يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد CD4

8.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54569

⸱

نوفمبر 8, 2016

 , 
1Instituto de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas, Centro de Investigación en Dinámica Celular, Laboratorio de Glicobiología Humana y Diagnóstico Molecular, Universidad Autónoma del Estado de Morelos

في هذه المقالة

ملخص

نحن تصف بروتوكول تلوين الأجسام المضادة القياسية لاستخدامها في المجهر لتحديد التعبير الغشاء وتوطين gangliosides في الراحة والسذاجة خلايا CD4 + T الإنسان تفعيلها. كما وصفت هي في الوقت الحقيقي التجارب PCR باستخدام <40000 الخلايا التي لا تتطلب معدات إضافية منخفضة الدخل الحمض النووي الريبي.

الملخص

الطرق الموضحة في هذه الوثيقة لتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة في تعليق وتمسكهم في coverslips لتحليل الفحص المجهري متحد البؤر تسمح للتوطين المكاني وتصور gangliosides تشارك في تنشيط الخلايا CD4 + T، هذا التعبير تكملة التنميط التجارب مثل قياس التدفق الخلوي، غرب النشاف أو في الوقت الحقيقي PCR. الكمي التعبير غانغليوزيد من خلال التدفق الخلوي وتوطين الخلوية من خلال الفحص المجهري يمكن الحصول عليها عن طريق استخدام أجسام مضادة لمكافحة غانغليوزيد مع قابلية عالية وخصوصية. ومع ذلك، والمناولة المناسبة للخلايا في تعليق يتضمن علاج لوحات الثقافة لتعزيز الالتزام اللازم لمضان أو اكتساب المجهر متحد البؤر. في هذا العمل، ونحن تصف بروتوكول لتحديد GD3 وGD2 التعبير غانغليوزيد وcolocalization مع TCR خلال السذاجة تنشيط الخلايا CD4 + T. أيضا، الحقيقي رووصف التجارب IME PCR باستخدام <40000 خلايا لتحديد GD3 والجينات سينسيز GM2 / GD2، مما يدل على أن يمكن القيام بها مع عدد قليل من الخلايا ودون الحاجة إلى مجموعات إضافية منخفضة الدخل RNA تجارب التحليل الجيني.

المقدمة

خلايا CD4 + T تنسق الاستجابة المناعية من خلال وظائف المستجيب على بعد التنشيط بواسطة مستضد الخلايا 1. دراسة الآليات الخلوية التي يتم التضمين خلال تفعيل تتيح نظرة ثاقبة على العملية الأساسية لجهاز المناعة. ومع ذلك، فإن دراسة خلايا CD4 + T ساذجة يمكن أن تكون معقدة لأنها تمثل السكان قليل جدا من الخلايا في محيط الدم 2.

من خلال الفحص المجهري مضان درسوا عدة تقارير توطين الجزيئات المختلفة المشاركة في تنشيط الخلايا CD4 + T، أساسا البروتينات المرتبطة الغشاء البلازمي 3. وgangliosides وحمض تحتوي على الشحميات السفنغولية السكرية اللعابي وعلى الرغم من أنها قد درس على نطاق واسع في الخلايا العصبية حيث هم وفيرة، وخلايا أخرى مثل الخلايا المناعية التعبير أيضا gangliosides مع وظائف ذات الصلة بيولوجيا 4،5. ذكرنا سابقا ثار خلال تنشيط خلايا CD4 + T ساذجة الإنسان هناك upregulation من α2،8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 سينسيز) وسينسيز GM2 / GD2، التي تحفز neoexpression سطح كبيرة من GD2 وupregulation من GD3 غانغليوزيد 6. مزيد من الدراسة من GD3، GD2 وgangliosides آخرين في الخلايا المناعية ضرورية لاستكمال وجهة نظر البروتين على أساس جزئي وظيفة المناعة.

عادة، ويستند دراسة التعبير غانغليوزيد على تقنيات مثل اللوني طبقة رقيقة (TLC) 7، ولكن هذه التقنية لا تسمح للتوطين المكاني للgangliosides في غشاء البلازما أو في مقصورات التحت خلوية، والحد من التحليل البيولوجي.

