مقالة منهجية

إنشاء وزرع للخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC) ورقة في نموذج التئام السكري

DOI:

10.3791/54539

⸱

أغسطس 4, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هي عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (الخزفية) وتحصد من الدهون الفئران العادية بسهولة. أوراق الرابطة يمكن إنشاؤها باستخدام هندسة الخلايا--ورقة ويمكن زرعها في زوكر الجرذان الدهنية السكري العارضة كامل-سمك الجلد العيوب مع العظام مكشوفة ومغطاة ثم بيلايير جلد الاصطناعي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلد الاصطناعي حققت نتائج علاجية كبيرة في الممارسة السريرية. ومع ذلك، قد يطول علاجات البشرة الاصطناعية للجروح في مرضى السكري مع تدفق الدم إعاقة أو الجروح الكبيرة. ظهرت العلاجات المستندة إلى الخلية كتقنية جديدة لعلاج قرح السكري، وهندسة خلية ورقة تحسنت فعالية زرع الخلايا. وقد اقترح عدد من التقارير أن الدهنية المستمدة من الخلايا الجذعية (الخزفية)، نوع من خلايا mesenchymal stromal (MSC)، يحمل إمكانات العلاج بسبب هذه الوفرة النسبية في الأنسجة الدهنية، وإمكانية الوصول لمجموعة بالمقارنة مع MSCs من الأنسجة الأخرى. ولذلك، يبدو الخزفية مصدرا جيدا لخلايا الجذع للاستخدام العلاجي. في هذه الدراسة، إنشاء أوراق الرابطة من الدهون الدهنية البربخيه العادي لويس الفئران بنجاح باستخدام أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة والمتوسطة الثقافة العادية التي تحتوي على حمض الأسكوربيك. أوراق الرابطة تم زرعها في الجرذان الدهنية السكري (زد دي إف) زوكر، نموذج الفئران من مرض السكري من النوع 2 والبدانة، أن المعرض تقلص التئام الجروح. تم إنشاؤه بجرح على سطح الجمجمة الخلفية وأوراق ASC تم زرعها في الجرح وجلد اصطناعي بلير كان يستخدم لتغطية الأوراق. زد دي إف الفئران التي تلقت أوراق الرابطة كان أفضل التئام الجروح من الفئران زد دي إف دون زرع أوراق ASC. وكان هذا النهج محدودة نظراً لأن الرابطة أوراق حساسة للظروف الجافة، التي تتطلب الحفاظ على بيئة الجرح رطبة. ولذلك، استخدم لتغطية الورقة ASC لمنع تجفيف الجلد الاصطناعي. زرع allogenic أوراق ASC في تركيبة مع الجلد الاصطناعي يمكن أن ينطبق أيضا على غيرها قرح مستعصية على الحل أو حروق، مثل تلك التي لوحظت مع أمراض الشرايين الطرفية وأمراض الكولاجين، وقد تدار للمرضى الذين يعانون من سوء التغذية أو يتم استخدام المنشطات. وهكذا، هذا العلاج قد يكون الخطوة الأولى نحو تحسين الخيارات العلاجية لمرضى السكري الجرح الشفاء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سكان مرضى السكري يتزايد في جميع أنحاء العالم، ووصلت إلى 400 مليون بحلول عام 20151؛ ما يقدر 15-25 ٪ من المرضى الذين يعانون من مرض السكري هم في خطر من تطور قرحة السكري السفلي أقصى2. قرحة السكري السفلي أقصى مستعصية على الحل، وقد تتطلب فترة علاجية طويلة مع إعادة التأهيل التدريب بعد الشفاء الكامل. فترة علاج طويلة وكثيراً ما ينتج عن انخفاض كبير في نوعية حياة المريض. وبالتالي، يجب تطوير علاجات جديدة أن تقليل أو منع تفاقم لعلاج الجروح السكري. نحن الأمثل لتقييم التئام الجرح السكري، قرحة السكري التئام نموذجا في الفئران، الذي يحاكي الظروف السريرية العملية، وتقييم ما إذا كان زرع الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC) الأوراق باستخدام هندسة الخلايا-ورقة تسارع التئام الجروح.

