يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في فيفو نموذج لاختبار تأثير نقص الأكسجة على الانبثاث ورم

12.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54532

⸱

ديسمبر 9, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University Medical Center, 2Department of Nursing, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 3Department of Human Science, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 4School of Medicine, Georgetown University Medical Center, 5Department of Pathology and Neuropathology, Medical University of Gdańsk, 6Department of Oncology, Georgetown University Medical Center, 7Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المخطوطة تطوير نموذج حيواني يسمح بالاختبار المباشر لآثار نقص الأكسجة في الورم على ورم خبيث وفك رموز آليات عمله. على الرغم من أن التجارب الموضحة هنا تركز على ساركوما إوينغ ، إلا أنه يمكن تطبيق نهج مماثل على أنواع الأورام الأخرى.

الملخص

نقص الأكسجة متورط في ورم خبيث لساركوما إوينغ (ES) من خلال الملاحظات السريرية والبيانات المختبرية ، ومع ذلك لا توجد أدلة مباشرة على تأثيرها المؤيد للنقائل والآليات الدقيقة لعملها غير واضحة. هنا ، نبلغ عن نموذج حيواني يسمح بإجراء اختبار مباشر لآثار نقص الأكسجة في الورم على انتشار ES والتحقيق في المسارات الأساسية المعنية. يجمع هذا النهج بين استراتيجيتين تجريبيتين راسختين ، التطعيم الغريب لتقويم العظام لخلايا ES وربط الشريان الفخذي (FAL) ، مما يؤدي إلى نقص تروية الأطراف الخلفية. تم حقن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في عضلات المعدة للفئران SCID / البيج وسمح للأورام الأولية بالنمو إلى حجم 250 مم3. في هذه المرحلة ، تم استئصال الأورام (المجموعة الضابطة) أو تعرضت ل FAL لإحداث نقص الأكسجة في الورم ، متبوعا باستئصال الورم بعد 3 أيام. تم تأكيد كفاءة FAL من خلال زيادة كبيرة في ارتباط نقص الأكسجة -1 في أنسجة الورم ، ونخر الورم الشديد والتثبيط الكامل لنمو الورم الأولي. الأهم من ذلك ، على الرغم من هذه الآثار المباشرة لنقص التروية ، لوحظ انتشار معزز للخلايا السرطانية من الأورام الناقصة للأكسجين. تتيح هذه الإستراتيجية التجريبية تحليلا مقارنا للخصائص النقيلية للأورام الأولية من نفس الحجم ، ولكن مستويات مختلفة بشكل كبير من نقص الأكسجة. كما يوفر منصة جديدة لتقييم الأساس الميكانيكي للتعديلات الناجمة عن نقص الأكسجة التي تحدث أثناء تطور الورم النقيلي في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، بينما تم إنشاء هذا النموذج باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية ، نتوقع أن هذه الاستراتيجية التجريبية يمكن استخدامها لاختبار تأثير نقص الأكسجة في الأورام اللحمية الأخرى ، وكذلك الأورام المزروعة تقويما في مواقع ذات مسار إمداد دم محدد جيدا.

المقدمة

يوينغ ساركوما (ES) هي خباثة العدوانية التي تؤثر على الأطفال والمراهقين. 1 الأورام تنمو في الأنسجة الرخوة والعظام، عادة في الأطراف. في حين وجود نقائل هو أقوى عامل النذير سلبي واحد للمرضى وفاق، لا تزال الآليات الكامنة وراء تنميتها واضحة. 2 ورم نقص الأكسجة هو واحد من العوامل القليلة المتورطين في ES التقدم. في المرضى الذين فاق، ويرتبط وجود مناطق غير perfused داخل أنسجة الورم مع سوء أحوال الطقس. 3 في المختبر، نقص الأكسجين يزيد من غزو خلايا ES ويطلق تعبير عن الجينات الموالية للالنقيلي. 4-6 ومع ذلك، على الرغم من هذه الأسطر من الأدلة، لا يوجد دليل مباشر على وفاق الناجم عن نقص الأكسجة تطور وانتشار موجودا. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات التي نقص الأكسجة يمارس هذه الآثار هي، في الوقت الحاضر، غير معروفة. ومن هنا، قمنا بإنشاء نموذج في الجسم الحي لملء الفجوة بين القائمة في بيانات المختبر وobser السريريالأرصاد. هذا النظام النموذجي تمكن من اختبار مباشر من آثار نقص الأكسجين على الأورام التي تحدث في بيئتها الطبيعية، وذلك باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لمتابعة تطور الورم والانبثاث في الجسم الحي في تركيبة مع خارج الحي التحليلات المرضية والجزيئية (الشكل 1).

