مقالة منهجية

طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار

DOI:

10.3791/54555

⸱

أكتوبر 23, 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأظهرت أساليب لعزل myocytes العقدة الجيبية الأذينية (صواريخ سام) من فئران بالغة لالمشبك التصحيح الكهربية أو التصوير الدراسات. الخلايا المعزولة يمكن استخدامها مباشرة أو يمكن حافظت في الثقافة للسماح التعبير عن البروتينات المثيرة للاهتمام، مثل صحفيين المشفرة وراثيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

myocytes العقدة الجيبية الأذينية (صواريخ سام) تكون بمثابة منظم ضربات القلب الطبيعية للقلب، والشروع في قلب كل فوز عن طريق توليد إمكانات العمل عفوية (الجزائرية). وتعكس هذه الصورة المتقدم جهاز تنظيم ضربات القلب والنشاط المنسق العديد من التيارات الغشاء والدراجات الكالسيوم داخل الخلايا. إلا أن الآليات الدقيقة التي تدفع النشاط تنظيم ضربات القلب عفوية في صواريخ سام لا تزال بعيدة المنال. تماما صواريخ سام معزولة هي إعداد ضروري لتجارب لتشريح الأساس الجزيئي للpacemaking القلب. ومع ذلك، فإن التشريح غير واضحة، تسليخ مجهري معقد، وصعب ظروف الهضم الأنزيمية حالت دون انتشار استخدام صواريخ سام معزولة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، كانت الطرق غير متوفرة حتى وقت قريب للسماح الثقافة على المدى الطويل من صواريخ سام للدراسات تعبير البروتين. هنا نقدم خطوة بخطوة بروتوكول والفيديو مظاهرة لعزل صواريخ سام من فئران بالغة. ويتجلى طريقة أيضا للحفاظ على الكبار الماوس صواريخ سام في المختبر وexpressiعلى البروتينات الخارجية عن طريق عدوى الفيروسة الغدانية. معزولة تماما وصواريخ سام مثقف أعدت عن طريق هذه الأساليب هي مناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات الكهربية والتصوير.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

myocytes جهاز تنظيم ضربات القلب في العقدة الجيبية الأذينية للقلب (myocytes الجيبية الأذينية، "صواريخ سام") تولد عفوية، إمكانات العمل إيقاعي (الجزائرية) التي تنتشر من خلال عضلة القلب للشروع في كل نبضة قلب. وكانت التجارب باستخدام صواريخ سام معزولة تماما من العديد من الأنواع ضروري لتوضيح الآليات التي تساهم في توليد النشاط تنظيم ضربات القلب. صواريخ سام هي العضلية درجة عالية من التخصص التي تختلف كثيرا عن نظرائهم في الأذين والبطين عضلة القلب من حيث التشكل، وظيفة، والتعبير البروتين. السمة المميزة لنقاط وصول عفوية في صواريخ سام هو الاستقطاب عفوية أثناء انبساط الذي يدفع غشاء المحتملة لعتبة لتحريك AP المقبل 1،2. هذا "إمكانية ت....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كولورادو آنشوتز الحرم الجامعي الطبية. أدناه وقد تم تحسين بروتوكول قياسي باستخدام الذكور C57BL / 6J الفئران من 2-3 أشهر من العمر.

1. إعداد الأرصدة واللوازم الحل مقدما من التجارب

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى مواد الجدول للمعدات والتجهيزات اللازمة.

  1. إعداد 1 لتر كل الحلول التالية كما ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكولات وصفها هنا استخدمت سابقا لعزل نشط بشكل عفوي صواريخ سام من الفئران الكبار التي هي مناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات المشبك التصحيح مختلف 5-8. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البروتوكولات تسمح للصواريخ سام المعزولة التي لا يمكن الحفاظ عليه في الثقافة لمدة تصل إلى واحد. نقل الجينات إلى الخلايا المستزرعة ويمكن تحقيق ذلك عن طريق عدوى الفيروسة الغدانية 9. النتائج المعروضة في هذا القسم مستمدة من عملنا السابق، وهي واردة هنا كأمثلة .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الورقة بروتوكولات وإجراءات تفصيلية للعزلة وثقافة متباينة تماما myocytes العقدة الجيبية الأذينية من فئران بالغة. بروتوكول العزلة تنتج موثوق صواريخ سام الماوس نشطة بشكل عفوي مناسبة لأي تحليل الكهربية فوري أو ثقافة اللاحقة. وقد تم الإبلاغ عن بروتوكولات مماثلة من قبل العديد من المجموعات الأخرى (على سبيل المثال، انظر المراجع 11،12،10،13-17). ومع ذلك، لدينا بروتوكول للحفاظ على الماوس الكبار صواريخ سام في المختبر يحافظ على التشكل مميزة، النشاط العفوي، والخصائ.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور كريستيان ريكرت على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R01-HL088427) إلى CP. تم دعم EJS من قبل 5T32-AG000279 من المعهد الوطني للشيخوخة. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة سيلجروارد / المطاطداو كورنينج184 SIL ELAST KIT 0.5 كجم
ماصات البورسليكات 9 بوصاتفيشر ساينتفيك13-678-20C
استزراع صغيرة مستديرةفيشر ساينتفيك352059
استزراع كبيرة مستديرةكورنينج14-959-11B
إيلاستاورثينجتون LS002279 الكيمياء الحيوية
NDC 25021-400-10
الماوس LamininCorningCB-354232
12 مم أغطية زجاجية مستديرةFisher & nbsp ؛12-545-80
لوحة ثقافة 24 بئرفيشر08-772-1
Ad-mCherryVector Biolabs1767
Ad-eGFPVector Biolabs1060
بلاستيك ، ماصة نقل يمكن التخلص منهامقص فيشر Scientific
MicroFisher Scientific Fisher Scientific17-467-496
Dumont # 4 ملقطRoboz InstrumentsRS-4904
ملقط الأنسجةRoboz InstrumentsRS-8164
تشريح مقص القزحيةWPI، Inc.501264
دبابيس تشريحأدوات العلوم الدقيقة26002-20
كلوريد الصوديومسيجما71376
KClسيجما60128
KH2< / sub>PO4< / sub>Sigma60353
HEPESSigma54457
الجلوكوزSigmaG0350500
MgCl2< / sub>SigmaM8266
CaCl2< / sub>SigmaC1016
التورينSigmaT0625
BSASigmaA2153
K-glutamateSigmaG1501
K-aspartateSigmaA6558
MgSO< sub>4< / sub>سيجماM7506
الكرياتينسيجماC0780
EGTAسيجماE3889
Mg-ATPسيجماA9187
أمفوتريسين-بفيشر العلمي1397-89-3
إيزوبروتيرينولكالبيوكيم420355
ميديا 199سيجماM4530
2،3-بوتانيديون مونوكسيم (BDM)سيجماB0753
مصل الأبقار الجنيني (FBS)سيجماSH30071
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجماA5611
الأنسولين   سيجماI3146
ترانسفيرينسيجماI3146
السيلينيومسيجماI3146
البنسلينجنرال إي للرعايةالصحية SV30010
الستربتومايسينهيكلونSV30010
الصناعي أنابيب القاع أنابيب القاع Liberase TM Roche 5401119001 محلول تفكك الأنسجة Heparin SAGENT Pharmaceuticals 

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
  2. DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
  3. Mangoni, M., Nargeot, J.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة