يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

7.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54486

⸱

سبتمبر 5, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Virus-Cell Interactions Laboratory, Lady Davis Institute for Medical Research, 2Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 3Department of Medicine, McGill University

في هذه المقالة

ملخص

يتم وصف طرق تقييم فعالية وسمية جزيئات الحمض النووي الريبي التي تستهدف خطوات ما بعد التكامل لدورة النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية -1. هذه الطرق مفيدة لفحص الجزيئات الجديدة وتحسين شكل الجزيئات الموجودة.

الملخص

علاجات الحمض النووي الريبي الصغيرة التي تستهدف خطوات ما بعد التكامل في دورة تكاثر فيروس نقص المناعة البشرية -1 هي من بين أفضل المرشحين للعلاج الجيني ولديها القدرة على استخدامها كعلاجات دوائية لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1. تشمل مثبطات ما بعد التكامل الريبوزيمات ، والحمض النووي الريبي القصير (sh) ، والحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (si) ، والحمض النووي الريبي التداخل U1 (U1i) ، ومبتامر الحمض النووي الريبي. تم تحديد العديد من هذه الفحوصات باستخدام فحوصات التعداء المشتركة العابرة مع بلازميد تعبير فيروس نقص المناعة البشرية -1 وتقدم بعضها إلى التجارب السريرية. بالإضافة إلى مقاييس الفعالية ، تم تقييم الحمض النووي الريبي الصغير لقدرتها على التأثير على التعبير عن الحمض النووي الريبي البشري ، وتغيير نمو الخلايا و / أو التمايز ، واستنباط الاستجابات المناعية الفطرية. في البروتوكولات الموضحة هنا ، يتم وصف مجموعة من فحوصات التعدي العابرة المصممة لتقييم فعالية وسمية جزيئات الحمض النووي الريبي التي تستهدف خطوات ما بعد الاندماج في دورة النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية -1. لقد استخدمنا هذه المقايسات لتحديد الريبوزيمات الجديدة وتحسين تنسيق shRNAs و siRNAs التي تستهدف الحمض النووي الريبي HIV-1. توفر الطرق مجموعة سريعة من المقايسات المفيدة لفحص الحمض النووي الريبي الجديد المضاد لفيروس نقص المناعة البشرية -1 ويمكن تكييفها لفحص مثبطات ما بعد الاندماج لتكرار فيروس العوز المناعي البشري -1.

المقدمة

وجود قيود على HIV-1 العلاجات الحالية هو أنها يجب أن تدار بشكل مزمن لمنع تطور المرض. زرع HIV-1 مقاومة T اللمفاوية، أو الخلايا الجذعية المكونة للدم، لديه القدرة على توفير مراقبة طويلة المدى من فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها في غياب العلاج بالعقاقير 1،2 و قد يكون أيضا نهج فعال لتحقيق لعلاج HIV-1 3. طريقة واحدة لجعل خلايا مقاومة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها هي لادخال واحد أو أكثر من الجينات الترميز لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا أو الببتيدات إلى خلايا الفرد المصاب خلال زرع ذاتي 4. وقد صممت مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الجينات العديد من مرشح مع بعض التجارب السريرية التي تدخل في مجموعات من اثنين أو ثلاثة 5 6، لمنع تطور HIV-1 مقاومة أي جين واحد.

مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا هي من بين أكبر المرشحين للالجمع بين العلاج الجيني نظرا لقدرة منخفضة على الحصول على ردود المناعة ولأنهموكتب من تسلسل الجينات قصيرة جدا. وقد صممت بعض مضادات HIV-1 الرنا لاستهداف دخول الفيروس والتكامل. ومع ذلك، فإن معظم لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا تستهدف خطوات ما بعد التكامل في دورة حياة الفيروس (الشكل 1). وتشمل مثبطات بعد التكامل الرنا شرك، واستهداف HIV-1 البروتينات التنظيمية تات أو القس 1، والرنا القائم على العقاقير استهدفت مواقع مختلفة في HIV-1 الحمض النووي الريبي، مثل الريبوزيمات 7، 8 shRNAs وU1i الرنا 9. وتشمل الأساليب التي استخدمت لمقارنة فعالية مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1-الرنا رصد تكاثر الفيروس في الخلايا transduced مع جينات ترميز لالرنا مرشح وقياس الانتاج الفيروسية في الخلايا transfected عابر مع البلازميدات التعبير عن الرنا مرشح والتعبير البلازميد HIV-1 10 -13. لقد كانت تستخدم في السابق لإنتاج فحص HIV-1 لفحص HIV-1 الحمض النووي الريبي للمواقع المستهدفة إنزيم الحمض النووي الريبوزي جديد 13-15. ومنذ ذلك الحين تم تنقيح هذه الأساليب لتحسين شكل من RNAتدخل جزيء أعرب عن البلازميد باعتبارها shRNA أو تسليمها باعتبارها سيرنا الاصطناعية (16). الفحص يقيس إنتاج الفيروسات الناضجة من خلايا 293T الإنسان الكلى الجنينية (كلوة)، ويمكن استخدامها لمقارنة آثار مثبطات التي تستهدف الخطوات في مرحلة ما بعد الاندماج في دورة النسخ المتماثل HIV-1 (الشكل 1). لمثبطات التي تستهدف خطوات ما قبل الاندماج، وهناك حاجة إلى فحوصات بديلة مثل-تزم BL خلية العدوى فحص 17 لتقييم فعالية المضادة للفيروسات.

وتشمل مخاوف تتعلق بالسلامة الرئيسية لإيصال مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا في العيادة المحتملة الآثار بعيدا عن الهدف على الرنا أو البروتينات الإنسان، وتفعيل أجهزة الاستشعار المناعية الفطرية. لتقييم سمية مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرناوات siRNAs، وقد استخدمنا مقايسة بقاء الخلية في خطوط مختلفة من الخلايا 16. نحن أيضا قياس تفعيل مزدوجة أجهزة الاستشعار المناعة الحمض النووي الريبي RNA، RNA تنشيط بروتين كيناز R (PKR) وتول مثل مستقبلات 3 (TLR3)، فضلا عن السابقالضغط وللفيروسات تحفيز الجينات، P150 ADAR1. هذه المقايسات يمكن استخدامها للتأكد من فعالية لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا لا يرجع إلى الآثار غير المباشرة على بقاء الخلية أو تفعيل جهاز الاستشعار المناعي. كما أنها مفيدة في استبعاد الرنا مرشح مع سمية محتملة من مزيد من التطوير.

في البروتوكولات التالية، الإجراءات الخاصة بتحديد الرنا علاجية جديدة وتحسين توصف شكل القائمة. طرق مفيدة لفحص الحمض النووي الريبي تستند مثبطات بعد دمج HIV-1 تكرارها ويمكن تكييفها لفحص مثبطات بعد التكامل الأخرى، مثل الجزيئات الصغيرة التي تستهدف القس تصدير بوساطة من الحمض النووي الريبي الفيروسي 18 أو كريسبر / نظم كاس مصممة لاستهداف متكامل HIV-1 الحمض النووي (19).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. خلايا وتعداء