منذ لا يوجد نموذج المعدلة وراثيا المعمول بها ES متاح حاليا، فإن الدراسات المجراة على خصائص النقيلي من هذه الأورام تعتمد على حقن الخلايا البشرية في الفئران المناعة. في حين أن استخدام الحيوانات ضعف المناعة قد نقلل من تأثير على الجهاز المناعي على تطور المرض، والقدرة على استخدام الخلايا البشرية يزيد ترجمتها من هذه الدراسات. ومن بين النماذج طعم أجنبي المختلفة، والحقن النظامية إلى الوريد الذيل هي أسهل للأداء، ولكنها حذفت الخطوات الأولية من ورم الخلايا دخول الوعاء والهروب من الموقع الرئيسي للنمو. 7-12 من ناحية أخرى، orthoto الموافقة المسبقة عن علم xenografting، الذي ينطوي على حقن الخلايا السرطانية في العظام (عظم الفخذ، الضلع) أو العضلات، هو أكثر تحديا من الناحية الفنية، ولكن أيضا أكثر بيولوجيا ذات الصلة لسرطان البشري. 13-16 القتل الرحيم الحيوانات ومع ذلك، في الماضي، وارتفاع معدلات المراضة المرتبطة بالنمو السريع للأورام الأولية وكثيرا ما استلزم قبل تطور ورم خبيث. في هذه الدراسة، قمنا بتوظيف نموذج المحددة سابقا من حقن الخلايا في عضلة الساق تليها استئصال الورم الرئيسي مما أدى جنبا إلى جنب مع مراقبة الطولي للتطور المنتشر طريق التصوير بالرنين المغناطيسي. 17،18 مثل هذه الحقن في عضلة الساق على مقربة من الساق تسمح لنمو الورم في بيئتين ES الطبيعية - العضلات والعظام - وينتج عن النقائل البعيدة إلى الأماكن المتضررة عادة في البشر. 18 وبالتالي، فإن هذا النموذج يلخص بدقة العمليات النقيلي التي تحدث في المرضى الذين يعانون ES أثناء تطور المرض.

خيمة "> توطين الأورام الأولية في hindlimb أقل كما يسهل مراقبة دقيقة من وصول الدم إلى الأنسجة السرطانية. ربط الشريان الفخذي (فال) هي تقنية راسخة المستخدمة في البحوث الأوعية الدموية لمنع تدفق الدم إلى المناطق البعيدة المحطة والتحقيق في الأوعية الدموية الأنسجة استجابة لنقص التروية. 19،20 الأهم من ذلك، ويتبع الانخفاض الأولي في تدفق الدم عن طريق فتح السفينة الجانبية وضخه الأنسجة لوحظ بعد حوالي 3 أيام فال. 20 وهكذا، عندما أجريت في أحد أطرافه الورم الحاملة، هذا النموذج بإعادة الأحداث نقص الأكسجة / ضخه التي تحدث بشكل طبيعي في الأورام التي تنمو بسرعة وتمكن من الهروب من خلايا الورم النقيلي بسبب إعادة التروية إلى انخفاض hindlimb عبر السفن الضمانات الذي افتتح حديثا. 21 والأهم من ذلك يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء عندما يكون حجم الورم صغيرة بما يكفي لمنع نقص الأكسجين الزائد في الأورام التحكم (عادة في الساق المجلد الورم الحاملةأوميا من 150-250 مم 3)، وضمان اختلافات كبيرة في مستويات نقص الأكسجة الورم بين السيطرة والمجموعات المعالجة فال.

بالإضافة إلى مراقبة الطولي للتأثير نقص الأكسجين على وفاق الكمون وتيرة الانبثاث، وهذا النموذج يسمح أيضا لجمع الأنسجة وتطوير خطوط الخلايا الجديدة من كل من الأورام الابتدائية والانبثاث. الأهم من ذلك، العمل السابق نص على أن خطوط الخلايا المشتقة الانبثاث، معرضا تعزيز إمكانات المنتشر على إعادتها إلى الحيوانات، مشيرا إلى أن نشر ورم يرتبط مع تغييرات دائمة في الخلية النمط الظاهري الورم، وبالتالي التحقق من صحة استخدام هذه خطوط الخلايا فك العمليات النقيلي. 18 مجتمعة، وهذه النماذج يمكن الآن أن تستخدم في التحليلات الوراثية والجزيئية اللازمة لتحديد مسارات المنتشر الناجم عن نقص الأكسجين.