في هذا العمل، ونحن تصف بروتوكول لتحديد الأجسام المضادة التي تتوسط وتوطين GD3 وGD2 gangliosides في السذاجة خلايا CD4 + T الإنسان وPBMCs بعد مكافحة CD3 / تفعيل مكافحة CD28. مع هذا البروتوكول هو أناالممكن أيضا لتحليل الجينات والتعبير الجزيئي للgangliosides في عدد قليل من الخلايا في تعليق، مع الحصول على صور ذات جودة عالية 6، بالنظر إلى حجم صغير من الخلايا الليمفاوية (9 ميكرون).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على الدم المحيطي من المانحين الذكور صحية للموافقة المسبقة عن وموافقة لجنة أخلاقيات لمركز البحوث أون DINAMICA Celular- جامعة أوتونوما ديل استادو دي موريلوس.

1. عزل وتفعيل خلايا الإنسان السذاجة CD4 + T

  1. جمع 2 مل من الدم المحيطي المستمدة من المانحين الإنسان الصحية من خلال الموافقة المستنيرة وتمييع مع 2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة-EDTA (1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 7.4). إضافة الدم المخفف ببطء على رأس 3 مل من محلول السكروز مع 1.077 كثافة كما هو موضح سابقا 8.
    ملاحظة: سوف التفاضلية الهجرة خلال الطرد المركزي الناتجة عن الاختلافات في الكثافة يسبب الكريات الحمراء إلى الرواسب تماما، وسوف طبقة من خلايا وحيدة النواة أقل كثافة تشكل أعلاه. و2 مل من الدم المحيطي تقديم ما يقرب من 0.5 × 10 6 خلايا CD4 + T ساذجة بعد purificatiعلى الخطوات.
  2. الطرد المركزي 30 دقيقة في 250 x ج في 21 ° C (استخدام الدوار للأنابيب أسفل مستديرة مع زاوية ثابتة من 30 ملم) مع عدم وجود كسر لتوليد التدرج من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs). بعد الطرد المركزي، وPBMCs يمكن ملاحظتها بوضوح باعتباره حلقة بيضاء. جمع PBMCs مع ماصة ونقل إلى أنبوب معقم للغسيل.
  3. بعد ثلاثة يغسل بمحلول PBS-EDTA في 250 x ج لمدة 10 دقيقة شروع في تنقية خلايا CD4 + T ساذجة. تتوفر طرق الفرز أو عدة أنواع من مجموعات تنقية لهذا الغرض. يفضل استخدام> 1 × 10 7 PBMCs لتنقية.
    1. تنقية خلايا CD4 + T ساذجة عن طريق الانتقاء السلبية مع حبات مغناطيسية. أداء اختيار السلبية المضادة CD45RO، CD8، CD14، CD15، CD16، CD19، CD25، CD34، CD36، CD56، CD123، ومكافحة TCRγ / δ، ومكافحة HLA-DR، وCD235a (glycophorin أ) الأجسام المضادة. تقييم نسبة النقاء من خلال تحديد خلايا CD4 + CD45RA + خلال fالخلوي منخفض.
      ملاحظة: اختياريا، انتقل إلى حضانة PBMCs بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و CO 2 مع كثافة من 1 × 10 6 خلية / مل في 10 مل من المتوسط تستكمل لتشجيع الانضمام الوحيدات ومواصلة تنقية خلايا CD4 + T ساذجة 5٪. واستعادة كفاءة خلايا CD4 + T ساذجة من الدم المحيطي يعتمد إلى حد كبير على نظام تنقية.
  4. إعداد 24 لوحات جيدة زراعة الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني مع 5 ميكروغرام / مل مكافحة CD3 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة واحتضان لمدة لا تقل عن 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: لوحات مع 96 بئرا يمكن استخدامها عندما يتم استخدام عدد أقل من خلايا CD4 + T ساذجة (على سبيل المثال، 2 X10 4 -1 × 10 5).
  5. إزالة مكافحة CD3 الأجسام المضادة تخفيف من 24 جيدا أو 96 لوحات جيدا وتغسل الصحون مرتين باستخدام معقم برنامج تلفزيوني 1X.
  6. تمييع الخلايا CD4 + T ساذجة مع> 95٪ من النقاء (CD4 +CD45RA +) إلى كثافة من 1 × 10 6 خلية / مل في المتقدم المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 3٪ من مصل بقري جنيني (أو RPMI تستكمل مع 10٪ من مصل الدم)، 2 الجلوتامين مم والمضادات الحيوية (1 يو / البنسلين مل، 1 ميكروغرام / مل الستربتومايسين).
    ملاحظة: إذا كان مطلوبا توطين غانغليوزيد في PBMCs، اتبع نفس البروتوكول لتخفيف والتحفيز على النحو المبين أدناه.
  7. إضافة 500 ميكرولتر من التخفيف خلية لمكافحة CD3 الآبار المغلفة والآبار غير المغلفة (الخلايا السيطرة) في 24 لوحة جيدا. بدلا من ذلك، إضافة 100 ميكرولتر من التخفيف الخلية إلى الآبار من 96 لوحة جيدا.
  8. استكمال الشروط تحفيز خلايا CD4 + T ساذجة في مكافحة الآبار CD3 المغلفة بإضافة 1 ميكروغرام / مل من مكافحة الأجسام المضادة CD28.
  9. إبقاء يستريح خلايا CD4 + T وتحكم في الآبار غير المغلفة دون إضافة الأجسام المضادة CD28. احتضان يستريح وتنشيط خلايا CD4 + T لل0-72 ساعة تحت ظروف قياسية من 37 درجةC و 5٪ CO 2.
  10. للتحقق من تفعيل كاف تقييم التدفق الخلوي التعبير عن CD69 تنشيط مبكر علامة (16 ساعة بعد تفعيل) أو CD25 أواخر تنشيط علامة (48 ساعة بعد تفعيل) في راحة وتنشيط السذاجة خلايا CD4 + T المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في غياب أو وجود لمكافحة CD3 / CD28 الأجسام المضادة 9،10.