  1. ثقافة خلايا كلوة 293T في المتوسط ​​النسر تعديل Dulbecco و(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. إعداد تعليق 2 × 10 5 خلية / مل في مستنبت الخلية. إضافة 500 و 100 و 1000 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر من 24-جيدا، 96-جيدا و12-جيدا لوحات، لإنتاج الفيروسي، وبقاء الخلية والمقايسات تفعيل جهاز المناعة، على التوالي (الشكل 2A).
  2. دوامة بلطف لوحات واحتضان لهم O / N عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تنمو الخلايا إلى 50-70٪ confluency.
  3. وفقا لخطة ترنسفكأيشن، وإعداد التخفيفات من الرنا اختبار وضوابطها في 1.5 أنابيب متناهية الصغر مل (مثال، الشكل 2B).
    1. لفحص الانتاج الفيروسية، وإعداد 10 نانوغرام / ميكرولتر التخفيف من تعبير البلازميد HIV-1 وإضافة 10 ميكرولتر إلى كل أنبوب. بجانب إعداد 5 ميكرومتر التخفيفات من الرنا اختبار ومراقبة RN سلبيA. اضافة 2.5 أو 10 ميكرولتر من كل RNA اختبار ومراقبة تخفيف السلبي للأنابيب المقابلة لمدة 25 أو 100 تركيزات النهائي نانومتر.
    2. من أجل بقاء فحص الخلية، وإعداد 5 ميكرومتر التخفيفات من الرنا اختبار و 10 ملغ / مل تخفيف من الحمض النووي الريبي السيطرة إيجابي، وانخفاض الوزن الجزيئي بولي الأول: C. إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي اختبار أو إيجابية التخفيفات السيطرة RNA للأنابيب الموافق ل 100 نيوتن متر أو 200 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، على التوالي.
    3. لتفعيل الفحص المناعي، إضافة 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي اختبار أو التخفيفات RNA مراقبة إيجابية أعدت في الخطوة 1.3.2. للأنابيب الموافق ل 100 نيوتن متر أو 200 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، على التوالي.
      ملاحظة: للحصول على البلازميدات التعبير اختبار الحمض النووي الريبي، وإعداد 10 نانوغرام / التخفيفات ميكرولتر بدلا من 5 ميكرومتر التخفيفات من الرنا اختبار، وإعطاء كميات النهائية بين 25 و 100 نانوغرام للخطوة 1.3.1. و 100 نانوغرام لخطوات 1.3.2. و1.3.3.
  4. إضافة 50، 25 أو 75 ميكرولتر من DMEM إلى كل أنبوب ترنسفكأيشن للهمز الفيروسيuction، بقاء الخلية والمقايسات تفعيل جهاز المناعة، على التوالي. لفحوصات الإنتاج الفيروسية، وجلب الخلايا وأنابيب ترنسفكأيشن مستعدة ل3 (BSL3) مختبر مستوى السلامة الحيوية قبل الخطوة التالية.
  5. إضافة 2 ميكرولتر من بالتتابع ترنسفكأيشن كاشف للأنابيب ترنسفكأيشن واحتضان 15-20 دقيقة للسماح المجمعات لتشكيل. انظر جدول المواد للكاشف ترنسفكأيشن محددة لاستخدامها.
  6. يضاف خليط ترنسفكأيشن كامل من كل أنبوب الصغير الإفلات من الحكمة أن المواقف المقابلة في لوحات ثقافة الخلية. دوامة بلطف واحتضان لوحات لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  7. قياس (القسم 2) HIV-1 الإنتاج، وبقاء الخلية (المادة 3)، وتنشيط جهاز المناعة (القسم 4) في لوحات ثقافة الخلية (الشكل 2C).