كما نقص الأكسجين هو أحد العوامل المؤيدة للالمنتشر تعزيز الورم الخبيث من مختلف رumors، لدينا نموذج يمكن أن تستخدم كمنصة للتحقيق في دور نقص الأكسجة في أنواع الأورام الأخرى التي تتطور بشكل طبيعي في أطرافه، مثل عظمية والعضلية المخططة. 21-23 وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق نهج مماثل لالأورام الخبيثة المتزايدة في مواقع تشريحية أخرى مع طريق واضحة المعالم من إمدادات الدم. في نهاية المطاف، فإن النموذج يمكن تعديل وفائدتها تمديدها، وهذا يتوقف على الاحتياجات البحثية الفردية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة جورج تاون.

1. إعداد الخلايا لمثلي الحقن

  1. خلايا ES الثقافة البشرية في ظل ظروف قياسية. استخدام ما يقرب من واحد لوحة خلية ثقافة 15 سم لا تتجاوز 70٪ من confluency للحقن من 5 الفئران.
    ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، كانت الخلايا SK-ES1 مثقف في المتوسط ​​5A مكوي مع 15٪ مصل بقري جنيني (FBS) على لوحات المغلفة الكولاجين وخلايا TC71 تم تربيتها في RPMI مع FBS 10٪ و 1٪ 4- (2-هيدروكسي ) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES). واستكملت كل من وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية - البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، وfungizone (1 ميكروغرام / مل).
  2. غسل خلايا ES مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ويعرض للتريبسين في 70٪ التقاء مع 0.25٪ التربسين ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل / (EDTA) لمدة 5 دقائق.
  3. إزالة خلايا ES من لوحة مع ميدي ثقافة الخليةلذلك، ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق الخلايا ES في 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة ومن ثم حساب عدد الخلايا.
  4. خلايا الطرد المركزي ES لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة، ثم إعادة تعليق في 2 × 10 7 (SK-ES1) أو 10 7 (TC71) خلايا لكل مل في برنامج تلفزيوني الباردة. الحفاظ على تعليق خلية النهائي على الجليد أثناء أداء الحقن.

2. حقن مثلي الخلايا ES في عضلة الساق

  1. استخدام 4-6 الاسبوع القديمة الإناث SCID / الفئران البيج.
  2. لحقن الخلايا الجذعية الجنينية، وعقد بلطف الماوس وتحقيق الاستقرار في الساق اليسرى ما بين الأصابع الرابع والخامس، وفضح الجانب الإنسي من hindlimb أقل.
  3. باستخدام إبرة 28 G ونصف، حقن 0.1 مل من تعليق خلية معدة مسبقا التي تحتوي إما 2 × 10 6 (SK-ES1) أو 10 6 خلايا (TC71) ES في عضلة الساق (الشكل 2A).
    ملاحظة: على الرغم من حجم الحد الأقصى لينج العضليections عادة 0.05 مل، لهذا الإجراء بشكل خاص في زيادة حجم 0.1 مل هو ضروري نظرا لعدد الخلايا عالية حقن. تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة جورج تاون.
    1. ادخال الإبرة في العضلة الأمامية في ما يقرب من 30 - زاوية 45 درجة في اتجاه قمة عظام الساق / الحدبة.
    2. سحب قليلا الإبرة مرة واحدة أنها تمس قمة عظام الساق / الحدبة. حقن ببطء الحل تعليق خلية، والانسحاب تدريجيا الإبرة للافراج عن الضغط.
  4. رصد حقن الفئران على مدى ال 24 ساعة القادمة لعلامات الضيق.
    ملاحظة: يجب أن المحققون مع أقل خبرة في التعامل مع الحيوانات تنظر التخدير الفئران لحقن الخلايا السرطانية. قد تتطلب بعض المؤسسات التخدير لأسباب تتعلق بالسلامة.

3. مراقبة نمو الأورام الأولية

  1. مراقبة نمو الأورام الأولية دaily حتى حجم الورم يصل حجم المطلوب.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام حجم العجل من 250 مم 3 كنقطة انطلاق التجربة (الشكل 2B). عادة، فإنه يأخذ حوالي 1-2 أسابيع للأورام للوصول إلى هذا الحجم.
    1. قياس حجم العجل يوميا مع الفرجار الرقمية عبر أطوال لها سطي الاطراف والأمامي الخلفي.
    2. تحديد حجم العجل بواسطة الصيغة (D XD 2/6) × 3.14، حيث D هو القطر الطويل ود هو قطر أقصر من انخفاض hindlimb الحاملة للورم.
      ملاحظة: حجم العادي العجل الماوس البالغين حوالي 40 - 50 مم 3. سوف حجمه زيادة نظرا لنمو الورم وفي مراحل لاحقة العجل وسيتألف أساسا من أنسجة الورم.