يحمل الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) بإمكانيات ممتازة لتسريع التئام الجروح بسبب قدرتها على التجديد الذاتي، وآثارها إيمونومودولاتوري، وقدرتهم على التفريق في خلية مختلفة الأنساب3. الخزفية نوع من لجنة السلامة البحرية المستمدة من الأنسجة الدهنية، وأنهم يحمل العديد من المزايا المستمدة من الأنسجة الأخرى، بما في ذلك تلك الأوعية المحتملة و paracrine النشاط4،5MSCs. الأنسجة الدهنية وفيرة نسبيا في الجسم البشري، وإمكانية الوصول إليها ويتيح تجميع باستخدام إجراءات كسبها. ولذلك، استخدمت الخزفية تجريبيا لالتئام تطبيقات6،7.

وقد أظهرت التقارير السابقة أن الحقن المباشر لخلية واحدة ماجستير المعلقات في المناطق المحيطة بالجروح ويمكن التعجيل بالجرح الشفاء8،9. ومع ذلك، وعلى الرغم من التقارير للإسراع بالتئام الجروح في نماذج قرحة السكري بعد حقن تعليق خلية واحدة، الوقت البقاء على قيد الحياة من زرع الخلايا في موقع الجرح ليس واضحا.

في هذه الدراسة، قمنا بتطبيق الهندسة خلية ورقة استخدام أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. هذه الأطباق قد تستجيب لدرجة الحرارة البوليمر N-إيسوبروبيلاكريلاميدي تساهمي ملزمة على السطح عن10. طبقة البوليمر المطعمة يسمح لالتصاق الخلايا درجة الحرارة التي تسيطر على أو مفرزة من السطح الطبق الثقافة. يصبح سطح الطبق مسعور في 37 درجة مئوية، والسماح للخلايا بالانضمام وتتكاثر، حين فصل الخلايا تلقائياً من السطح عندما يصبح ماء في درجة حرارة أقل من 32 درجة مئوية. يمكن حصادها الخلايا المستزرعة كورقة خلايا متجاورة مع تقاطعات خلية إلى خلية سليمة ومصفوفات خارج الخلية (ECMs) ببساطة عن طريق تخفيض درجة الحرارة؛ وهكذا، لا proteolytic الإنزيمات التي تلحق الضرر إدارة المحتوى في المؤسسة، مثل التربسين، مطلوب11. ولذلك، يمكن الحفاظ على اتصالات خلية إلى الهندسة خلية ورقة وتحسين فعالية زرع الخلايا.

وباﻹضافة إلى ذلك، زرع خلية ورقة يزيد معدلات بقاء الخلية عند مقارنتها ب حقن الخلية12. واختيرت زوكر السكري الدهنية في الفئران (زد دي إف) في هذا البروتوكول، كنموذج نوع 2 مرض السكري والسمنة مع تأخر التئام الجروح. الفئران زد دي إف تلقائياً وضع السمنة في 4 أسابيع تقريبا. ثم يطورون مرض السكري من النوع 2 مع السمنة بين 8 و 12 أسبوعا من العمر، وعند هذه النقطة يحمل فرط سكر الدم المرتبطة بالانسولين المقاومة ودسليبيدميا hypertriglyceridemia13. كما لوحظت الجرح تأخر الشفاء، تدفق الدم انخفاض في الأوعية الدموية المحيطية، وحدوث السكري14،،من1516. وعلاوة على ذلك، قد يكون من الفئران زد دي إف نموذجا مناسباً لدراسة الشفاء من القرحة الجلدية المستعصية، مثل قرح مرضى السكري.

الاختلافات بين البشر والقوارض في التئام الآليات المرتبطة بالاختلافات التشريحية في الجلد. الجرح الشفاء في الفئران العادية يستند إلى انكماش الجرح، حين التئام الجروح في البشر يستند تشكيل epithelialization إعادة وتحبيب الأنسجة. بشكل عام، الجرح التجبير المستخدمة في نماذج القوارض يساعد على التقليل من انكماش الجرح ويسمح بتشكيل التدريجي للأنسجة تحبيب17، على الرغم من أن يتم إغلاق الجروح في الفئران نونديابيتيك تقريبا تماما بتقلص. ولكن الجرح السكري الانكماش في زد دي إف الفئران البصر، ويحدث الجرح الشفاء في المقام الأول من خلال إعادة ابيثيلياليزيشن وتشكيل النسيج تحبيب؛ وهكذا، أن هذه العملية أشبه بالجرح البشرية شفاء14.

