مقالة منهجية

تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

DOI:

10.3791/54529

⸱

سبتمبر 20, 2016

 , 
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا طريقة لتحديد البروتينات المرتبطة بالجزيئات الصغيرة باستخدام وضع العلامات على التقارب الضوئي. تتمثل ميزة هذه التقنية في أن الربط والتساهمية للبروتينات المستهدفة يحدث داخل البيئة الخلوية الحية ، مما يزيل خطر تعطيل بنية البروتين الأصلي وظروف الارتباط عند تحلل الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تحديد الهدف (الأهداف) الجزيئية للجزيئات الصغيرة خطوة صعبة ولكنها ضرورية نحو فهم آلية عملها. بينما تم تطوير العديد من طرق تحديد الهدف واستخدامها لتوضيح البروتينات المرتبطة لمجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة بنجاح ، فإن هذه التقنيات لها عيوب تجعلها غير مناسبة للكشف عن أنواع معينة من التفاعلات الصغيرة بين الجزيئات والهدف. على وجه الخصوص ، غالبا ما تكون التفاعلات غير التساهمية التي تعتمد على الظروف الخلوية الأصلية ، مثل تلك الخاصة ببروتينات الغشاء التي قد تتزعج هياكلها عند تحلل الخلايا ، غير قابلة لطرق تحديد الهدف القائمة على التقارب. هنا ، نوضح طريقة يتم فيها استخدام مسبار يحتوي على مجموعة ضوئية للارتباط التساهمي بالبروتين المرتبط بالجزيء الصغير داخل بيئة الخلية الحية ، مما يسمح باكتشاف وعزل البروتين المستهدف دون الحاجة إلى الحفاظ على التفاعل بعد تحلل الخلية. هذه التقنية هي أداة قيمة لدراسة الجزيئات الصغيرة المثيرة للاهتمام بيولوجيا ذات الآليات غير المعروفة ، سواء في سياق علم الأحياء الأساسي أو اكتشاف الأدوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا تعمل بشكل أساسي من خلال التفاعل مع وتغيير وظيفة من جزيئات واحدة أو أكثر "الهدف"، والأكثر شيوعا البروتينات في الخلية. في اكتشاف المخدرات، عندما تم اكتشاف مركب نشط من خلال الفحص المظهري، وتحديد الهدف الجزيئي (ق) من هذا المركب أمر بالغ الأهمية، ليس فقط لفهم آلية عمل والآثار الجانبية المحتملة للمركب، ولكن أيضا بسبب احتمال اكتشاف الاحياء الجديدة التي يقوم عليها نموذج المرض ويمهد الطريق لتطوير الطبقات الآلية الجديدة من العلاجات 1. على الرغم من أن ليس مطلوبا تحديد الهدف لعقار لاستخدامها علاجيا، كان هناك اعتراف متزايد في السنوات الأخيرة أن المرشحين المخدرات الرواية هي أكثر احتمالا للنجاح في التجارب السريرية، وبالتالي يحقق عائدا أفضل على الاستثمار، وإذا كان الهدف التحقق من صحة معروف 2. وهكذا، فقد كان هناك اهتمام متزايد في طرق لتحديد صغيرةجزيء البروتين الهدف.

هدف التجربة تحديد الكلاسيكية يعتمد عادة على تنقية تقارب، حيث ثبتوا جزيء صغير من الفائدة على الراتنج وحضنت مع لست] خلية كاملة، وبعد ذلك يتم غسلها البروتينات غير منضم بعيدا ومزال البروتينات المتبقية وتحديد 3. في حين تم استخدام هذه التقنية لتحديد الأهداف من العديد من الجزيئات الصغيرة 4، فإنه غير مناسب كوسيلة معرف الهدف الشامل لعدة أسباب. أولا، يجب أن البروتين المستهدف تحتفظ التشكل الأصلي الخاص به على تحلل الخلية من أجل الحفاظ على قدرتها على ربط جزيء صغير. هذا يمكن أن يكون مشكلة خاصة بالنسبة للبروتينات الغشاء، والتي غالبا ما تخضع لتغيرات متعلق بتكوين بعد إزالة من بيئتهم المحلية، أو ببساطة مجموع المباراتين وتترسب من الحل. ثانيا، جزيء صغير يجب أن يتم تعديل كيميائيا في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن يجمد على الراتنج مع الحفاظ علىقدرته على ربط البروتين المستهدف. وبالتالي قد تصبح جيوب ملزمة عميقة غير قابلة للوصول إلى جزيء صغير مرة واحدة فهي ثابتة إلى الراتنج. ثالثا، يجب أن يكون تقارب ملزمة عالية بما فيه الكفاية أن يتم الحفاظ على التفاعل خلال خطوات الغسيل، مما يجعل تحديد أقل التفاعلات تقارب الصعبة. والظروف البيئية الرابعة مثل درجة الحموضة، تركيز أيون، أو وجود جزيئات الذاتية الأخرى يمكن أن تختلف مكانيا داخل الخلية وفي بعض الأحيان المتطلبات الأساسية لالتفاعلات الهدف المخدرات. وهكذا، وإيجاد الظروف الصحيحة للسماح والحفاظ خارج الخلية ملزمة يمكن أن تتطلب قدرا كبيرا من التجربة والخطأ.

Photoaffinity وضع العلامات تلتف هذه القضايا من خلال السماح للالتساهمية ملزم من جزيء صغير وهدفه في سياق الأصلي للخلية. بدلا من شل حركة جزيء صغير لراتنج ضخمة كبيرة، وبدلا من ذلك تعديل جزيء كيميائيا لتثبيت اثنين ز صغير عمليroups: شاردة photoactivatable الذي يسمح التساهمية يشابك للبروتين الهدف عندما المشع مع طول موجة معينة من الضوء، ومجموعة المراسل أن يسمح للبروتين الهدف ليتم الكشف عن وعزل في وقت لاحق. يتم التعامل مع الخلايا الحية مع لجنة التحقيق photoaffinity، وتحقيق الربط وتساهمي crosslinks للبروتين الهدف، ومجمع التحقيق البروتين ومن ثم معزولة سليمة. وتتجلى خصوصية التحقيق ملزم إلى الهدف عن طريق إجراء تجربة المنافسة في موازاة ذلك، حيث يتم استخدام الزيادة في المركب الأصلي للتنافس بعيدا ملزمة لجنة التحقيق للبروتين الهدف.

تصميم وتركيب المجسات photoaffinity يختلف كثيرا عن جزيء صغير واحد إلى آخر، وسوف لا تكون مشمولة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، فقد تم نشر عدة مناقشات ممتازة على هذا الموضوع 5-9. والاعتبار الرئيسي هو أن لجنة التحقيق يحتفظ النشاط الحيوي للمركب الأصلي، وبالتالي presumabلاي ملزمة لنفس الهدف (ق). يجب أن يؤديها العلاقة بين الهيكل والنشاط (SAR) دراسات لتحديد أي أجزاء من جزيء يمكن تعديلها دون فقدان النشاط الحيوي. وقد استخدمت مجموعة متنوعة من مجموعات كيميائية مختلفة كما crosslinkers photoactivatable، بما في ذلك diazirine، بينزفينون، وأزيد أريل، ولكل منهما مزاياه وعيوبه 10. وبالمثل، هناك علامات مراسل المتعددة التي استخدمت لعزل البروتينات ملزم التحقيق. قد تكون الجماعات مراسل وظيفية من تلقاء نفسها، مثل البيوتين التي يشيع استخدامها أو العلامات الفلورية، أو قد تكون السلائف التي تتطلب مزيدا من functionalization لاحق إلى الخطوة photocrosslinking، التي لديها ميزة كونها أصغر حجما وبالتالي أقل احتمالا لتقديم تنازلات النشاط الحيوي 11.

