Method Article

تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

DOI:

10.3791/54529

⸱

September 20th, 2016

 , 
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا طريقة لتحديد البروتينات المرتبطة بالجزيئات الصغيرة باستخدام وضع العلامات على التقارب الضوئي. تتمثل ميزة هذه التقنية في أن الربط والتساهمية للبروتينات المستهدفة يحدث داخل البيئة الخلوية الحية ، مما يزيل خطر تعطيل بنية البروتين الأصلي وظروف الارتباط عند تحلل الخلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تحديد الهدف (الأهداف) الجزيئية للجزيئات الصغيرة خطوة صعبة ولكنها ضرورية نحو فهم آلية عملها. بينما تم تطوير العديد من طرق تحديد الهدف واستخدامها لتوضيح البروتينات المرتبطة لمجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة بنجاح ، فإن هذه التقنيات لها عيوب تجعلها غير مناسبة للكشف عن أنواع معينة من التفاعلات الصغيرة بين الجزيئات والهدف. على وجه الخصوص ، غالبا ما تكون التفاعلات غير التساهمية التي تعتمد على الظروف الخلوية الأصلية ، مثل تلك الخاصة ببروتينات الغشاء التي قد تتزعج هياكلها عند تحلل الخلايا ، غير قابلة لطرق تحديد الهدف القائمة على التقارب. هنا ، نوضح طريقة يتم فيها استخدام مسبار يحتوي على مجموعة ضوئية للارتباط التساهمي بالبروتين المرتبط بالجزيء الصغير داخل بيئة الخلية الحية ، مما يسمح باكتشاف وعزل البروتين المستهدف دون الحاجة إلى الحفاظ على التفاعل بعد تحلل الخلية. هذه التقنية هي أداة قيمة لدراسة الجزيئات الصغيرة المثيرة للاهتمام بيولوجيا ذات الآليات غير المعروفة ، سواء في سياق علم الأحياء الأساسي أو اكتشاف الأدوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا تعمل بشكل أساسي من خلال التفاعل مع وتغيير وظيفة من جزيئات واحدة أو أكثر "الهدف"، والأكثر شيوعا البروتينات في الخلية. في اكتشاف المخدرات، عندما تم اكتشاف مركب نشط من خلال الفحص المظهري، وتحديد الهدف الجزيئي (ق) من هذا المركب أمر بالغ الأهمية، ليس فقط لفهم آلية عمل والآثار الجانبية المحتملة للمركب، ولكن أيضا بسبب احتمال اكتشاف الاحياء الجديدة التي يقوم عليها نموذج المرض ويمهد الطريق لتطوير الطبقات الآلية الجديدة من العلاجات 1. على الرغم من أن ليس مطلوبا تحديد الهدف لعقار لاستخدامها علاجيا، كان هناك اعتراف متزايد في السنوات الأخيرة أن المرشحين المخدرات الرواية هي أكثر احتمالا للنجاح في ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من ماكينون وتونتون 10 للاستخدام في الخلايا الحية.

1. إعداد الخلايا المستزرعة

  1. إعداد 6 سم أطباق زراعة الخلايا معقمة لعدد العينات المطلوبة (أنظر أدناه).
    ملاحظة: يتم استخدام طبق واحد من الخلايا في حالة العلاج، ولكن إذا كان مطلوبا المزيد من البروتين 2 أو 3 أطباق يمكن إعداد في حالة والجمع بعد اشعة فوق البنفسجية.
    1. إعداد لا يقل عن 3 أطباق من ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على النتائج الموضحة هنا مع التحقيق الذي تجريه الصور تقارب من يتراكونازول المخدرات مضاد للفطريات، واستخدام والتي تم نشرها سابقا 16. هذه النتائج تثبت استخدام الخلية الحية photoaffinity وضع العلامات تقنية لتحديد بنجاح بروتين رئيسي ملزم يتراكونازول مثل 35 كيلو دالتون بروتين الغشاء الجهد التي تعتمد على قناة أنيون 1 (VDAC1).