السكري الجروح مع العظام المكشوفة بعد debridement غالباً ما تواجهها سريرياً. تبحث الدراسات السابقة الجراح الجلد كامل-سمك قطرها 12 مم على ظهورهم athymic الفئران عارية،من18إلى19 والجراح الجلد كامل-سمك قطرها 10 ملم على ظهورهم من الفئران العادية20. إلى وضع نموذج السريري لجروح السكري الحاد، أكبر العيوب كامل-سمك الجلد (15 × 10 مم2) مع كشف العظام ودون السمحاق تم إنشاؤها، كما هو موضح سابقا21، في الفئران مع داء السكري من النوع 2 والبدانة.

الفئران أوراق ASC (مراجعة الحسابات) من الخزفية العادية لويس الفئران تم إنشاؤها من خلال زرع allogenic صحائف ASC. في الممارسة السريرية، زرع ذاتي غير مجد لأنه غالباً ما يحمل مرضى السكري مع القرحة مضاعفات السكري الحادة، مثل مستويات الجلوكوز في الدم غير المنضبط ومؤشرات كتلة الجسم عالية، وهذه مضاعفات قضية التئام الاضطرابات التي تزيد من صعوبة الحصول على الأنسجة الدهنية من هؤلاء المرضى. وعلاوة على ذلك، الخزفية من الحيوانات مع معرض داء السكري تغيير خصائص وإعاقة وظيفة22. ولذلك، يصف البروتوكول المعروضة هنا زرع allogenic أوراق مراجعة الحسابات من الفئران العادية وتطبيق الجلد الاصطناعي للفئران السكري.

الجلد الاصطناعي بيلايير المستخدمة في هذا البروتوكول يمنع انكماش عفوية من الجروح ويعزز التوليف النسيج الضام مصفوفة جديدة ويشبه الأدمة صحيح23. في هذا البروتوكول، ووضعها على ورقة مراجعة الحسابات الجلد الاصطناعي والثابتة مع خيوط النايلون لمنع تقلص الجرح أو توسيع الناتجة عن الفئران فضفاضة الجلد. وبالإضافة إلى ذلك، الجلد الاصطناعي يوفر إطارا ثلاثي الأبعاد للأوراق ASC ويحافظ على بيئة رطبة لزرع أوراق ASC والجروح، والجروح ويحمي من العدوى والقوى الخارجية. وأخيراً، يوضع خلع ملابس غير لاصقة فوق الجرح حمايته من التأثيرات الخارجية، والحفاظ على بيئة رطبة جرح، وامتصاص الإفرازات.

ورقة مراجعة الحسابات رقيقة ومرنة، وتشوه ويمكن التقيد بنقل المواقع المستفيدة، مثل ضرب قلب24. هندسة خلية ورقة قد استخدمت لإعادة بناء الأنسجة المختلفة، ويمكن أن تولد الآثار العلاجية25،26. أوراق الرابطة التي يحمل إمكانات العلاجية السريرية قد تسريع الشفاء من العديد من أنواع الجروح. وعلاوة على ذلك، زرع متمكنة من أوراق ASC، جنبا إلى جنب مع استخدام الجلد الاصطناعي، يمكن تطبيقها لمعالجة قرح مستعصية على الحل أو حروق، مثل تلك التي لوحظت في أمراض الشرايين المحيطية أو أمراض الكولاجين، أو أنها يمكن أن تدار للمرضى الذين يعانون من سوء التغذية أو يتم استخدام المنشطات. هذا النهج يزيد من الكفاءة من زرع الخزفية. نموذج الفئران زد دي إف التئام ينتج شرط جرح شديدة التي تمثل عملية التئام الجرح البشرية ويحاكي الظروف السريرية في الحيوانات تجريبية الصغيرة الحجم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية المعروضة أدناه من قبل لجنة رعاية التابعة لكلية الطب بجامعة طوكيو الطبية النسائية والتزمت بجميع متطلبات المبادئ التوجيهية لإجراء التجارب على بشكل سليم.