في هذا البروتوكول، ونحن قد استخدمت التحقيق photoaffinity تحتوي على مجموعة diazirine photocrosslinking، وآلكاين محطة للمرفق مجموعة مراسل من خلال النحاس (I) -catalyzإد أزيد-آلكاين شاربلس-Hüisgen cycloaddition (أو انقر) رد فعل 12-15. الدراسات ريال، تسبر تصميم وتركيب، وقد تم نشر نتائج هذه الدراسات في أماكن أخرى 16-18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من ماكينون وتونتون 10 للاستخدام في الخلايا الحية.

1. إعداد الخلايا المستزرعة

  1. إعداد 6 سم أطباق زراعة الخلايا معقمة لعدد العينات المطلوبة (أنظر أدناه).
    ملاحظة: يتم استخدام طبق واحد من الخلايا في حالة العلاج، ولكن إذا كان مطلوبا المزيد من البروتين 2 أو 3 أطباق يمكن إعداد في حالة والجمع بعد اشعة فوق البنفسجية.
    1. إعداد لا يقل عن 3 أطباق من الخلايا. السيطرة السلبية مع DMSO فقط (D)، والعلاج التحقيق فقط (P)، ومسبار + منافس (C).
    2. اختياريا، وإعداد طبق ال 4 كما لا سيطرة للأشعة فوق البنفسجية، إلى أن تعامل مع التحقيقات ولكنه لم يتعرض للأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: إذا متعددة الجزيئات منافس هي لفحصها، مثل النظير مختلفة من جزيء صغير من الفائدة، وإعداد لوحات منافس إضافية عند الضرورة.
  2. إضافة خلايا HEK293T إلى أطباق الثقافة في 4 وسائل الإعلام ثقافة مل. استخدام 3.5 مليون جملتعلمي اللغة اإلنكليزية لكل لوحة.
    ملاحظة: يجب أن يتم تحديد عدد الخلايا لكل نوع من الخلايا بحيث الخلايا هي ما يقرب من 100٪ متكدسة في بداية التجربة، من أجل تحقيق أقصى قدر من العائد من البروتين. لHUVEC، استخدم 0.3 مليون خلية لكل لوحة. والتقريب الجيد هو 1/10 من الخلايا في سم طبق متموجة 15. يجب مثقف خلايا HEK293T في Dulbecco لتعديل النسور تستكمل المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين.
  3. عودة إلى الخلايا الحاضنة الثقافة (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2) بين عشية وضحاها.