4. الشريان الفخذي من ربط (فال) لإحداث نقص الأكسجة في Hindlimb الحاملة للورم

  1. إعداد الأدوات الجراحية اللازمة لهذه العملية: لئيموأشار فيد أو ملقط غرامة أشار، ملقط، مقص جراحي وحامل إبرة. تعقيم هذه الأدوات قبل الجراحة باستخدام الأوتوكلاف أو معقم الساخنة حبة. بالإضافة إلى ذلك، لدينا مسحات القطن غرامة على استعداد لهذه الجراحة.
    ملاحظة: من المستحسن أن الأدوات يعاد تعقيمها على نصائح حسب الحاجة أثناء العملية.
  2. حقن كيل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كلغ) تحت الجلد (SQ). للكشف والتأكد من نقص الأكسجين، وضخ hypoxyprobe-1 (pimonidazole، 60 ملغ / كلغ).
    ملاحظة: هذه الجرعة تعادل 1.5 ملغ في الماوس، وحققت من خلال ضخ 0.1 مل من محلول مل / 15 ملغ hypoxyprobe في برنامج تلفزيوني داخل الصفاق (IP). وhypoxyprobe هو ثم بعد الوفاة التي يمكن اكتشافها في الأنسجة الحيوانية المناعية.
  3. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير التي تحتوي على 3-5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ في معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة.
  4. ترك الماوس في غرفة تحريض حتى يصبح غير قادر على الاستجابة للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من أناnduction غرفة. وضع الحيوان في موقف ضعيف على ثنى العقيمة وضعت فوق وسادة الاحترار على سطح التشغيل. استخدام مخروط الأنف لتوصيله إلى تدفق مستمر من 1-3٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ بمعدل تدفق 0.8 لتر / دقيقة.
    1. تطبيق العقيمة مرهم للعين غير بالأدوية إلى كل عين لمنع جفاف القرنية. ليزيل الشعر تماما على منطقة العمليات الجراحية، وتطبيق كريم إزالة الشعر، تركها على البشرة لمدة لا تزيد عن 10 ثانية. ثم تمحو كريم إزالة الشعر باستخدام وسادة الإيثانول الإعدادية.
  5. توسيع وتأمين hindlimb مع قطعة من الشريط ما يقرب من 45 درجة من خط الوسط من الفأرة. وبمجرد أن hindlimb آمنة، ومسح البشرة المكشوفة مع 10٪ البوفيدون / اليود مسحة / الحل، تليها الإيثانول، وتكرار مرتين أخريين لكل منهما. للفترة المتبقية من العملية الجراحية، واستخدام المجهر ستيريو للحصول على عرض موسع للمنطقة hindlimb.
  6. باستخدام ملقط وأشار ومقص جراحي، وجعل شق من كورونافي ما يقرب من 1 سم، من منتصف الفخذ نحو المنطقة الأربية. باستخدام قطعة قطن مبللة غرامة المالحة، وفرشاة بلطف بعيدا تحت الجلد الأنسجة الدهنية المحيطة عضلة الفخذ.
  7. كشف بعناية الشريان الفخذي الأساسي عن طريق تشريح حادة خلال النسيج الدهني تحت الجلد. استقرار الجرح والجراحي الميداني لفضح الأوعية الدموية في العضلات المقربة منتصف العليا.
  8. باستخدام ملقط غرامة، بلطف بيرس خلال غمد الفخذ غشائي لفضح حزمة وعائية عصبية. باستخدام مجموعة نظيف من ملقط غرامة، تشريح وفصل الشريان الفخذي من الوريد الفخذي والعصب في الموقع القريب قرب الفخذ، البعيدة إلى الرباط الإربي. توخي الحذر لتجنب اختراق جدار الوريد الفخذي.
  9. وبعد تشريح، تمر بنوع من 6-0 خياطة الحرير تحت الشريان الفخذي والبعيدة إلى فرع من الشريان الفخذي المنعطف الجانبي (LCFA). انسداد الشريان الفخذي باستخدام عقدة مزدوجة (الشكل 3).
  10. إغلاق شق باستخدام 6-0 خيوط البولي بروبلين. بعد إغلاق الجرح، وحقن SQ 0.5 مل من المياه المالحة الدافئة لعلاج توازن السوائل. وضع الحيوان على رأس وسادة دافئة رايات في قفص الانتعاش ومراقبة مستمرة حتى مستيقظا.
  11. مراقبة الحيوانات خلال ساعة 6 الأولى بعد الجراحة وحقن عامل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كغ، SQ) كل يوم لمدة 3 أيام. إزالة الغرز 10 أيام بعد الجراحة باستخدام مقص العقيمة.