< p class = "jove_title" >1. تحضير والأدوات ووسائط الثقافة والأطباق

  1. تحضير وسط استزراع كامل باستخدام الحد الأدنى من ألفا المتوسط الأساسي الذي يحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. قم بتخزينه لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. استخدم ذكور الفئران ZDF البالغة كنموذج من النوع 2 للسمنة السكرية. استخدم الوسادة الدهنية لذكور فئران لويس لعزل الأنسجة الدهنية لتحضير صفائح الخلايا.

2. عزل وثقافة rASCs

  1. الحصول على الأنسجة الدهنية من فئران لويس (8-33 أسبوعا ، ذكر) تحت التخدير العام باستخدام الأيزوفلوران.
    1. تحضير جهاز تهوية ميكانيكي للقوارض و 4٪ إيزوفلوران. قم بإعداد العديد من أطراف القطن المعقمة ، والشاش النظيف ، والمشرط ، وحامل الإبرة ، ومقص التشغيل ، وزوج من الملقط ، وخياطة نايلون 5-0. تعقيم الأدوات والمستلزمات الجراحية.
    2. قم بإعداد طبق بتري مقاس 100 مم مع 10 مل من المحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات (PBS) للحفاظ مؤقتا على الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها. قم بوزن طبق بتري باستخدام PBS باستخدام ميزان قبل بدء الجراحة لقياس الأنسجة الدهنية المجمعة. ضع الأدوات والإمدادات الجراحية على ستارة معقمة.
    3. قم بتخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران بنسبة 3-4٪ عبر جهاز التنفس الصناعي للقوارض والحفاظ على الفئران عند 2-3٪ إيزوفلوران أثناء الجراحة. راقب عمق التخدير من خلال مراقبة عمق ومعدل التنفس لكل فأر.
    4. أثناء ارتداء قفازات معقمة ، ضع الجرذ في وضع ضعيف على ستارة معقمة. احلق منطقة الجراحة بشفرة حلاقة كهربائية ونظف الجزء البطني من الفئران باستخدام شاش معقم مبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    5. قم بعمل شق جلدي بطول 5 سم تقريبا باستخدام مشرط في أسفل البطن الجانبي للفئران. كشف وتشريح العضلات المائلة الخارجية. بعد ذلك ، قم بكشف الأنسجة الدهنية البربخية المحيطة بالبربخ. اسحب الأنسجة الدهنية البربخية برفق للخارج.
      ملاحظة: يمكن الحصول على الأنسجة الدهنية على جانبي بطن الفئران.
    6. استئصال الأنسجة الدهنية البربخية فقط ، وتجنب تلف البربخ والخصية والأوعية الدموية البربخية (الشكل S1). انقع الأنسجة الدهنية المستأصلة في PBS في طبق بتري لمنع الجفاف ووزن الأنسجة.
    7. أغلق عضلة البطن ب 5-0 VICRYL والجلد بخياطة نايلون 5-0. بعد ذلك ، أعد كل فأر خضع لعملية جراحية إلى قفص منفصل (فأر واحد لكل قفص).
      ملاحظة: راقب الفئران حتى تتعافى تماما.
  2. عزل rASCs من 2-3 جم من الأنسجة الدهنية (يتم استئصالها من فأر لويس ومعالجتها وفقا لطريقة تم الإبلاغ عنها مسبقا) < فئة الدعم = "xref" >27. باختصار ، قم بهضم الأنسجة الدهنية المستقطعة إنزيميا مع 0.1٪ من الكولاجيناز من النوع A عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للحصول على الجزء اللحمي الوعائي (SVF ؛ الشكل S2).
    1. قم بإعداد العديد من مصافي الخلايا 100 ميكرومتر ، والعديد من الأنابيب سعة 50 مل ، والعديد من الأنابيب سعة 15 مل ، ومشرطين على مقعد بيولوجي نظيف. قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي وقم بتسخين حمام مائي إلى 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد ما يقرب من 50 مل من PBS المعقم في أنبوب سعة 50 مل مع 0.1٪ (التركيز النهائي) من النوع A collagenase.
    2. افرم الأنسجة الدهنية إلى قطع صغيرة باستخدام مشرطين.
    3. انقل جميع الأنسجة الدهنية المفرومة إلى أنبوب سعة 50 مل وأضف PBS ليصل الحجم الإجمالي إلى 15 مل.
    4. ضع الأنبوب سعة 50 مل في وضع مستقيم لمدة 5 دقائق. تخلص من الطبقة العليا واجمع الطبقة السفلية باستثناء الحطام.
    5. أضف 0.1٪ من محلول الكولاجيناز من النوع A إلى الأنبوب سعة 50 مل مع PBS الذي يحتوي على الطبقة العليا من أجل هضم الأنسجة الدهنية إنزيميا.
      ملاحظة: قم بتسخين ما يقرب من 20 مل من PBS لكل 2-3 جم من الأنسجة الدهنية في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    6. قم بإمالة ورج الأنبوب سعة 50 مل برفق عند 120 - 130 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    7. ضع الأنبوب سعة 50 مل في وضع مستقيم لمدة 5 دقائق بعد الرج.
    8. قم بتصفية المحلول باستخدام مصفاة خلية 100 ميكرومتر واسكب المحلول في أنبوب جديد سعة 50 مل. قم بتوزيع المحلول المصفى في أنبوبين سعة 15 مل.
    9. الطرد المركزي المحلول في أنابيب 15 مل لمدة 5 دقائق عند 700 × جم. قم بإزالة الطبقة العليا من المادة الطافية بعناية واترك 5 مل من الطبقة السفلية من المحلول. لا تستنشق الحبيبات.
    10. أضف ما يقرب من 5 مل من وسط الاستزراع الكامل لكل أنبوب سعة 15 مل ، وما يصل إلى 10 مل لكل أنبوب سعة 15 مل ، وأعد تعليق الحبيبات بعناية.
    11. كرر الخطوات 2.2.8 - 2.2.9. ثم احصل على SVF.
  3. قم بإعداد طبقين ثقافيين مقاس 60 سم2. اجمع SVF بعد عمليتي طرد مركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق. قم بتعليق SVF واللوحة 10 مل من محلول SVF على كل طبق ثقافة 60 سم2.
  4. استزراع الأطباق لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪.
  5. تحضير PBS وحمض رباعي الأسيتيك 0.25٪ تريبسين إيثيلين ديامين (EDTA) ، يمكن تخزينه لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  6. بعد الطلاء الأولي (24 ساعة) ، اغسل الخلايا باستخدام PBS 3 مرات لإزالة الخلايا غير المتصلة والحطام. أضف وسيطا طازجا كاملا.
  7. قم بتمرير الخلايا التي تكاد تكون شبه متقاربة في اليوم 3. أضف 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ لمدة 3-5 دقائق < br / > ملاحظة: أكمل خطوة التربسين في غضون 10 دقائق لمنع تلف الخلايا.
  8. راقب الخلايا تحت المجهر الضوئي بعد التربسين للتأكد من أن جميع الخلايا قد انفصلت تماما عن الأطباق. ثم أضف 9 مل من وسط الثقافة الكامل إلى الأطباق.
  9. احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
  10. الزراعة الفرعية للخلايا بكثافة 1.7 × 103 خلايا / سم2 كل 3 أيام حتى المرور 3. استزراع الخلايا المزروعة الفرعية عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي المرطب لحاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪.