2. علاج الخلايا وPhotocrosslinking

  1. في اليوم التالي، قبل قسامة الأدوية التالية إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge:
    1. في المعالجة الأولى، إضافة 4 ميكرولتر من DMSO إلى 2 الأنابيب و 4 ميكرولتر من 10 ملي منافس (أي المركب الأصلي الغير معدلة) إلى 1 أنبوب.
    2. لعلاج الثانية، إضافة 16 ميكرولتر من DMSO إلى 1 أنبوب و 16 ميكرولتر من 50 &# 181؛ M photoaffinity التحقيق إلى 2 الأنابيب.
      ملاحظة: تركيز الأمثل قد تكون مختلفة عن تحقيقات مختلفة (انظر المناقشة)، ولكن بين 200-500 نانومتر هو نقطة انطلاق جيدة (هنا نستخدم 200 نانومتر). يجب أن يتجاوز تركيز منافس أن لجنة التحقيق لا يقل عن 20 أضعاف (وهنا نستخدم 10 ميكرومتر). يجب أن يكون تركيز النهائي من DMSO على قدم المساواة في جميع لوحات ويجب أن لا تتجاوز 0.5٪ (20 حجم ميكرولتر).
  2. تقديم لوحات الخلية إلى الخلية هود الثقافة وإضافة المخدرات aliquoted قبل من الخطوة 2.1.1 على النحو التالي: نضح 1 مل من وسائل الإعلام والثقافة، وإعادة التعليق على المخدرات قبل aliquoted في وسائل الإعلام، وإضافة بلطف مرة أخرى إلى الانخفاض لوحة الحكمة. إضافة DMSO إلى (D) لوحة DMSO و(P) لوحة التحقيق، وإضافة منافس إلى (C) لوحة المنافسة. العودة لوحات لحاضنة الثقافة لمدة 30 دقيقة.
  3. مع أضواء في غطاء الثقافة خافتة، إضافة التحقيق قبل aliquoted من الخطوة 2.1.2 للتحقيق (P) والمنافسة لوحات (C) وإضافةDMSO إلى لوحة DMSO (D)، على النحو الوارد أعلاه. العودة لوحات لحاضنة الثقافة لمدة 1 ساعة.
  4. أثناء الحضانة، واعداد العناصر التالية: صينية من الجليد التي يمكن أن تناسب جميع لوحات. تحلل العازلة الجليد الباردة (PBS [الرقم الهيدروجيني 8.5] + 1X مثبط البروتياز كوكتيل [كاملة خالية من EDTA، مخففة من حل 50X الأسهم المحرز في الماء]، 200 ميكرولتر / لوحة)؛ أنابيب microcentrifuge وصفت D، P، أو C لكل الشروط معاملة مختلفة، على الجليد.
  5. 15 دقيقة قبل نهاية الحضانة 1 ساعة، أقامت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) في غرفة باردة وتحويله إلى الاحماء لمبة.
  6. بعد 1 ساعة حضانة مع لجنة التحقيق، ووضع الأطباق على الجليد. غسل الخلايا برفق مع 5 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) لإزالة التحقيق الزائد. إعادة تغطية الخلايا مع 4 PBS مل الجليد الباردة.
  7. وضع طبق من الخلايا تركز 3 سم تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية على أعلى وضع كيس من الثلج للحد من التدفئة من المصباح. أشرق لمدة 3 دقائق. إزالة الطبق إلى علبة الجليد وأكرر لجميع العينات.
  8. اfter التشعيع، نضح في برنامج تلفزيوني من الخلايا وإضافة 200 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 8.5) مع مثبطات الأنزيم البروتيني إلى كل لوحة. فصل الخلايا من لوحة باستخدام مكشطة المطاط ونقل إلى أنابيب microcentrifuge وصفت مسبقا على الجليد.
  9. إضافة SDS إلى تركيز النهائي من 0.4٪ (10 ميكرولتر من 10٪ SDS إلى 250 ميكرولتر من العينة).
    تنبيه: مسحوق SDS خطرة. تجنب استنشاق مسحوق SDS من خلال ارتداء قناع على الأنف والفم.
  10. ليز الخلايا عن طريق sonicating تعليق لمدة 10 البقول (الناتج 1، دورة العمل 30٪)، واحتضان على الجليد لمدة 1 دقيقة قبل جولة ثانية من 10 البقول.
  11. إذا لزم الأمر، وإزالة 2 ميكرولتر من تعليق وتحقق تحت المجهر الضوئي لضمان تحلل الخلية كاملة.
  12. تغلي العينات على طبق ساخن لتعيين 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لاستكمال تحلل الخلايا وتفسد كل البروتينات.
  13. قياس تركيز البروتين في كل عينة باستخدام المنظفات متوافق الطيفي البروتين الفحص، مثل الالبريد العاصمة البروتين مقايسة 19، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع معمل المقرر أن قياس الامتصاصية في 750 نانومتر.
  14. تطبيع تركيز البروتين إلى 2.5 ملغ / مل (أو إذا التركيزات أقل من 2.5 ملغ / مل، وتطبيع للعينة مع أقل تركيز البروتين) وذلك بإضافة برنامج تلفزيوني درجة الحموضة 8.5 + 0.4٪ SDS حسب الحاجة (على سبيل المثال، إذا العينات 5 ملغم / لتر في 250 ميكرولتر، إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني درجة الحموضة 8.5 + 0.4٪ SDS للحصول على التركيز النهائي من 2.5 ملغ / مل).

