكان.
  5. كرر الإجراء تحلل منخفض التوتر كما هو موضح من قبل (الخطوة 2.2).
    NOTE: من حيث المبدأ هذا الإجراء تحلل منخفض التوتر (الخطوات 2،3-2،5) قد يتكرر أكثر من مرة، وهذا يتوقف على نقاء جزء الكريات البيض المختلطة التي يمكن الحصول عليها. بعد سنتين تحلل الخطوات حصة المتبقية كريات الدم الحمراء في جزء الخلية المختلطة التي تم الحصول عليها عن 25٪.
  6. بيليه خلايا سليمة المتبقية بواسطة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة و 450 ز س. إزالة طاف (راجع الخطوة 2.4). إضافة 500 ميكرولتر HBSS لبيليه وحل برفق حتى يتم الحصول على حل متجانسة. نقل كل عينة إلى أنبوب عينة 1.5 مل المسمى وفقا لذلك.
  7. اعتمادا على تجربة تحليل مباشرة العينات التي تم الحصول عليها (على سبيل المثال، عن طريق التدفق الخلوي) 25، وصمة عار مع الأجسام المضادة مضان المسمى (لتحديد أنواع وحيدة الخلية) 32، واحتضان مع المثيرات الخلوية (للتجارب تنشيط الخلايا) 33 أو تخزينها على الجليد واستخدام في وقت لاحق. اعتمادا على الهدف من هذه الدراسة، نفذ فورا تجارب لاحقة علىجزء الكريات البيض مختلطة منذ المحببة لديهم قصيرة نسبيا نصف عمر حوالي 20 ساعة.
    ملاحظة: هذا ينطبق أيضا على تلطيخ النشاط البيروكسيديز هو موضح أدناه.

3. Halogenating البيروكسيد آخر تلطيخ

ملاحظة: HOCl- وHOBr الإنتاج من قبل بيروكسيديزات الهيم المشتقة من الدم الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات وكميا باستخدام APF، الذي يتأكسد إلى فلوريسئين من الأحماض hypohalous اسمه. لذلك إذا تم تنفيذ وسم الخلية مع الأجسام المضادة المسماة مضان في تركيبة مع APF تلطيخ، وتجنب fluorophores التي تتداخل مع إشارة انبعاث فلوريسئين.