5. استئصال الورم الرئيسي من بتر الساق

ملاحظة: بتر انخفاض hindlimb الحاملة للورم عندما يصل حجم العجل 250 ملم 3 للمجموعة الضابطة أو 3 أيام بعد FAL للمجموعة ميتة.

  1. حلاقة الشعر من الأطراف الورم الحاملة من الساق البعيدة لمنطقة الحوض مع الشعر كليبرز في حين عقد بلطف الحيوان. حقن عامل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كغ، SQ) قبل إجراء العملية.
  2. ضع الماوس في لمحة تعريفية الفصل التخديرالعنبر التي تحتوي على 3-5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ في معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة. ترك الماوس في غرفة تحريض حتى يصبح غير قادر على الاستجابة للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من غرفة تحريض.
  3. وضع الحيوان في حق وضعية الاضطجاع الجانبي على ثنى العقيمة وضعها على وسادة الاحترار على سطح التشغيل. استخدام مخروط الأنف لتوصيله إلى تدفق مستمر من الأيزوفلورين 1-3٪ في 100٪ من الأكسجين بمعدل تدفق 0.8 لتر / دقيقة. تطبيق العقيمة مرهم للعين غير بالأدوية إلى كل عين لمنع جفاف القرنية
  4. تحضير موقع الجراحة باستخدام 10٪ البوفيدون / اليود مسحة / الحل، تليها الإيثانول، وتكرار 3 مرات. تطبيق شاش معقم (على سبيل المثال، ثنى الجراحية) على الماوس للحصول على الجراحي الميداني العقيمة.
  5. جعل الفخذ كفافي شق الجلد المتوسطة، تليها تشريح حادة وتراجع من الجلد قريب. فضح عنيق عائية عصبية الفخذ وسطي على الجانب متوسط ​​الساق، ثم ligateبالقرب من الرباط الإربي باستخدام 4-0 المغلفة (polyglactin 910) امتصاص مواد خياطة الجروح.
  6. إجراء transection منتصف الفخذ من المجموعات العضلية مع مقص، تليها تشريح حادة من الأنسجة اللينة إلى المفصل الوركي الفخذي بحسب. استخدام قطع العظام، وإجراء العظم منتصف الفخذ. باستخدام العقيمة مسحة القطن غرامة أو الإسفنج الجيلاتين امتصاص، اضغط بلطف الموقع العظم لتقليل ومنع النزيف.
  7. إغلاق الجلد المغطي باستخدام مقاطع الجرح الجراحية وحقن 0.5 مل من SQ المالحة الدافئة لعلاج توازن السوائل. وضع الحيوان على رأس وسادة دافئة رايات في قفص الانتعاش ومراقبة مستمرة حتى مستيقظا.
  8. على الجراحة، وجمع عينات من أنسجة الأورام الأولية لRNA، DNA أو عزل بروتين، والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 مئوية. للثقافة الخلية الأولية، وجمع عينات الأنسجة في هذه الخطوة، كما هو موضح في القسم 9 أدناه. إصلاح الأنسجة أطرافهم المتبقية في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لالأنسجة وimmunochemisمحاولة، بما في ذلك الكشف hypoxyprobe-1.
  9. مراقبة الحيوانات لتحرك والألم واستهلاك الغذاء خلال 6 ساعات الأولى بعد الجراحة، ثم كل يوم لمدة 3 أيام. حقن عامل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كغ، SQ) يوميا لمدة 3 أيام. إزالة مقاطع الجرح 10 أيام بعد بتر باستخدام مزيل الجرح كليب.