3. مرفق من العلامات الفلورية التي كتبها انقر الكيمياء لتصور البروتينات إعتبر

  1. إزالة 40 ميكرولتر من المحللة الخلية ونقل إلى أنبوب microcentrifuge جديد. إبقاء لست] المتبقية لرد فعل مع البيوتين أزيد (الخطوة 4).
  2. إضافة الكواشف التالية بالترتيب: 0.2 ميكرولتر فلور-أزيد (1 ملي حل الأسهم في DMSO)، 0.58 ميكرولتر TCEP (100 ملي الأسهم في الماء مع 4 حكمه وأضاف هيدروكسيد الصوديوم، الذي أعد الطازجة)، و3.38 ميكرولتر TBTA (1.7 الاسهم ملي في نسبة 4: 1 ر بيوتانول إلى DMSO). دوامة لخلط.
  3. إضافة 1.14 ميكرولتر كبريتات النحاس 4 -5H 2 O (50 ملم في الماء) لبدء التفاعل. دوامة احتضان لفترة وجيزة وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من عينة العازلة 2X SDS لإرواء رد الفعل. عند هذه النقطة، تشغيل عينات مباشرة على هلام SDS-PAGE 20 حصول على أفضل النتائج، أو تخزينها في -20 درجة مئوية خلال الليل إذا لزم الأمر.
  5. إذا تجميد العينات، يسخن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية قبل تحميلها على هلام.
    ملاحظة: بما أن عادة لا يعرف الوزن الجزيئي للبروتين الهدف في هذه المرحلة، فإنه من المستحسن لتشغيل 2 المواد الهلامية مع تركيزات مادة الأكريلاميد مختلفة (أي 8٪ و 15٪)، أو هلام التدرج الجزيئي وزن مدى واسع (أي، 4-15٪)، لضمان تغطية كاملة الوزن الجزيئي.
  6. عندما الجبهة صبغ وصلت الى نهاية هلام، متابعة تشغيل هلام لمدة 5 دقائق إضافية لضمان كل من unreacte الزائدةد فلوري-أزيد قد خرجت تماما هلام.
  7. إزالة هلام إلى وعاء مع ده 2 O، واحتضان لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف، ليغسل كل الزائد فلور-أزيد.
  8. وضع الجل على طبق من ذهب الزجاج ومسح الجل باستخدام الماسح الضوئي هلام الفلورسنت الاعصار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