3. إنشاء أوراق rASC

  1. قم بإعداد العديد من أطباق الثقافة المستجيبة لدرجة الحرارة بقطر 35 مم. قم بتغطية الأطباق مسبقا باستخدام FBS (أو وسط كامل يحتوي على FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنةCO2 بنسبة 5٪ لأكثر من 1 ساعة < br / > ملاحظة: طبق الاستزراع المستجيب لدرجة الحرارة بقطر 35 مم هو منتج متاح تجاريا.
  2. قم بإعداد صفيحة حرارية واحتضانها عند 37 درجة مئوية للإجراءات التجريبية التالية.< / > ملاحظة: قم بتنفيذ كل إجراء باستخدام أطباق مزرعة مستجيبة لدرجة الحرارة على صفيحة حرارية 37 درجة مئوية لمنع الخلايا من الانفصال التلقائي عن الطبق.
    1. قم بتسخين وسط الاستزراع الكامل المستخدم في الإجراءات إلى 37 درجة مئوية قبل التجريب.
    2. مرور البذور 3 rASCs مشتقة من فئران لويس على طبق ثقافة مستجيب لدرجة الحرارة بقطر 35 مم بكثافة 1.5 × 105 خلايا / طبق لمدة 3 أيام باستخدام حجم إجمالي 2 مل من وسط الاستزراع الكامل.
      ملاحظة: عندما يتم طلاء rASCs على طبق ثقافة جديد ، يجب هز الطبق ببطء ذهابا وإيابا ويسارا ويمينا في حاضنة لتحقيق بذر rASC موحد وورقة rASC سميكة بشكل موحد.
    3. قم بتغيير 2 مل من الوسط إلى 2 مل من وسط الاستزراع الكامل الذي يحتوي على 16.4 ميكروغرام / مل من فوسفات حمض الأسكوربيك وملح المغنيسيوم والهيدرات (AA) في اليوم 3 بعد البذر إلى أطباق الثقافة المستجيبة لدرجة الحرارة المحتضنة على صفيحة حرارية 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين AA المذاب عند -30 درجة مئوية لعدة أشهر.
    4. استزراع الخلايا لمدة 4-5 أيام إضافية واستبدل الوسط كل يومين بوسط جديد يحتوي على AA.
    5. تأكد من انتشار وتوليد ASCs تحت المجهر الضوئي لتحديد ما إذا كانت الفجوات قد حدثت بين الخلايا في ورقة خلية متجاورة.
  3. انقل صفائح الخلايا من الحاضنة إلى سطح الطاولة لمدة 15 - 20 دقيقة لتبريدها إلى درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن الخلايا تنفصل تلقائيا كورقة خلية متجاورة. احصد ورقة rASC من سطح الطبق بزوج من الملقط.
    ملاحظة: عادة ، يمكن التعامل مع صفائح rASC باستخدام زوج من الملقط. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام غشاء النقل لنقل ورقة خلية من طبق المزرعة إلى موقع الجرح إذا كانت ورقة الخلية هشة وهشة.
فئة