6. الفئران رصد لوجود الانبثاث

  1. مراقبة الفئران يوميا وتقييمها للعلامات سريرية للورم خبيث على الأقل مرتين في الأسبوع.
    1. مراقبة الحيوانات لوجود macrometastases كما عرض الجماهير التي تتطور في أماكن مختلفة، وعادة ما الكتفين والساقين المقابل والفكين. تحقيقا لهذه الغاية، جس بعناية الرأس والعنق ومنطقة الإبطين، وhindlimb المقابل. تحقق من وجود نقائل الجهاز الداخلية عن طريق انتفاخ في البطن مع التصوير بالرنين المغناطيسي المسح.
    2. تحقق من وجود الانبثاث الرئة عن طريق الضغط على عملية سيفي الشكل (الطرف الأدنى من القص) مع INDEالإصبع العاشر. 24
      ملاحظة: هذا الضغط يقلل من قدرة التنفس حجابي. الفئران مع الانبثاث الرئة المتقدمة تظهر علامات الضائقة التنفسية يتجلى في التنفس شاقة.
    3. مراقبة الحيوانات لأعراض عصبية مثل الشلل الساق وترنح يشير الانبثاث إلى الجهاز العصبي المركزي.
    4. مراقبة الفئران مرة واحدة في الأسبوع على الأقل لفقدان الوزن، ومؤشرا على تطور المرض المحتملين. يعتبر الجسم وفقدان الوزن تزيد عن 15٪ من وزن ما قبل الإجرائية نقطة نهاية إنسانية.

7. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) للكشف الانبثاث

  1. أداء التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف عن الانبثاث في نقاط الوقت المطلوب. 18
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام مطياف الأفقي 7 تيسلا. تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في أيام 15 و 35 بعد بتر للخلايا SK-ES1 وفي يوم 15 لTC71 الخلايا.
  2. ضع الماوس في لمحة تعريفية chambe التخديرص تحتوي على 1-3٪ الأيزوفلورين في خليط الغاز من 30٪ من الأكسجين وأكسيد النيتروز 70٪.
  3. ترك الماوس في غرفة تحريض حتى يصبح غير قادر على الاستجابة للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من غرفة تحريض.
  4. نقل الماوس تخدير على حامل التجسيمي مع التنفس وmonitorization درجة الحرارة مع الادارة مستمرة من 1.5٪ الأيزوفلورين وأكسيد النيتروز بنسبة 30٪. تطبيق العقيمة مرهم للعين غير بالأدوية إلى كل عين لمنع جفاف القرنية. صورة الحيوان إما في 40 أو 23 ملم بروكر حجم الماوس لفائف الجسم كله أو تصوير الدماغ، على التوالي.
  5. استخدام ثنائي الأبعاد، T2 المرجحة نادر تسلسل: TR = 3000 ميللي ثانية، TE = 24 ميللي ثانية، مصفوفة = 256، فوف = 4.35 س 3.0 سم، وسمك شريحة = 0.5 مم، عامل نادر = 4 والمتوسطات = 4. 18
  6. وضع الحيوانات في قفص الانتعاش الحار ومراقبة مستمرة حتى مستيقظا.
    ملاحظة: إن الفئران على التعافي سريعا منذ يستخدم طائرة الضحلة من التخدير.
  7. مراقبة الحيوانات خلال ساعة 6 الأولى بعد التصوير للتأكد من عدم وجود أي آثار سلبية من التخدير.

8. القتل الرحيم والتشريح

  1. الموت ببطء الفئران مرة واحدة الحيوانات الحالية مع الانبثاث كشفها بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي و / أو الأعراض السريرية لتطور المرض.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تمت التضحية الفئران في أيام 50 و 25 بعد بتر للحيوانات تحمل SK-ES1 وTC71 xenografts، على التوالي. في بعض الحالات، كان القتل الرحيم في وقت سابق ضرورية نظرا للعبء ورم خبيث عالية.
  2. الموت ببطء الفئران عن طريق التعرض لثاني 2 في 1.5 لتر / دقيقة (CO 2 في 10-30٪ من غرفة القتل الرحيم المجلد / دقيقة). لضمان موت الحيوان، نفذ خلع عنق الرحم بعد التعرض CO 2.
  3. رش الماوس كامل مع 70٪ من الإيثانول ووضعه في غطاء تدفق الصفحي. جمع الدم عن طريق ثقب القلب باستخدام إبرة 25 G ونصف مع حقنة 1 مل ونقل إلى جمع الدم توأن تحتوي على 2 ملغ من EDTA.
  4. جمع الأنسجة التالية: الطحال والغدد الكظرية، والمبايض والكلى والكبد والرئتين والدماغ والساق اليمنى، ونخاع العظام من كل من العضد والعمود الفقري، وكذلك الانبثاث العيانية موجودة في مواقع أخرى. 25،26
  5. إصلاح نصف كل الأنسجة في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لالأنسجة وكيمياء المناعة، بما في ذلك الكشف hypoxyprobe-1. التقط تجميد النصف الآخر في النيتروجين السائل، ثم تخزينها في -80 مئوية لمدة RNA، DNA أو عزل بروتين. 25،26 لزراعة الخلايا الأولية، وجمع عينات الأنسجة كما هو موضح في القسم 9 أدناه.

9. الثقافة الخلية الأولية

  1. لأداء ثقافة الخلية الأولية، تشريح الأنسجة من الطرف بتر (القسم 5 أعلاه) أو أثناء التشريح (المادة 8 أعلاه) تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي.
  2. إعداد خلية ثقافة وسائل الإعلام يتناسب مع خط الخلية المستخدمة للحقن مثلي، على أن تستكمل مع البنسلين (200 وحدة / مل)،الستربتومايسين (200 ميكروغرام / مل)، fungizone (1 ميكروغرام / مل)، و 0.2٪ الميكوبلازما المضادات الحيوية الوقائية. ضع 2.5 مل من مستنبت الأساسي في لوحة خلية ثقافة 6 سم.
  3. تحديد المناطق الأنسجة السرطانية قابلة للحياة من الأورام الأولية أو الانبثاث، ثم عزل 2-3 شرائح بمعدل 2-3 ملم كل باستخدام مقص العقيمة.
    ملاحظة: تم العثور على عادة الأنسجة السرطانية قابلة للحياة على حواف الورم ويمكن تميز من نخر من قبل ردي اللون أو يميل إلى الحمرة لها، بريق كبير والمظهر الرطب بشكل عام. في المقابل، يعتبر النسيج الميت عادة في مركز الورم، ويقدم باعتباره بيضاء / كريم كتلة اللون مع مملة، والمظهر جبني. 27
  4. نقل قطاعات معزولة إلى لوحة خلية ثقافة 6 سم تحتوي على مستنبت الأساسي هو موضح في الخطوة 9.2.
  5. ثقافة الخلايا تحت الظروف القياسية، كما وصفها في القسم 1 (ملاحظة) و 9.2. 18،28 تحقق من ثقافة لنمو الخلايا الناشئة عن قطعة نسيج، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي ينبغي مراعاتها في غضون أيام قليلة. مرة واحدة الخلايا الوصول إلى نقطة التقاء، ويعرض للتريبسين وترويجها وفقا للتقنيات زراعة الخلايا القياسية.
    ملاحظة: ثقافة الخلية الأولية يمكن استخدامها في وقت لاحق لتقييم النمو وخصائص المنتشر من الخلايا المشتقة من الرقابة ونقص الأوكسجين الأورام، وكذلك خصائصها الجزيئية، كما هو موضح سابقا. 18

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد حقن الخلايا الجذعية الجنينية في عضلة الساق، ويسمح الأورام الأولية أن تنمو إلى حجم العجل من 250 مم 3 (الشكل 1 و 2). الوقت اللازم للأورام للوصول إلى هذا الحجم يتراوح عادة 10-15 يوما لTC71 إلى 20-25 يوما لxenografts SK-ES1، على التوالي. الأورام في حجم العجل من 250 مم 3 المعرض على مستوى منخفض نسبيا من نقص الأكسجة الذاتية (حوالي 3٪ من أنسجة الورم)، استنادا إلى hypoxybrobe-1 (pimonidazole) تلطيخ (الشكل 4...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويشمل نموذجنا مقارنة ورم خبيث في مجموعتين تجريبيتين - مجموعة مراقبة، حيث يسمح للأورام لتطوير في hindlimb تليها البتر عند بلوغ حجم العجل 250 ملم 3، ومجموعة المعرضة للنقص الأكسجين، والذي tumor- يخضع تحمل hindlimb لفال في نفس الحجم، تليها بتر بعد 3 أيام. على الرغم من أن في هذه التجارب وبتر الأورام تعامل FAL مع تأخير بسيط، بالمقارنة مع الأورام السيطرة، لا يزيد حجمها خلال فترة 3 ايام بين ربط وبتر الأطراف. لذلك، هذا النهج يمكن المقارنة بين إمكانيات المنتشر بين أورام أحجام مما...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH): UL1TR000101 (سابقا UL1RR031975) من خلال برنامج جوائز العلوم السريرية والتحويلية ، 1RO1CA123211 ، 1R03CA178809 ، R01CA197964 و 1R21CA198698 إلى JK. تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في مختبر أبحاث التصوير قبل السريري التابع لمركز جورج تاون لومباردي الشامل للسرطان (PIRL) ومعالجة الأنسجة في علم الأنسجة المرضي الشامل لمركز جورج تاون-لومباردي الشامل للسرطان ، وكلاهما مدعوم بمنحة المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسرطان P30-CA051008. يشكر المؤلفون دان شالوثورن وجيمس إي فابر ، قسم بيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء ، جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل ، لمساعدتهم في تصوير الأوعية بالأشعة السينية بعد الوفاة ، وتقديم نظرة ثاقبة وخبرة في تكوين الضمانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
SK-ES1 خلايا ساركوما إوينج البشرية (ES)ATCC
TC71 الخلايايرجى توفيرها من جيبكو
المتوسطة 5A (المعدلة) للدكتورمكوي بواسطة Life Technologies12330-031
RPMI-1640ATCC30-2001
PBSCorning Cellgro21-040-CV
FBSسيجما ألدريتشF2442-500 مل
0.25٪ تريبسين-EDTA (1x)جيبكو من Life Technologies25200-056
Penicillin-StreptomycinGibco by Life Technologies15140-122
Fungizone & reg ؛ AnticoticGibco by Life Technologies15290-018
MycoZap & trade ؛ وقائيLonzaVZA-2032
الكولاجين من النوع الأول ذيل الفئران عاليالتركيب BD Biosciences354249
فئران SCID / البيجHarlan أو Charles River250 (نهر تشارلز) أو 18602F (Harlan)
1 مل محاقن الأنسولين مع 28 & nbsp المرفقة بشكل دائم ؛ ز & frac12 ؛ إبرةBD329424
محلول ملحي (0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم ، USP)Hospira، INCNDC 0409-7984-37
الفرجار الرقميWorld Precision Instruments، Inc501601
الأدوات الجراحيةأدوات العلوم
Rimadyl (Carprofen) عن طريق الحقن Zoetis
Hypoxyprobe-1 (بيمونيدازول هيدروكلوريد صلب)HPI، IncHP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 مجم)HPI، IncCCI-103F-250mg
Povidone-iodine SwabstickPDIS41350
وسادة تحضير الكحول المعقمةفيشر هيلث كير22-363-750
LubriFresh P.M. (زيوت تشحيم العين مرهم) الماصة
VWR مع حاجز الرطوبة المقاوم للماءVWR56617-014   ؛
أوستر جولدن A5 ماكينة قص بيطري أحادية السرعة مقاس 50 شفرةأوستر078005-050-002 (مقص) ، 078919-006-005 (شفرة) لوشن
ناير بزيت الأطفالChurch & شركة دوايت
خياطة Silk 6-0Surgical Specialties Corp752B
Prolene (Polypropylene) 6-0Ethicon8680G
Vicryl (Polyglactin 910) خياطة 4-0   ؛EthiconJ386H
Fisherbrand Applicators (قطن منقى)فيشر ساينتفيك23-400-115
إسفنج أسنان قابل للامتصاص من GelFoam - مقاس 4Pfizer Pharmaceutical9039605
Autoclip Wound Clip ApplierBD427630
مجهر ستيريوأوليمبوسSZ61
مزيل أوتوكليبBD427637
مشبك أوندBD427631
التصوير بالرنين المغناطيسي 7 برنامج TeslaBruker Corporation
Paravision 5.0Bruker Corporation
CO2< / sub> نظام القتل الرحيمVetEquip
25 G 5/8 إبرة (لثقب القلب)حقنةBD 305122
0.1 مل (ل ثقب القلب)TerumoSS-01T
K3< / sub>-EDTA أنبوب دقيق 1.3 ملSarstedt41.1395.105
10٪ فورمالين محايد بالزبدةفيشر ScientificSF100-4
الجذعية الجنينية البشرية توريتسكي الدقيقةالوسادات السفلية

المراجع

  1. Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
  2. Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
  3. Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
  4. Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
  5. Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372(2010).
  6. Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
  7. Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
  8. Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
  9. Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
  10. Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
  11. Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
  12. Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
  13. Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128(2014).
  14. Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
  15. Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
  16. Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
  17. Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
  18. Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
  19. Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
  20. Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
  21. Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
  22. Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
  23. Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
  24. Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
  25. Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
  26. Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
  27. Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
  28. Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
  29. Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
  30. ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نقص الأكسجة الورميربط الشريان الفخذيالزرع الغريب في الموقع الأصليخلايا ساركوما إيوينغصبغ Hypoxyprobe-1تحليل النقائلنمو الورم الأولينقص تروية الطرف الخلفيفئران SCID Beige
في فيفو نموذج لاختبار تأثير نقص الأكسجة على الانبثاث ورم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.