4. إرفاق البيوتين العلامات من قبل انقر الكيمياء للتقارب تنقية البروتينات إعتبر

  1. من لست] المتبقية من الخطوة 3.1، استخدام الحد الأقصى للمبلغ بعد تطبيع البروتين مثل أن جميع العينات هي نفس الحجم (على سبيل المثال، إذا كان بعد تطبيع إلى 2.5 ملغ / مل أحجام العينة الناتجة هي 500، 550، و 600 ميكرولتر، استخدم 500 ميكرولتر من كل منهما).
  2. قبل مسح لست] بإضافة 50 ميكرولتر ذات قدرة عالية الخرز streptavidin الاغاروز، 2X قبل غسلها مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). احتضان 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع دوران.
  3. بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة رانه طاف لأنبوب microcentrifuge جديد على الجليد والتخلص من الخرز.
  4. إزالة 1-2٪ من العينة DMSO إلى أنبوب جديد المسمى "المدخلات". إضافة ما يعادل حجم عينة العازلة 2X SDS ومخزن في -20 درجة مئوية.
  5. لكل 500 ميكرولتر من المحللة، إضافة الكواشف التالية: 1.38 ميكرولتر البيوتين أزيد (10 ملي الأسهم في DMSO)، 5.5 ميكرولتر TCEP، و 32.5 TBTA ميكرولتر. دوامة لخلط.
  6. إضافة 11 ميكرولتر كبريتات النحاس 4 -5H 2 O لكل 500 ميكرولتر من المحللة ودوامة لفترة وجيزة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  7. إضافة 4 مجلدات عينة من الأسيتون المبردة إلى -20 درجة مئوية. دوامة العينات واحتضان بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية لترسيب تماما البروتينات وإزالة غير المتفاعل البيوتين أزيد.
  8. الطرد المركزي العينات في 17000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير البروتينات عجل.
  9. نضح طاف تماما، وresolubilize البروتينات صوتنة في 150 ميكرولتر PBS (درجة الحموضة 7.4) + 1٪ SDS.
  10. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) لتخفيف تركيز SDS إلى 0.2٪.
  11. إضافة العينات إلى 30 ميكرولتر قبل غسلها ذات قدرة عالية streptavidin الخرز الاغاروز واحتضان 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع دوران.
  12. بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 دقائق. نضح طاف تحتوي على بروتينات غير منضم وتجاهل.
  13. إضافة 1 مل من غسل العازلة (400 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، 0.2٪ SDS، ودرجة الحموضة 7.4) إلى الخرز واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع دوران.
  14. كرر الخطوات من 4.12 و 4.13 3 مرات.
  15. نضح غسل العازلة تماما من الخرز، وإضافة 30 ميكرولتر من عينة العازلة 2X SDS.
  16. احتضان لمدة 5 دقائق على كتلة C الحرارة 95 درجة للافراج عن البروتينات من الخرز.
  17. أجهزة الطرد المركزي حبات لمدة 1 دقيقة في 13000 x ج في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للتشغيل SDS-PAGE. إذا تجميد العينات، يسخن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  18. بعنايةماصة عينة العازلة التي تحتوي على البروتينات الخروج من الخرز، وتحميل على SDS-PAGE 20 (انظر الاعتبارات الهامة أدناه). يمكن حفظ حبات لreboiling في وقت لاحق إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: للكشف عن البروتين بواسطة وصمة عار الفضة، ويتم الحصول على نتائج أفضل باستخدام هلام سميكة 1 مم. إذا كان الفرقة هو أن يكون قطعت من هلام الملطخة الفضة لتحليل الكتلة الطيفي (MS)، وإعداد جميع الكواشف جديدة من حلول عقيمة وترك بئر فارغة في بين العينات على هلام. لكل فرقة من قطع الممر التحقيق، ينبغي أن تؤخذ شريحة موازية من حارة DMSO بحيث يمكن طرح أن البروتينات الخلفية. للتأكد من صحة هوية البروتين لطخة غربية، فمن الأهمية بمكان لتحميل أيضا إدخال عينة من الخطوة 4.4 عند تشغيل هلام SDS-PAGE.
  19. اتباع بروتوكول قياسي لأي الفضة تلطيخ 21 أو الغربية لطخة 22 للكشف عن البروتين الهدف (ق).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على النتائج الموضحة هنا مع التحقيق الذي تجريه الصور تقارب من يتراكونازول المخدرات مضاد للفطريات، واستخدام والتي تم نشرها سابقا 16. هذه النتائج تثبت استخدام الخلية الحية photoaffinity وضع العلامات تقنية لتحديد بنجاح بروتين رئيسي ملزم يتراكونازول مثل 35 كيلو دالتون بروتين الغشاء الجهد التي تعتمد على قناة أنيون 1 (VDAC1).