تم تنفيذ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أساليب مختلفة لتحديد الأهداف من جزيئات صغيرة يمكن تصنيفها إلى فئتين: من أعلى إلى أسفل، حيث يتم استخدام النمط الظاهري الخلوية من المخدرات لتضييق أهدافها المحتملة بناء على وظائفها المعروفة، أو من أسفل إلى أعلى، حيث الهدف يتم التعرف مباشرة بوسائل كيميائية أو وراثية 3. من أعلى إلى أسفل أو دراسات المظهرية يمكن تحديد بعض العمليات الخلوية تتأثر المخدرات (على سبيل المثال، النسخ / الترجمة / توليف الحمض النووي، وكتلة دورة الخلية، مما يشير إلى تنشيط مسار / تثبيط، الخ).......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور بن ناسيف على النصيحة بشأن تصميم بروتوكول وضع العلامات على التقارب الضوئي ، والدكتور وي شي لتجميع مسبار التقارب الضوئي itraconazole ، والدكتور Yongjun Dang على تقديم المشورة بشأن تجارب التقارب المنسدل ، وأعضاء آخرين في مختبر JOL للحصول على تعليقات مفيدة ودعم. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال زمالة مؤسسة PhRMA في علم الأدوية / علم السموم (إلى SAH). منحة المعهد الوطني للسرطان R01CA184103 ؛ معهد البحوث الطبية للمضيفات ؛ مؤسسة سرطان البروستاتا (J.O.L.) ؛ ومعهد جونز هوبكنز للأبحاث السريرية والانتقالية ، والذي يتم تمويله جزئيا من قبل Grant UL1 TR 001079 من المركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية (NCATS).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) LifeTechnologies20490اجعل يوما جديدا من الاستخدام. تحضير 100 ملي من المرق في الماء مع 4 مكافئ هيدروكسيد الصوديوم.
تريس [(1-بنزيل-1H-1،2،3-triazol-4-yl)methyl] أمين (TBTA)AnaSpec63360-50 تحضير مخزون 1.7 ملي مولار بنسبة 4: 1 من تي بوتانول إلى DMSO ، وتخزينه عند -20   ؛ درجة مئوية.
كبريتات النحاس (CuSO4< / sub>&# 8226; 5H2< / sub>O) LabChem، Inc.LC13440-1تحضير 50 ملم من المرق في الماء ، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
الكيمياءفوق البيوتينأزيد AZ104-100تحضير مخزون 10 ملي متر في DMSO ، وتخزينها في -20   ؛ درجة مئوية.
أليكسا فلور 647-azide Life TechnologiesA10277قم بإعداد مخزون 1 ملي متر في DMSO ، وتخزينها في -20  ؛ درجة مئوية.
الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومترSpectrolineFC100UV-Block أثناء التشغيل.
أقراص مثبطات البروتياز ، خالية من EDTARoche Life Science11873580001تحضير محلول 50x في الماء وتخزينها في -20 & nbsp ؛ درجة مئوية.
Sonicatorبرانسونسونيفاير 250ضبط على الإخراج 1 ، واجب 30٪. 
ماسح هلام الفلورسنتGE Healthcare Life SciencesFLA 9500استخدم الليزر الأحمر للكشف عن Alexa-fluor 647.
مجموعة فحص بروتين التيار المستمر المتوافقة مع المنظفاتBio-Rad5000112
حبات Streptavidin Agarose عالية السعة   ؛Life Technologies20359
Dulbecco's Modified Eagles متوسط ، منخفض الجلوكوزThermoFisher Scientific11885092
مصل الأبقار الجنينية ، محلولThermoFisher Scientific26140079
البنسلين / الستربتومايسينالمؤهل ThermoFisher Scientific15140122
SDS عينة عازلة (2x)ThermoFisher Scientificال سي 2676
أدوات مصباح يجب ارتداء نظارات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  2. Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learne....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Live cell Photoaffinity LabelingSmall Molecule Target IdentificationPhotoaffinity Probe BindingNative Cellular EnvironmentCovalent CrosslinkingHEK 293 T CellsFluorescent Gel ScanningStreptavidin Agarose BeadsSDS PAGE AnalysisMass Spectrometry Identification

Related Articles