يتم وصف طرق تقييم فعالية وسمية جزيئات الحمض النووي الريبي التي تستهدف خطوات ما بعد التكامل لدورة النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية -1. هذه الطرق مفيدة لفحص الجزيئات الجديدة وتحسين شكل الجزيئات الموجودة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
علاجات الحمض النووي الريبي الصغيرة التي تستهدف خطوات ما بعد التكامل في دورة تكاثر فيروس نقص المناعة البشرية -1 هي من بين أفضل المرشحين للعلاج الجيني ولديها القدرة على استخدامها كعلاجات دوائية لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1. تشمل مثبطات ما بعد التكامل الريبوزيمات ، والحمض النووي الريبي القصير (sh) ، والحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (si) ، والحمض النووي الريبي التداخل U1 (U1i) ، ومبتامر الحمض النووي الريبي. تم تحديد العديد من هذه الفحوصات باستخدام فحوصات التعداء المشتركة العابرة مع بلازميد تعبير فيروس نقص المناعة البشرية -1 وتقدم بعضها إلى التجارب السريرية. بالإضافة إلى مقاييس الفعالية ، تم تقييم الحمض النووي الريبي الصغير لقدرتها على التأثير على التعبير عن الحمض النووي الريبي البشري ، وتغيير نمو الخلايا و / أو التمايز ، واستنباط الاستجابات المناعية الفطرية. في البروتوكولات الموضحة هنا ، يتم وصف مجموعة من فحوصات التعدي العابرة المصممة لتقييم فعالية وسمية جزيئات الحمض النووي الريبي التي تستهدف خطوات ما بعد الاندماج في دورة النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية -1. لقد استخدمنا هذه المقايسات لتحديد الريبوزيمات الجديدة وتحسين تنسيق shRNAs و siRNAs التي تستهدف الحمض النووي الريبي HIV-1. توفر الطرق مجموعة سريعة من المقايسات المفيدة لفحص الحمض النووي الريبي الجديد المضاد لفيروس نقص المناعة البشرية -1 ويمكن تكييفها لفحص مثبطات ما بعد الاندماج لتكرار فيروس العوز المناعي البشري -1.
المقدمة
وجود قيود على HIV-1 العلاجات الحالية هو أنها يجب أن تدار بشكل مزمن لمنع تطور المرض. زرع HIV-1 مقاومة T اللمفاوية، أو الخلايا الجذعية المكونة للدم، لديه القدرة على توفير مراقبة طويلة المدى من فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها في غياب العلاج بالعقاقير 1،2 و قد يكون أيضا نهج فعال لتحقيق لعلاج HIV-1 3. طريقة واحدة لجعل خلايا مقاومة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها هي لادخال واحد أو أكثر من الجينات الترميز لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا أو الببتيدات إلى خلايا الفرد المصاب خلال زرع ذاتي 4. وقد صممت مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الجينات العديد من مرشح مع بعض التجارب السريرية التي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خلايا وتعداء
- ثقافة خلايا كلوة 293T في المتوسط النسر تعديل Dulbecco و(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. إعداد تعليق 2 × 10 5 خلية / مل في مستنبت الخلية. إضافة 500 و 100 و 1000 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر من 24-جيدا، 96-جيدا و12-جيدا لوحات، لإنتاج الفيروسي، وبقاء الخلية والمقايسات تفعيل جهاز المناعة، على التوالي (الشكل 2A).
- دوامة بلطف لوحات واحتضان لهم O / N عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تنمو الخلايا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد التخطيطي العام للإجراءات في الشكل 2 مع خطة ترنسفكأيشن سبيل المثال لمدة ثلاثة الرنا اختبار والحمض النووي الريبي الرقابة المنصوص في الشكل 2B. لفحوصات الإنتاج وبقاء الخلية الفيروسية، والتدريجي قراءة لكل بناء الاختبار هو تطبيع للسيطرة سلبية. و transfected مكررات في مجموعات، بحيث يتم تطبيع كل RNA اختبار لسيطرتها السلبية المجاورة. ويتم ذلك لتجنب عدم دقة البيانات المتعلقة الوقت بين كومبليكسينج وترنسفكأيشن، مما قد يؤد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تنفيذ إنتاج فحص HIV-1 صفها باستخدام خلايا HEK293T (الشكل 2) ومشابه لفحوصات المستخدمة لفحص HIV-1 الحمض النووي الريبي لإنزيم الحمض النووي الريبوزي فعال 13، shRNA 10،29، سيرنا 30، وU1i RNA مواقع 11،31 الهدف. باستخدام أساليب مختلفة لتحديد إنتاج HIV-1، وقياس معظم الدراسات الانتاج الفيروسية 48 ساعة بعد شارك في ترنسفكأيشن تعبير البلازميد HIV-1 مع الرنا مرشح. بعد إنتاج HIV-1، virions غير الناضجة تخضع انشقاق بروتين من polyprot.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وأيد العمل المقدم هنا من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) (يمنح DCB-120266، PPP-133377 وHBF-348967 لAG).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin / Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| ألواح زراعة الخلايا ، 96 بئر ، 24 بئر ، 6 بئر. | كورنينج | 353075 ، 353047 ، 353043 | |
| أنابيب دقيقة Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| الوزن الجزيئي المنخفض Poly I: C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | كاشف التعداء للحمض النووي الريبي الاصطناعي |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | كاشف التعداء لبلازميدات |
| Nonidet P40 (NP-40) USB | 19628 | ||
| [32< / sup>P] dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| قالب الحمض النووي الريبي بولي (A) | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo (dT) 12-18 < / sub> DNA التمهيدي | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper ؛ | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| عداد التلألؤ Microplate | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| مقياس الطيف الضوئي | Microplate Bio-rad | 1706930 | |
| أقراص عازلة التحلل Roche | 4693159001 ، 4906837001 | مثبطات البروتياز والفوسفاتيز | |
| الطرد المركزي | Eppendorf | 5415R | |
| كاشف برادفورد | Bio-rad | 500-0006 | |
| غرفة تشغيل هلام | Hoefer | SE600 | |
| خلية نقل شبه جافة | Bio-rad | 1703940 | |
| سلم البروتين EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| غشاء النيتروسليلوز | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| محلول تجريد الأجسام المضادة | Millipore | 2504 | |
| ECL - بيرس | ثيرمو فيشر | PI32106 | |
| المضاد ADAR1 | من الدكتور B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR الجسم المضاد | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 | إشارات الخلية | 4947 | |
| PKR الجسم | من الدكتور A. Hovanessian | ||
| IRF3 | إشارات الخلية | 11904 | |
| الأجسام المضادة للأكتين | Millipore | MAB1501 | |
| الماعز المضاد للأرانب المسمى بيروكسيداز | KPL | 474-1506 | |
| الماعز المضاد للفأر | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S & nbsp ؛ | سيجما ألدريتش | 6226-79-5 |
المراجع
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
- Allers, K., et al....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