تم تنفيذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أساليب مختلفة لتحديد الأهداف من جزيئات صغيرة يمكن تصنيفها إلى فئتين: من أعلى إلى أسفل، حيث يتم استخدام النمط الظاهري الخلوية من المخدرات لتضييق أهدافها المحتملة بناء على وظائفها المعروفة، أو من أسفل إلى أعلى، حيث الهدف يتم التعرف مباشرة بوسائل كيميائية أو وراثية 3. من أعلى إلى أسفل أو دراسات المظهرية يمكن تحديد بعض العمليات الخلوية تتأثر المخدرات (على سبيل المثال، النسخ / الترجمة / توليف الحمض النووي، وكتلة دورة الخلية، مما يشير إلى تنشيط مسار / تثبيط، الخ)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور بن ناسيف على النصيحة بشأن تصميم بروتوكول وضع العلامات على التقارب الضوئي ، والدكتور وي شي لتجميع مسبار التقارب الضوئي itraconazole ، والدكتور Yongjun Dang على تقديم المشورة بشأن تجارب التقارب المنسدل ، وأعضاء آخرين في مختبر JOL للحصول على تعليقات مفيدة ودعم. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال زمالة مؤسسة PhRMA في علم الأدوية / علم السموم (إلى SAH). منحة المعهد الوطني للسرطان R01CA184103 ؛ معهد البحوث الطبية للمضيفات ؛ مؤسسة سرطان البروستاتا (J.O.L.) ؛ ومعهد جونز هوبكنز للأبحاث السريرية والانتقالية ، والذي يتم تمويله جزئيا من قبل Grant UL1 TR 001079 من المركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية (NCATS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) LifeTechnologies20490اجعل يوما جديدا من الاستخدام. تحضير 100 ملي من المرق في الماء مع 4 مكافئ هيدروكسيد الصوديوم.
تريس [(1-بنزيل-1H-1،2،3-triazol-4-yl)methyl] أمين (TBTA)AnaSpec63360-50 تحضير مخزون 1.7 ملي مولار بنسبة 4: 1 من تي بوتانول إلى DMSO ، وتخزينه عند -20   ؛ درجة مئوية.
كبريتات النحاس (CuSO4< / sub>&# 8226; 5H2< / sub>O) LabChem، Inc.LC13440-1تحضير 50 ملم من المرق في الماء ، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
الكيمياءفوق البيوتينأزيد AZ104-100تحضير مخزون 10 ملي متر في DMSO ، وتخزينها في -20   ؛ درجة مئوية.
أليكسا فلور 647-azide Life TechnologiesA10277قم بإعداد مخزون 1 ملي متر في DMSO ، وتخزينها في -20  ؛ درجة مئوية.
الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومترSpectrolineFC100UV-Block أثناء التشغيل.
أقراص مثبطات البروتياز ، خالية من EDTARoche Life Science11873580001تحضير محلول 50x في الماء وتخزينها في -20 & nbsp ؛ درجة مئوية.
Sonicatorبرانسونسونيفاير 250ضبط على الإخراج 1 ، واجب 30٪. 
ماسح هلام الفلورسنتGE Healthcare Life SciencesFLA 9500استخدم الليزر الأحمر للكشف عن Alexa-fluor 647.
مجموعة فحص بروتين التيار المستمر المتوافقة مع المنظفاتBio-Rad5000112
حبات Streptavidin Agarose عالية السعة   ؛Life Technologies20359
Dulbecco's Modified Eagles متوسط ، منخفض الجلوكوزThermoFisher Scientific11885092
مصل الأبقار الجنينية ، محلولThermoFisher Scientific26140079
البنسلين / الستربتومايسينالمؤهل ThermoFisher Scientific15140122
SDS عينة عازلة (2x)ThermoFisher Scientificال سي 2676
أدوات مصباح يجب ارتداء نظارات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  2. Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
  3. Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
  4. Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
  5. Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
  6. Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
  7. Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
  8. Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
  9. Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
  10. Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
  11. Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
  12. Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
  13. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
  14. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  15. Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
  16. Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
  17. Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
  18. Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
  19. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  20. Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
  21. Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
  22. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Live cell Photoaffinity LabelingSmall Molecule Target IdentificationPhotoaffinity Probe BindingNative Cellular EnvironmentCovalent CrosslinkingHEK 293 T CellsFluorescent Gel ScanningStreptavidin Agarose BeadsSDS PAGE AnalysisMass Spectrometry Identification

مقالات ذات صلة