  1. أداء APF تلطيخ في 4 درجات مئوية على الجليد.
  2. لإعداد حل العاملة من APF ذوبان الجليد قسامة المناسبة للصباغة (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر، 11.81 ملم) وتمييع مع HBSS بالضبط 1 ملم (على سبيل المثال، إضافة 108.1 العازلة ميكرولتر إلى ميكرولتر 10).
    1. لكل عينة (500 ميكرولتر حل الخلية) إعداد 5 μلتر من محلول العمل APF وصفها. وفقا لذلك، استخدم واحد 10 قسامة ميكرولتر من APF (11.81 ملم)، والتي ينتج 118.1 ميكرولتر حل APF العمل (1 ملم) لإعداد حوالي 20 عينة. بسبب فقدان أثناء pipetting لإعداد حوالي 10٪ أكثر APF حل العملية من حساب.
  3. من أجل التحقق من خصوصية البيروكسيديز من تلطيخ APF، وإعداد العينات التحكم مع هيدرازيد الهيم البيروكسيديز المانع 4-أمينو حمض (4 أباه) 35.
    1. إعداد محلول المخزون 1 M من 4 أباه (151.17 جم / مول) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) عن طريق تمييع 75.6 ملغ 4 أباه في 500 ميكرولتر المذيبات. وعلاوة على ذلك تمييع 4 أباه 10/01 في HBSS.
  4. لإعداد حل H 2 O 2 عمل تسمية اثنين من 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي مع "70 مم H 2 O 2" و "7 مم H 2 O 2"، على التوالي.
    1. في أنبوب المسمى "70 مم H 2 O 2"، حديثا تمييع 10 ميكرولترالحل الأسهم 30٪ (8.8 ملم) من H 2 O 2 باستخدام 990 ميكرولتر الماء المقطر للحصول على تركيز من حوالي 88 ملم. تخزين على الجليد واستخدامها داخل 4 ساعات.
      ملاحظة: H 2 O 2 يتم تسليم عادة ما 30٪ حل الأوراق المالية من قبل الموردين. عند تخزينها في 4 درجات مئوية، وأنها مستقرة لمدة 3 سنوات. أداء التخفيفات من H 2 O 2 في الماء المقطر لتجنب التحلل. ويمكن أيضا أن يكون مستعدا H 2 O 2 التخفيفات في 0.1 حل M هيدروكسيد الصوديوم.
    2. لتحديد H المحدد 2 O 2 تركيز إعداد تخفيف مزيد من 1 إلى 10 من H الأول 2 O 2 حل سهم (حوالي 88 ملم) وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من هذا الحل إلى 900 ميكرولتر من الماء المقطر في أنبوب 1.5 مل المسمى "7 مم H 2 O 2".
    3. تسجيل الطيف في المدى القريب للأشعة فوق البنفسجية (على سبيل المثال، 200-300 نانومتر) باستخدام photospectrometer أشعة فوق البنفسجية فيس واستخدام الامتصاصية في 240 نانومتر (49؛ 240 = 34 م -1 سم -1) لتحديد H الفعلي تركيز 2 O 2 في H الثاني 2 O 2 حل الأوراق المالية 34. ضمان كفيت إشارة تحتوي على الماء فقط المقطر. لcuvettes استخدام الكوارتز قياس كما هو مسجل طائفة في نطاق الأشعة فوق البنفسجية.
    4. من هذه النتيجة، وحساب تركيزات بالضبط كل الحلول الأسهم H 2 O 2. ضبط تركيز المحلول الأول في "70 مم H 2 O 2" عينة أنبوب بالضبط 70 ملم عن طريق إضافة كمية مناسبة من الماء المقطر. تخزين حل العمل الحصول على الجليد واستخدام في غضون ساعة واحدة.
  5. إضافة 5 ميكرولتر من محلول 4 أباه العمل (100 ملم) للعينات مناسبة لتركيز النهائي من 1 ملم. احتضان هذه العينات لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة قبل APF بالإضافة.
  6. إضافة 5 ميكرولتر حل APF العمل (1 ملم) على كل500 عينة ميكرولتر للحصول على تركيز الصبغة النهائي من 10 ميكرومتر. خلط العينات بلطف (على سبيل المثال، باستخدام خلاط دوامة على الإعداد المتوسط)، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. إضافة 5 ميكرولتر H حل العاملة 2 O 2 (70 ملم) لكل عينة ميكرولتر 500 لتركيز النهائي من 700 ميكرومتر. المزيج بلطف العينات واحتضان لهم لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إجراء قياسات المراقبة المناسبة في نفس الوقت.
    وأظهرت قياسات تحكم أن 700 ميكرومتر H 2 O 2 ليست سامة للخلايا: ملاحظة. كما لم يلحظ أي الاستجابات الخلوية الهامة.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تنفيذ تلطيخ APF بحذف إضافة H 2 O 2، اعتمادا على مسألة علمية. في غياب بيروكسيد الهيدروجين يتحدد فقط MPO الكلورة القاعدية والنشاط EPO في حين أن إضافة H 2 O 2 يسمح للكشف الأقصى HOCL وHOBr إنتاج الخلايا. تانه يعني الأخير إشارة الفلورسنت أعلى بكثير.
  8. لالتكوير الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 ز س. تماما إزالة طاف دون تدمير بيليه وإضافة 250 ميكرولتر HBSS إلى resuspend الخلايا.
    ملاحظة: هذه العينات هي الآن جاهزة للتحليل عن طريق التدفق الخلوي 25.