2. فحص الإنتاج الفيروسية

  1. إزالة 24 لوحات جيدا ثقافة خلية من الحاضنة ودوامة بلطف لوحات داخل خلية ثقافة BSL3الغطاء. نقل 150 ميكرولتر من طاف من كل بئر إلى المقابلة بشكل جيد في أسفل لوحة 96-جيدا مسطحة، والتي سوف تستخدم لقياس إنتاج HIV-1.
    ملاحظة: وتشتمل هذه المقايسات الكمي الفيروسي قياس التعبير عن بروتين قفيصة HIV-1 (P24) بواسطة انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) 20، قياس RNA الفيروسي عن طريق النسخ العكسي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-PCR) 21 وقياس النشاط الإنزيم RT HIV-1. الخطوات 2،2-2،5 شرح أساليب لقياس HIV-1 النشاط RT 13،15،16.
  2. نقل 5 ميكرولتر من طاف إلى الآبار المقابلة في لوحة 96-جيدا، التي تحتوي على 25 ميكرولتر من تعطل الفيروسي كوكتيل 15 (الجدول 1). احتضان الخليط لمدة 5 دقائق على RT ونقل لوحة إلى محطة عمل النشاط الإشعاعي.
    ملاحظة: الخطوة 2.2. هو ضروري فقط إذا كان محطة العمل الإشعاعي غير متوفر في المختبر BSL3. إذا كانت لوحات لا بد من إزالتها منBSL3 المختبر، انتقل إلى الخطوة 2.3. وإضافة 50 ميكرولتر من الإشعاعي / الفيروسية اختلال كوكتيل (الجدول 1) بدلا من 25 ميكرولتر من الكوكتيل المشعة.
  3. إعداد المشع كوكتيل 15 (الجدول 1)، وإضافة 25 ميكرولتر من كل بئر من طاف الفيروسي وكوكتيل انقطاع. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  4. بقعة 5 ميكرولتر من خليط التفاعل على الساحات المقابلة في الألياف الزجاجية دي الأثيل الأمينية الإيثيلي (DEAE) ورقة filtermat والسماح للبقع لتجف لمدة 10 دقيقة. بقعة خليط التفاعل على كل مربع آخر بحيث لا العينتين الحدود مباشرة بعضها البعض. وهذا يساعد على تجنب انتقال أكثر من بين العينات عند تحديد التهم لكل دقيقة (CPM) في الخطوة 2.6.
  5. غسل أوراق 5X لمدة 5 دقائق مع العازلة 2X المالحة سيترات الصوديوم (SSC) (الجدول 1)، تليها اثنين 1 يغسل دقيقة مع 95٪ من الإيثانول. السماح للأوراق حتى يجف وختم لهم في أكياس عينة.
  6. كليب أكياس عينة التعاونntaining ورقة filtermat إلى الكاسيت وإدراج الكاسيت في عداد صفيحة التلألؤ. تعيين العداد لقراءة نسخة في الدقيقة 32 P مع التاريخ المرجعي ينص على دفعة من [32 ف] dTTP المستخدمة في التجربة. تحديد أي عينات لقراءة باستخدام خريطة لوحة وبدء العداد.
  7. للحصول على أي طريقة القياس الكمي الفيروسي، وتقسيم القيم التي تم الحصول عليها عن كل RNA اختبار بواسطة جهاز التحكم السلبية المجاورة وتتضاعف هذه القيمة 100 للحصول على تثبيط في المئة من إنتاج HIV-1 عن كل تكرار من الرنا الاختبار. وتقدم مثالا على النتائج مقارنة الرنا اختبار مختلفة بتركيزات مختلفة في الشكل (3).

3. خلية الجدوى الفحص

  1. إزالة لوحات 96-جيدا من الحاضنة وإضافة 20 ميكرولتر من 5 ملغ / مل الإنتقالي العسكري (3- [4.5-ثنائي ميثيل-2-thiazolyl] بروميد -2،5-ثنائي-2H-نتروبلو) المخفف في الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و( DPBS) إلى كل بئر. احتضان لوحات وأو 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. إضافة 150 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المحمضة مع المنظفات (1٪ NP-40، 4 ملم حمض الهيدروكلوريك في الأيسوبروبانول) إلى كل بئر واحتضان لوحات لمدة 2 ساعة على RT.
  3. تحديد الامتصاصية في 570 نانومتر في معمل صفيحة.
  4. حساب التمثيل الغذائي الإنتقالي العسكري النسبي لكل عنصر تحكم واختبار الحمض النووي الريبي إيجابي بقسمة القيمة التي تم الحصول عليها لكل عينة من سيطرتها ترنسفكأيشن المجاورة. وقدمت مثالا على النتائج مقارنة الرنا الاختبار المختلفة، ومراقبة إيجابية في الشكل (4).