4. تحضير نموذج الجرح الخائم الجلدية كامل السماكة وزرع صفائح rASC

  1. تحضير جهاز تهوية ميكانيكي للقوارض و 4٪ إيزوفلوران. قم بإعداد العديد من أطراف القطن المعقمة ، والشاش النظيف ، وخياطة النايلون 5-0 ، ومشرط ، وساق السمحاق ، وحامل إبرة ، ومقص تشغيل ، وزوج من الملقط. تعقيم الأدوات والمستلزمات الجراحية. ضع الأدوات والإمدادات الجراحية على ستارة معقمة.
  2. قم بإعداد PBS والحفاظ عليه في درجة حرارة الغرفة ، جنبا إلى جنب مع بعض الجلد الصناعي وضمادة غير لاصقة. قم بقص الجلد الاصطناعي (15 × 10 مم) والضمادة غير اللاصقة (20 × 15 مم). انقع طبقة إسفنج الكولاجين الداخلية للبشرة الاصطناعية في محلول ملحي قبل استخدام البشرة الاصطناعية.
    ملاحظة: يتكون الجلد الاصطناعي من طبقتين: طبقة خارجية من صفائح السيليكون وإسفنجة كولاجين داخلية.
  3. استخدم فئران ZDF (16-18 أسبوعا ، ذكور ، 500-600 جم) كنموذج للتئام الجروح لمرض السكري من النوع 2 والسمنة.
  4. تخدير فئران ZDF عن طريق استنشاق 4٪ من الأيزوفلوران باستخدام جهاز التنفس الصناعي الميكانيكي للقوارض. تحفيز التخدير باستخدام الأيزوفلوران بنسبة 4 - 5٪ عبر جهاز التنفس الصناعي الميكانيكي للقوارض والحفاظ عليه عند 3 - 4٪ أثناء الجراحة. راقب عمق التخدير من خلال مراقبة عمق ومعدل التنفس لكل فأر عن طريق قرصة إصبع القدم.
  5. أثناء ارتداء قفازات معقمة ، ضع الجرذ في وضع الانبطاح على ستارة معقمة. نظف رأس الجرذ باستخدام شاش معقم مبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واحلق منطقة العملية بشفرة حلاقة كهربائية ، ونظف الجلد بعد الحلاقة باستخدام شاش معقم مبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  6. قم بإنشاء عيب جلدي مربع كامل السماكة (15 × 10 مم2) على رأس فئران ZDF المخدرة عن طريق إزالة الأنسجة الجلدية من البشرة إلى السمحاق. استئصال الجلد والأنسجة الجلدية بمشرط وإزالة السمحاق باستخدام السمحاق السمحاق.
  7. انقل rASCs على طبق الثقافة المستجيب لدرجة الحرارة مقاس 35 مم من الحاضنة إلى بيئة درجة حرارة الغرفة مباشرة قبل الزرع.
  8. راقب rASCs على طبق الثقافة المستجيب لدرجة الحرارة مقاس 35 مم ينفصل تلقائيا كورقة عن سطح الطبق بعد تكوين الجرح. احصد صفائح rASC بعد 7 أيام من الزراعة على أطباق الثقافة المستجيبة لدرجة الحرارة. قم بإزالة الوسط المزروع واغسل ورقة rASC باستخدام PBS ثلاث مرات. انقع ورقة rASC في PBS حتى الزرع لمنع الجفاف.
  9. ضع ورقة rASC على الفور فوق عيب الجمجمة باستخدام زوج من الملقط. إذا كانت ورقة الخلية هشة وهشة ، فيمكن استخدام الغشاء كسقالة لنقل ورقة الخلية من طبق الثقافة إلى موقع الجرح.
  10. قم بتغطية ورقة rASC والعيب بالجلد الاصطناعي (15 × 10 مم2) وأغلق الجرح بحوالي 10 غرز باستخدام خياطة النايلون 5-0. لحماية الجرح ، ضع ضمادة غير لاصقة (20 × 15 مم2) على الجلد الصناعي ، باستخدام 5-0 خيوط نايلون للحفاظ على رطوبة بيئة الجرح وامتصاص الإفرازات><. ملاحظة: ستتم إزالة الضمادات غير اللاصقة بواسطة فئران ZDF في غضون أيام قليلة بعد التطبيق. لذلك ، من الضروري مراقبة الفئران بانتظام بعد الزرع. عادة ، يتم استبدال الضمادة غير اللاصقة كل يومين تحت التخدير العام.
  11. أعد كل فأر خضع لعملية جراحية إلى قفص منفصل حتى يتعافى تماما (فأر واحد لكل قفص). بعد فترة المراقبة ، قتل الفئران الرحيم باستخدام الطريقة المعتمدة لجرعة زائدة من الأيزوفلوران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حاول هذا البروتوكول وضع علاج يستند إلى الخلية جديدة لجروح السكري مستعصية على الحل. بإيجاز (كما هو موضح في الشكل 1)، تم إنشاؤها من الفئران العادية باستخدام هندسة الخلايا-ورقة أوراق مراجعة الحسابات متمكنة وتم زرع ثم استخدام بلير للجلد الاصطناعي على عيب كامل-سمك جلد في الفئران السكري. صور المجهر الخفيفة مثال جيد لورقة مراجعة الحسابات (الشكل 2A) ومثالا سيئاً لورقة مراجعة الحسابات (الشكل 2) مبينة في الشكل 2. عندما يتم مطلي الخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أن الخطوات الأكثر أهمية لنجاح استزراع ورقة مراجعة الحسابات كما يلي: 1) يجب الحفاظ على درجة الحرارة عند حوالي 37 درجة مئوية خلال استزراع على أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. أثناء إنشاء ورقة مراجعة الحسابات، تم تنفيذ كل إجراء من الإجراءات على صفيحة حرارية 37 درجة مئوية، وقد ارتفعت درجة حرارة كل كاشف إلى 37 درجة مئوية لمنع الخلايا من فصل عفويا من الطبق31. 