2. الالتزام من يستريح والمفعلين خلايا CD4 + T السذاجة

  1. تعقيم 12 ملم coverslips جولة قبل التعقيم والتعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  2. مكان coverslips في لوحات ثقافة الخلية 24-جيدا العقيمة.
    ملاحظة: للحصول على الثقافات مع أقل من 1 × 10 5 خلايا فمن الأفضل لاستخدام غرف الشرائح مع آبار صغيرة تكييفها لمنع تشتت خلايا في ساترة.
  3. coverslips معطف (أو غرفة الشريحة) مع 200 ميكرولتر من بولي-L-ليسين (MW 150-300 كيلو دالتون) 0.1٪ (ث / ت) حل واحتضان لمدة 5 دقائق في صدرجة الحرارة أوم (RT)، وإزالة والجافة لا يقل عن 1 ساعة على RT.
  4. مزيج بعناية وجمع يستريح وتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة من 24 لوحات جيدا. عد الخلايا وإذا لزم الأمر ضبط مع المتوسط تستكمل جديدة لنقل 1 × 10 5 الخلايا للل coverslips المغلفة بولي-L-يسين. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 6 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

3. جمع وتثبيت لليستريح والمفعلين السذاجة CD4 + T الخلايا

  1. إزالة بعناية متوسطة من الراحة مثقف وتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة.
  2. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة RT ببطء.
    ملاحظة: بالإضافة دقيق وإزالة الحلول من الآبار يمنع من الخلايا المفرزة من ساترة.
  3. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني آخر لإزالة بدقة سائل الإعلام والثقافة.
  4. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر تصفيتها 4٪ امتصاص العرق (FILTالتموينية يزيل المجهرية الدقيقة التي يمكن أن تتداخل مع التحليل المجهري)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT (المفضل) أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    تحذير: لامتصاص العرق هو مركب سام ومتقلبة. ومن المعروف أن يكون مسرطن بشري. استخدام بعناية مع بروتوكول السلامة المناسبة.
  5. إزالة تثبيتي، ويغسل ما لا يقل عن مرتين مع برنامج تلفزيوني في RT.
  6. انتقل إلى الخطوة التالية أو الحفاظ على الآبار لوحة مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أيام حتى تلطيخ.
    ملاحظة: العقم أثناء هذه العملية يساعد على تجنب نمو الكائنات الحية الدقيقة.

4. تلطيخ، تركيب والتخيل التي كتبها متحد البؤر المجهري

  1. إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار. إضافة 500 ميكرولتر من عازلة تمنع الباردة (برنامج تلفزيوني 1X، 0.5٪ معيار درجة زلال المصل البقري، 1٪ مصل بقري جنيني 7.4 درجة الحموضة). احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد.
  2. إزالة عازلة تمنع بعناية وإضافة الأجسام المضادة الأولية (مكافحة gangliosides GD3 استنساخ R24، GD2 استنساخ 14G2a)،مكافحة CD25 PE-مترافق وAPC مترافق مكافحة TCR وisotypes ضوابط مخففة في عرقلة العازلة إلى 2.5 ميكروغرام / مل.
  3. احتضان 2 ساعة على الجليد أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: التحريض المداري البطيء هو الأفضل.
  4. إزالة الأجسام المضادة بعناية وإضافة ببطء 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كرر مرتين.
  5. إضافة الأجسام المضادة الثانوية (FITC مكافحة IgG3 مترافق لR24 مكافحة GD3، اليكسا فلور 488 مترافق أو فلور اليكسا 647 مترافق مكافحة IgG2a ل14G2a مكافحة GD2) المخفف في عرقلة العازلة إلى 0.1 ميكروغرام / مل.
  6. احتضان لمدة 1 ساعة على الجليد في الظلام دون أن تهتز.
  7. يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني كما هو موضح في 4.4). إبقاء الآبار مع ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتجنب جفاف العينات.
  8. إضافة هويشت 333258 صمة عار المخفف في برنامج تلفزيوني إلى 0.1 ميكروغرام / مل.
  9. احتضان 15 دقيقة في RT وإزالة. يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني.
  10. ضع الشرائح على منشفة ورقية، وإضافة 20 ميكرولتر من الحل تركيب (50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني) أو حل تجاري تصاعدالصورة لتجنب يتلاشى والتبريد من العينات.
  11. اختيار بعناية ساترة مع ملاقط غرامة ووضعه على حل المتصاعدة. تأكد من أن الجانب ساترة حيث تعلق الخلايا في اتصال مع الحل. ختم لل coverslips مع طلاء الأظافر وتحليلها باستخدام مضان أو المجهري متحد البؤر.

5. عزل الحمض النووي الريبي

  1. إعداد CD3 الأجسام المضادة ل(5 ميكروغرام / مل) مغلفة لوحات 96-جيدا. احتضان 4 × 10 4 ساذجة خلايا CD4 + T / جيد في 100 ميكرولتر من مستنبت تستكمل مع الأجسام المضادة CD28 المضادة (1 ميكروغرام / مل) لإكمال التحفيز. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل 0 إلى 72 ساعة.
  2. بعد مختلف الأوقات بعد تفعيل وضع الخلايا في أنبوب microcentrifuge.
  3. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  4. إزالة طاف وإضافة 1ML كاشف Trizol.
  5. احتضان لمدة 5 دقائق على RT والحفاظ على عينة -8076؛ مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة. المضي قدما في عزل الحمض النووي الريبي عند الحاجة.
    ملاحظة: ترك العينة في -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة يحسن العائد الحمض النووي الريبي. أيضا، استخدام قفازات اليد أمر ضروري لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي RNases.
  6. تذويب العينة الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في حمام مائي.
  7. إضافة 200 ميكرولتر الكلوروفورم ويهز بقوة باليد لمدة 30 ثانية (لتجنب الخلط عدوانية من الحمض النووي الريبي قبل vortexing). احتضان 5 دقائق على RT.
  8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية.
  9. استرداد المرحلة المائية إلى أنبوب microcentrifuge جديد.
  10. إضافة 500 ميكرولتر الأيسوبروبانول وعكس أنبوب ثلاث مرات.
  11. احتضان 10 دقيقة في RT وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية.
  12. تجاهل طاف بواسطة انقلاب.
  13. إضافة 1 مل من الجليد الباردة الايثانول 75٪ وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية.
  14. تماما تجاهل طاف وتجفيف بيليه RNA من خلال ترك الغطاء من أنبوب مفتوحة.
    ليسالبريد: عند هذه النقطة بيليه ليست واضحة للعيان. المتابعة على أية حال.
  15. Resuspend وبيليه في 20 ميكرولتر من الماء الصف الجزيئية. حساب التركيز والنقاء من الأحماض النووية عن طريق قياس 260 نانومتر و 280 نانومتر الامتصاصية باستخدام معمل NanoDrop.
  16. المضي قدما بحذر إلى توليف [كدنا باستخدام أي مجموعة الناسخ العكسي التقليدية وبعد بروتوكول manufacturer's.
    ملاحظة: يتم الحصول على حوالي 0،5-2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي 4 × 10 4 خلايا CD4 + T ساذجة. [كدنا يمكن synthetized من 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي واستخدامها في الوقت الحقيقي تفاعلات PCR دون الحاجة إلى مجموعات المدخلات المنخفضة الحمض النووي الريبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بروتوكول وصفها في هذه المخطوطة يجعل نوعية جيدة من مثقف ويستريح الالتزام والسذاجة خلايا CD4 + T الإنسان المنشط (الشكل 1). تظهر خلايا CD4 + T تنشيط الشخصي التكاثري مميزة (الشكل 1B) بالمقارنة مع حالة الراحة (الشكل 1A). وCD25 أواخر تنشيط علامة مفيدة لتقييم تفعيل كفاءة في 72 ساعة لوحظ من قبل المجهر متحد البؤر (الشكل 1C). يتم استخدام علامة CD69 حاليا منصب مبكرة تنشي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول صفها يمكن استخدامها لتوطين gangliosides أو البروتينات في تعليق خلية من خلايا CD4 + T أو الخلايا المناعية الأخرى (على سبيل المثال، PMBCs، الشكل 5) بدءا من عدد صغير من الخلايا. ونظرا لصغر حجم خلايا T وخصائص غير ملتصقة، واقتناء مضان الصور المجهرية النتائج إلى ضعف المعلومات أو جودة منخفضة إذا لم يتم التقيد الخلايا بشكل صحيح.

هذا البروتوكول جنبا إلى جنب مع تحليل نوعية جيدة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نحن ممتنون للدكتور خوسيه لويس دانيوتي على التعليقات. نشكر المساعدة المقدمة إلى الدكتور ج. أرتورو بيمنتل والمختبر الوطني للميكروسكوبيا أفانزادا-UNAM للحصول على صور متحدة البؤر. آي إم - د. و T.M.V.C. تم دعمها بمنح 157634 و 253596 من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACYT) و Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa و A.C. T.M.V.-C. حاصل على منحة دراسية (245192) من CONACYT. كما نشكر الدعم الذي قدمته Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMI 1640 المتقدمة Thermo Fisher Scientific12633-012ممتلئ ب 3٪ FBS
ماوس مضاد للجسم المضاد للإنسان CD3eBioscience16-0037-81OKT3 استنساخ
الفأر المضاد للجسم المضاد للجسم المضاد للإنسان CD28ebioscience16-0288-81CD28.6 استنساخ
الفأر المضاد للإنسان GD3   الجسم المضادAbcamab11779R24 استنساخ
الفأر المضاد للجسم المضاد للإنسان GD2سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-5383114G2a استنساخ
FITC مترافق مضاد للفأر IgG3
الجسم المضاد		Abcamab97259
Alexa Fluor 488 مضاد للماوس المترافقThermo Fisher Scieni & iexcl ؛ tificA-21131
IgG2a الجسم
Alexa Fluor 647 المترافق مضادللفأر Thermo Fisher Scieni & iexcl ؛ الأجسام المضادةTific A-21241
IgG2a
Ficoll Paque-PlusGE17-1440-02 
كاشف TrizolInvitrogen15596-026
Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II ، MACS البشريMiltenyi Biotec130-094-131
BD FACSAria IIBD BiosciencesSorting   ؛
نظام انزلاق غرفة Nunc Lab-tekSigma-AldrichC7182
Olympus FV 1000 مجهر ليزر متحد البؤر (أوليمبوس)  أوليمبوستستقيم BX61WI و IX81 
التمهيدي التسلسل الأمامي GD3 synthase5 & حاد ؛ -GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3 & حاد ؛المرجع 7
التمهيدي للتسلسل العكسي GD3 synthase5 & حاد ؛ -CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3 &المرجع 7
التمهيدي بالتسلسل الأمامي GM2 / GD2 سينسيز5 & حاد ؛ -CAACACAGCAGACACAGTCC-3 &المرجع 7
التمهيدي للتسلسل العكسي GM2 / GD2 سينسيز5 & حاد ؛ -GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3 &المرجع 7
المضاد Hoechst 333258 Sigma-Aldrich 861405 

المراجع

  1. Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
  2. Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
  3. Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498(2013).
  4. Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
  5. Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
  6. Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
  7. Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
  8. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  9. O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
  10. Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
  11. Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
  12. Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
  13. Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
  14. Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
  15. Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
  16. Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
  17. Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
  18. Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تعبير الغانغليوزيداتالمجهر البؤريالتصاق الخلاياجسم مضاد لـ CD3جسم مضاد لـ CD28غانغليوزيد GD3قياس التدفق الخلويتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي
إعداد CD4
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.