  9. تخزين العينات في الظلام حتى تحليل لتجنب التبييض. بعد الإثارة في 480-490 نانومتر كشف عن انبعاث فلوريسئين في حوالي 525 نانومتر 37.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما ذكرت سابقا الطريقة المذكورة أعلاه تبين أن تنطبق على كل من الإنسان والمواد غير البشرية 32. وعلاوة على ذلك كما هو مبين بالنسبة للفئران مع أعراض الربو قد يكون تلطيخ APF أداة مناسبة للكشف عن الاختلافات في وضع النظامية الموالية للالتهابات. لذلك في دراسة لاحقة استخدمنا هذا البروتوكول لتقييم مرارا النشاط halogenating من الخطة الرئيسية للعمليات (وايبو) في إناث فئران الظلام الأغوطي مع التهاب المفاصل الناجم عن البريستينات (PIA)....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم البشري عزل الخلايا البيروكسيديز الإيجابي يركز كثير من الأحيان إلا على هذه الخلايا ويتضمن الفصل العدلات من الكريات البيض الأخرى عن طريق التدرج الكثافة الطرد المركزي 38. ولكن كما العدلات أقل وفرة في عينات دم الفئران 39 لأساليب أكثر تعقيدا الأخيرة لا بد من استخدامها 40. وعلاوة على ذلك يؤدي كلا الطريقتين أيضا إلى إزالة حيدات-البيروكسيديز إيجابي من العينات، ونظرا لحاجة كميات الدم الكبيرة (على سبيل الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح هذا العمل ممكنا بتمويل من الوزارة الفيدرالية الألمانية للتعليم والبحث (BMBF, 1315883) وكذلك من خلال مشروع Sächsische Aufbaubank (SAB) 100116526 بتمويل من صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي (ERDF).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المواد / المعدات < / em >
15 مل أنابيب الطرد المركزيVWR / Corning734-0451-1.5
مل أنابيب عينة VWR/ Eppendorf211-2130DE-Pipettes
لأحجام تصل إلى 5 ملEppendorf< em > على سبيل المثال < / em> ، 3120000070نحن نستخدم ماصات Eppendorf Resarch plus بأحجام قابلة للتعديل في النطاق 1-10 & micro; لتر ، 10-100 ومايكرو ؛ لتر ، 100-1,000 وميكرو ؛ ل 500-5,000 & مايكرو; ل
مقعد التدفق الصفحيالحراري الإلكترون CorperationHeraSafe-Vortex
خلاطبندر & Hobein AGVortex Genie2-Tabletop
أجهزة الطرد المركزيKendro Laboratory ProductsLaborfuge 400Rيجب أن تكون أجهزة الطرد المركزي قابلة للاستخدام عند 450 × جم
أجهزة طرد مركزي صغيرةEppendorf5415Dيجب أن تكون أجهزة الطرد المركزي قادرة على استخدامها في 400 × جم
حاضنةHeraeuscytoperm 2الإعدادات: 37 درجة ؛ C ، 95٪ رطوبة ، 5٪ CO2< / sub> المحتوى
UV-Vis مقياس الطيف الضوئيVarianCary 50 bioيجب تسجيل طيف بين 200 و 300 نانومتر. وبالتالي يجب تطبيق كوفيت الكوارتز
مقياس التدفق الخلويBecton ، DickinsonBD Facs Caliburاستخدام أي مقياس خلوي للتدفق مزود بليزر مناسب لإثارة الفلورسين ( على سبيل المثال < / em > ، ليزر الأرجون 488 نانومتر)
<قوي>الاسم< قوي><قوي>الشركة رقم الكتالوجComments
Chemicals< / em>
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)amrescoK812، جاهز للاستخدام
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Sigma-AldrichP4417للحل في 200 مل من الماء
الملي المسام محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) مع Ca2 + < / sup>Sigma-AldrichH1387970 مجم / 100 مل ، تحقق بعناية واضبط قيمة الأس الهيدروجيني على 7.4
حمض الهيدروكلوريكميرك ميليبور1.09057.10001 م محلول
هيدروكسيد الصوديومRiedel-deHa ë ؛ ن30620الكريات الصلبة. للحصول على محلول 1 م حل 4 جم / 100 مل ماء ميليبور
أمينوفينيل فلوريسينكايمان10157محلول 5 مجم / مل (11.81 مليمتر) في أسيتات الميثيل ، الكميات ( على سبيل المثال < / م > 100 & ل) يجب تحضيرها وتخزينها عند -20 درجة ؛ C
بيروكسيد الهيدروجينSigma-AldrichH1009يتوافق محلول المخزون بنسبة 30٪ هذا مع تركيز حوالي 8.8 M. يجب تحضير المزيد من التخفيفات طازجة في الماء المقطر مباشرة قبل الاستخدام وقياسها كميا عن طريق قياسات الامتصاص
4-حمض أمينوبنزويك هيدرازيد (4-ABAH)Sigma-AldrichA41909يجب تحضير محلول مخزون أول من 1 متر في DMSO ، ومحلول ثان 100 ملي مولار × 1:10 التخفيف في المواد الكيميائية HBSS
DMSOVWR23500.26-
يمكن أقراص

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314(2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

APF

مقالات ذات صلة