4. المناعي تفعيل الفحص

  1. إزالة لوحات 12-جيدا من الحاضنة ونضح وسائل الإعلام الثقافة. يغسل بلطف الخلايا مرتين مع DPBS وإضافة 70 ميكرولتر من العازلة تحلل الباردة 22 (بما في ذلك البروتيني والفوسفاتيز مثبطات، الجدول 1) إلى كل بئر. احتضان لوحات لمدة 10 دقيقة على الجليد.
  2. نقل لست] الخلية لأنابيب متناهية الصغر وتجميدها بسرعة بغمرالأنابيب في النيتروجين السائل. السماح للعينات لذوبان الجليد وكرر لمدة 2 دورات تجميد ذوبان الجليد ليصبح المجموع 3.
  3. الطرد المركزي لست] لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، 15700 x ج، لتكوير الحطام الخلية. طاف لنقل أنابيب متناهية الصغر جديدة وتحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة Coomassie الأزرق (برادفورد) 23،24.
  4. حل 75 ميكروغرام من البروتين من كل عينة في 10٪ تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد ونقل إلى غشاء النيتروسليلوز كما هو موضح سابقا 25،26.
  5. بعد الكهربائي ونقل إلى غشاء، تكشف عن عصابات بروتين التي يحتضنها الغشاء في الشقائقية S (الجدول 1) لمدة 1 دقيقة تليها الغسيل في الماء المقطر مزدوجة. استخدام الموجات وسلم البروتين كدليل لقطع الغشاء في 80 و 55 كيلو دالتون.
    ملاحظة: في خطوة يمكن تشغيل 4.4 العينات على 16 × 18 سم 2 المواد الهلامية وصولا إلى 34 كيلو دالتون، بحيث يكون من السهل قطع الغشاء في مواقف محددة، وليس من خلال خفضعصابات من الفائدة. بدلا من ذلك، يمكن تشغيل عدة المواد الهلامية مع نفس العينات لتجنب قطع الغشاء.
  6. تغسل تلطيخ الشقائقية S مع مخزنة المالحة تريس التي تحتوي على 0.05٪ توين 20 (TBST، الجدول 1). إضافة TBST مع 5٪ الحليب الخالي من الدسم لتغطية كامل الأغشية. احتضان الأغشية في RT مع الانفعالات لمدة 1 ساعة.
  7. احتضان الأغشية O / N في TBST مع 3٪ زلال المصل البقري (BSA) والأجسام المضادة المخفف إلى 1 في 1000 ضد ADAR1 (110 و 150 كيلو دالتون)، الفوسفات، PKR (62 كيلو دالتون)، والفوسفات، IRF3 (47 كيلو دالتون)، لقطع رأس والمتوسطة والسفلية للغشاء، على التوالي.
  8. غسل الأغشية 5X لمدة 5 دقائق مع TBST واحتضان في TBST مع 5٪ الحليب الخالي من الدسم والماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية المسمى البيروكسيديز (المخفف إلى 1 في 5000) لمدة 1 ساعة.
  9. غسل الأغشية 5X لمدة 5 دقائق مع TBST وتطبيق electrochemiluminescence (ECL) حل لتصور العصابات على الأفلام وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  10. بعد تصور العصابات البروتين على الأفلام، وغسل القطع المتوسطة والسفلية من الغشاء لمدة 10 دقيقة مع الحل الضد تجريد. احتضان الأغشية O / N في TBST مع 3٪ BSA والأجسام المضادة ضد مجموع PKR (في 1 في 500) وIRF3 (في 1 في 1000)، للوسط وقطع أسفل، على التوالي. كرر الخطوات من 4.8. و 4.9. باستخدام المسمى البيروكسيديز الماعز المضادة للماوس في مكان الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرنب لغشاء PKR (وسط).
  11. غسل أسفل قطعة من 5X غشاء لمدة 5 دقائق مع TBST واحتضان الغشاء في TBST مع 3٪ BSA لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة ضد الأكتين (المخفف إلى 1 في 5000). كرر الخطوات من 4.8. و 4.9. باستخدام المسمى البيروكسيديز الماعز المضادة للماوس في مكان الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرنب. وتقدم مثالا على النتائج مقارنة الرنا الاختبار المختلفة، ومراقبة إيجابية في الشكل (5) انظر جدول المواد للأجسام مضادة محددة لاستخدامها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد التخطيطي العام للإجراءات في الشكل 2 مع خطة ترنسفكأيشن سبيل المثال لمدة ثلاثة الرنا اختبار والحمض النووي الريبي الرقابة المنصوص في الشكل 2B. لفحوصات الإنتاج وبقاء الخلية الفيروسية، والتدريجي قراءة لكل بناء الاختبار هو تطبيع للسيطرة سلبية. و transfected مكررات في مجموعات، بحيث يتم تطبيع كل RNA اختبار لسيطرتها السلبية المجاورة. ويتم ذلك لتجنب عدم دقة البيانات المتعلقة الوقت بين كومبليكسينج وترنسفكأيشن، مما قد يؤد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تنفيذ إنتاج فحص HIV-1 صفها باستخدام خلايا HEK293T (الشكل 2) ومشابه لفحوصات المستخدمة لفحص HIV-1 الحمض النووي الريبي لإنزيم الحمض النووي الريبوزي فعال 13، shRNA 10،29، سيرنا 30، وU1i RNA مواقع 11،31 الهدف. باستخدام أساليب مختلفة لتحديد إنتاج HIV-1، وقياس معظم الدراسات الانتاج الفيروسية 48 ساعة بعد شارك في ترنسفكأيشن تعبير البلازميد HIV-1 مع الرنا مرشح. بعد إنتاج HIV-1، virions غير الناضجة تخضع انشقاق بروتين من polyprot...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وأيد العمل المقدم هنا من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) (يمنح DCB-120266، PPP-133377 وHBF-348967 لAG).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin / Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
ألواح زراعة الخلايا ، 96 بئر ، 24 بئر ، 6 بئر.كورنينج353075 ، 353047 ، 353043
أنابيب دقيقة AxygenCorning311-08-051
الوزن الجزيئي المنخفض Poly I: CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01كاشف التعداء للحمض النووي الريبي الاصطناعي
TransIT-LT1MirusMIR 2300كاشف التعداء لبلازميدات
Nonidet P40 (NP-40) USB19628
[32< / sup>P] dTTPPerkin ElmerBLU505H
قالب الحمض النووي الريبي بولي (A)  Sigma-Aldrich10108626001
oligo (dT) 12-18 < / sub> DNA التمهيديThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper   ؛Perkin Elmer1450-522
عداد التلألؤ MicroplatePerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
مقياس الطيف الضوئيMicroplate Bio-rad1706930
أقراص عازلة التحلل Roche4693159001 ، 4906837001مثبطات البروتياز والفوسفاتيز
الطرد المركزيEppendorf5415R
كاشف برادفوردBio-rad500-0006
غرفة تشغيل هلامHoeferSE600
خلية نقل شبه جافةBio-rad1703940
سلم البروتين EZ-RunThermo FisherBP3603-500
غشاء النيتروسليلوزBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
محلول تجريد الأجسام المضادةMillipore2504
ECL - بيرسثيرمو فيشر  PI32106
المضاد ADAR1من الدكتور B.L. Bass
phospho-T446-PKR الجسم المضادAbcamab32036
phospho-S396-IRF3إشارات الخلية4947
PKR الجسممن الدكتور A. Hovanessian
IRF3إشارات الخلية11904
الأجسام المضادة للأكتينMilliporeMAB1501
الماعز المضاد للأرانب المسمى بيروكسيدازKPL474-1506
الماعز المضاد للفأرKPL474-1806
Ponceau S & nbsp ؛سيجما ألدريتش6226-79-5
التعبير عن الحمض النووي الريبي أجهزة الدقيقة الجسم المضاد

المراجع

  1. Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
  2. Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
  3. Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
  4. DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
  5. Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236(2015).
  6. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43(2010).
  7. Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
  8. Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
  9. Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
  10. McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55(2009).
  11. Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
  12. Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
  13. Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178(2014).
  14. Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
  15. Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
  16. Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
  17. Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
  18. Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
  19. Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22(2015).
  20. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  21. Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
  22. Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96(2013).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  25. Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
  26. Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
  27. Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
  28. Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
  29. ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
  30. Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80(2007).
  31. Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
  32. Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
  33. Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
  34. Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
  35. Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
  36. Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).
  37. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
  38. Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
  39. Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
  40. Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

1 shRNA siRNA BSL 3
تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.