2) ويجب رصد على الفئران زد دي إف المتلقية منع إزالة الملابس غير لاصقة، هو أمر حاسم لنجاح زرع أوراق مراجعة الحسابات. إذا تمت إزالة الملابس، يج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب التالية تكشف عن العلاقات المالية ذات الصلة لهذا المنشور: اوكانو تيرو هو مؤسس ومدير مجلس إدارة شركة البذور الخلية, وتراخيص التكنولوجيا وبراءات الاختراع من جامعة "طوكيو النسائية" الطبية، واوكانو تيرو وياماتو ماسايوكي هم أصحاب المصلحة في الجامعة الطبية خلية البذور وشركة طوكيو "المرأة" يتلقى أموالا للبحث من شركة البذور الخلية تعلن مؤلفين آخرين أن لم يكن لديهم العلاقات المالية ذات الصلة لهذا المنشور.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتور يوكيكو كوجا الإدارة من البلاستيك وجراحة، "كلية الطب جامعة جونتيندو"، لتقديم المشورة العملية. ونشكر أيضا السيد هيدكازو موراتا من "مركز السكري من النساء طوكيو الطبية كلية الطب بجامعة" للدعم الفني الممتاز. وأيد "إنشاء مراكز الابتكار" هذه الدراسة "المتقدم البرنامج مجالات البحوث المتعددة التخصصات" المشروع لنظم الابتكار النامية "خلية ورقة الأنسجة الهندسة مركز (كستيك)" من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) في اليابان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
&-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
مصل الأبقار الجنينية (FBS)اليابانBioserum المحدودة.S1650-500
البنسلين / الستربتومايسينلايف تكنولوجيز15140-122
كولاجيناز أروش للتشخيص10 103 578 001مانهايم ، ألمانيا
60 سم < سوب >2< / سوب> طبق زراعة الأنسجة بريمارياBD Biosciences353803بحيرات فرانكلين ، نيوجيرسي
دولبيكو محلول ملحي للفوسفات (PBS)لايف تكنولوجيز1490-144
0.25٪ حمض رباعي الأسيتيك تريبسين إيثيلين ديامين (EDTA)Life Technologies25200-056
L-حمض الأسكوربيك فوسفات ملح المغنيسيوم n-hydrateواكو013-19641
طبق ثقافة مستجيب لدرجة الحرارة مقاس 35 مم (UpcellTM< / sup>) CellSeedNUNC-174904طوكيو ، اليابان
لوحة Microwarm (MP-1000)Kitazato Science Co.، Ltd. 1111
جهاز التنفس الصناعي الميكانيكي للقوارضStoelting# 50206Wood Dale ، IL
4٪ isofluranePfizer Japan114-13340-3طوكيو ، اليابان
بشرة اصطناعية (Pelnac & reg ؛ < / sup>)سميث & أمبير ابن أخPN-R40060  طوكيو ، اليابان
ضمادة غير لاصقة (Hydrosite plus & reg ؛ < / sup>)سميث & أمبير ابن أخ66800679المعروف باسم Allevyn non-sticksing® < / sup> في الولايات المتحدة
خياطة نايلون 5-0AlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBESGreiner bio-one227 261
15 مل أنبوب الطرد المركزيCorningIncorporated 430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEALHU-FRIEDYP14شيكاغو ، إلينوي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
  2. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
  3. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  4. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  5. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
  8. Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
  9. Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
  10. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
  11. Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
  12. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  13. Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
  14. Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
  15. Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
  16. Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
  17. Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
  18. Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
  19. McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
  20. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  21. Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
  22. Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
  23. Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
  24. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  25. Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  26. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  27. Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
  28. Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
  29. Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
  30. Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
  31. Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة