مقالة منهجية

في المختبر تسجيل من مساريقي وارد آخر الأعصاب في ماوس صائمية وقطاعات القولون

11.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54576

⸱

أكتوبر 25, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of Antwerp, 2Visceral Pain Group, Discipline of Medicine, University of Adelaide, 3Department of Biomedical Sciences, University of Sheffield, 4Department of Pharmacy, Pharmacology and Postgraduate Medicine, University of Hertfordshire, 5Department of Gastroenterology and Hepatology, Antwerp University Hospital

في هذه المقالة

ملخص

تنقل الأعصاب الواردة المساريقية المعلومات من الجهاز الهضمي نحو الدماغ فيما يتعلق بالتوازن الطبيعي وكذلك الفيزيولوجيا المرضية. يمكن تقييم نشاط العصب الوارد المعدي المعوي عن طريق تركيب أجزاء معوية معزولة مع أعصاب واردة متصلة في حمام الأعضاء ، وعزل العصب ، وتقييم النشاط القاعدي وكذلك المحفز.

الملخص

الأعصاب وارد ليس فقط نقل المعلومات المتعلقة علم وظائف الأعضاء طبيعي، ولكن أيضا إشارة توازن مختل والعمليات الفيزيولوجية المرضية لأجهزة الجسم المختلفة من المحيط نحو الجهاز العصبي المركزي. على هذا النحو، وقد تم تخصيص زيادة النشاط أو "توعية" من الأعصاب وارد المساريقي دورا هاما في الفيزيولوجيا المرضية من فرط الحساسية الحشوية ومتلازمات الألم في البطن.

يمكن قياس النشاط عصب وارد المساريقي في المختبر في شريحة المعوية المعزولة التي شنت في حمام الجهاز بنيت لهذا الغرض والتي يتم عزل العصب الحشوي، مما يسمح للباحثين لتقييم مباشرة نشاط العصب المجاور إلى الجزء الهضمي. آخر يمكن تسجيلها في الأساس في ظروف موحدة، أثناء انتفاخ الجزء أو بعد إضافة المركبات الدوائية تسليمها intraluminally أو serosally. تسمح هذه التقنيةالباحث إلى دراسة بسهولة تأثير المخدرات التي تستهدف النظام العصبي الطرفي في عينات السيطرة؛ الى جانب ذلك، فإنه يوفر معلومات مهمة حول كيفية نشاط الخلايا العصبية يتم تبديل أثناء المرض. وتجدر الإشارة إلى أنه مع ذلك أن قياس النشاط اطلاق العصبية وارد يشكل سوى محطة ترحيل واحدة في الخلايا العصبية المعقدة يشير التعاقبي، ويجب على الباحثين أن يضعوا في الاعتبار عدم إغفال نشاط الخلايا العصبية في المستويات الأخرى (على سبيل المثال، العقد الجذرية الظهرية، والحبل الشوكي أو الجهاز العصبي المركزي ) من أجل التوضيح التام لعلم وظائف الأعضاء العصبية المعقدة في الصحة والمرض.

وتشمل التطبيقات المستخدمة عادة لدراسة نشاط الخلايا العصبية في استجابة لإدارة lipopolysaccharide في، ودراسة النشاط عصب وارد في نماذج حيوانية من متلازمة القولون العصبي. في اتباع نهج أكثر متعدية، والجزء المعوية الماوس معزولة يمكن أن يتعرض لsupernatants القولون من مرضى القولون العصبي. وعلاوة على ذلك، تعديلهذه التقنية وقد تبين مؤخرا أن تكون قابلة للتطبيق في عينات القولون الإنسان.

المقدمة

الإشارات الحسية والإحساس بالألم هي عملية معقدة الذي ينتج عن تفاعل معقد بين الأعصاب وارد، الخلايا العصبية في العمود الفقري، وتصاعدي تنازلي مسارات تيسيري والمثبطة وعدة مناطق الدماغ المختلفة. على هذا النحو، والتغيرات في واحدة أو أكثر من هذه المستويات قد يؤدي إلى الإشارات الحسية المتغيرة والألم الحشوية في الحالات المرضية. لدراسة كل هذه الجوانب المختلفة من الإشارات الحسية تقنيات متعددة تم تطويرها بدءا من التجارب خلية واحدة (على سبيل المثال، والتصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية) على النماذج الحيوانية كلها (على سبيل المثال، والاستجابات السلوكية مثل استجابة الحشوي الحركي). تقنية الموضحة في هذه الورقة تسمح للباحثين لتقييم تحديدا النشاط عصب وارد في المختبر من الجزء المعزول من الأمعاء الدقيقة أو القولون في القوارض. باختصار، هي التي شنت على قطاع الهضمي معزولة (عادة الصائم أو القولون) في غرفة تسجيل بنيت لهذا الغرض مع perfused لK الفسيولوجيةحل rebs. يتم تشريح العصب الحشوي الحر وتوصيلها إلى القطب يسمح بتسجيل نشاط الخلايا العصبية وارد في الأعصاب وارد حشوي أو الحوض. النشاط العصبي ويمكن أن تسجل باسالي أو استجابة لتزايد الضغوط داخل اللمعة و / أو المركبات الدوائية التي يمكن تطبيقها إما مباشرة إلى غرفة تسجيل (serosally)، أو عن طريق الإرواء داخل اللمعة (mucosally) لتقييم تأثيرها على أداء وارد 1-6 . من المذكرة، تحتوي على الأعصاب الحشوية أيضا ألياف صادرة وafferents viscerofugal بالإضافة إلى afferents الحسية. واحدة من المزايا الرئيسية لتسجيل العصب الحشوي خارج الجسم الحي هو حقيقة أن الباحثين يمكن تحديد حجم نشاط العصب دون تعديل أو إدخال من الجهاز العصبي المركزي، مما يسمح احد لدراسة التأثير المباشر لمركبات تطبيقها محليا على النشاط العصبي. وعلاوة على ذلك، رصد العوامل الحيوية، كما هو ضروري باستخدام هذا النهج في الجسم الحي (انظر أدناه)، غير نس تعد ذات صلة. في المختبر تسجيل حشوي هو في النهاية أقل بكثير من نظيرتها في الجسم الحي تستغرق وقتا طويلا.

نشاط الخلايا العصبية وارد في استجابة للمؤثرات أخرى، مثل التمسيد المخاطية، التحقيق باستخدام الشعر فون فراي أو تمتد من الجزء، ويمكن دراستها في الإعداد التجريبية المعدلة التي يتم يعلق الأنسجة المعوية أسفل وفتح طوليا (والذي هو على النقيض من الإعداد لدينا باستخدام شريحة سليمة)، كما وصفت في قضية سابقة 7،8. وبالإضافة إلى ذلك، إلا في الآونة الأخيرة، وقد وصفت تقنية لدراسة تفعيل وارد عصب القولون في جدار القولون نفسه عن طريق التصوير الكالسيوم، مرة أخرى باستخدام تمركزها، فتحت طوليا شريحة 9.

نسخة بديلة من هذه التقنية في الجسم الحي يتكون من قياس تنشيط الخلايا العصبية قرب دخول وارد في في الحبل الشوكي. باختصار، يتم وضع الحيوان تحت التخدير في وضعية الانبطاح، هxposing الحبل الشوكي القطنية العجزية التي العصب وارد من المشاريع الفائدة عن طريق الثقب، بناء جيدا باستخدام الجلد من شق واللف جذير ظهري فوق القطب البلاتين القطبين 10،11 مليئة البارافين. هذه التقنية علاوة على ذلك يسمح للباحثين لتوصيف الألياف على أساس سرعة التوصيل، ووتميز كمون الفعل C-الألياف من العصبي رقيقة Aδ ألياف. وعلاوة على ذلك، rootlets الظهري يحتوي حصرا الألياف وارد الحسية، وعلى النقيض من وارد وصادر الأعصاب الحشوية المختلطة التي سبق ذكرها.

تسجيل التفريغ عصب وارد في المختبر من قطاعات الأمعاء المعزولة يمكن أيضا أن يتم ذلك باستخدام العينات البشرية، واثنين من المجموعات البحثية التي نشرت بشكل مستقل المخطوطات الأولى في رجل وتسجيل النشاط عصب وارد القولون في استئصال البشري العينات 12،13. تنفيذ هذه التقنية يمكن أن يؤدي إلى أكثر بسهولة translatiعلى البيانات الفئران للدولة إنسانية، ويمكن أن تسمح للباحثين لتحديد الأدوية التي تستهدف العصب الحسي توعية بسهولة. أهمية سريرية من تميز نشاط ارد العصبية، فضلا عن اكتشاف الكواشف العلاجية الجديدة التي تستهدف النشاط عصب وارد باهظة، وقد نوقشت بشكل متقن من قبل العديد من الخبراء في هذا المجال 14-19.

في المختبر التقنية المذكورة آنفا تكمل المعروفة أكثر في قياس الجسم الحي من النشاط وارد العصبية. خلال المجراة قياس نشاط الخلايا العصبية، والنشاط العصبي ويمكن أن تقاس مباشرة في الحيوان مخدرا خلالها يتم التعرف على جزء من الفائدة وتنبيب في وقت لاحق، وبناء على البارافين مليئة السائل جيدا باستخدام جدار البطن والجلد من القوارض 20. ثم يتم التعرف على الأعصاب وارد من الفائدة، مقطوع ووضعها على قطب البلاتين القطبين، مما يسمح measuremen نشاط الخلايا العصبيةت. هذا الأسلوب يسمح للباحث لتعديل النشاط عصب وارد في العيش ولو الحيوانات مخدرا. على هذا النحو، يمكن للمرء أن دراسة نشاط الخلايا العصبية الاستجابة لتدخلات مثل انتفاخ اللمعية أو في الوريد إدارة مجمع.

يركز الأبحاث المترجمة في الوقت الحاضر أساسا على تطبيق supernatants المستمدة الإنسان (على سبيل المثال، من الخزعات القولون، المزروعة الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى، الخ) على afferents الماوس صائمية و / أو القولون 21،22. يمكن للباحثين تنطبق مباشرة supernatants إما في حمام الجهاز أو في حل داخل اللمعة التي perfuses قطاع الأمعاء، بحيث الآثار التفاضلية للالمصلي مقابل تطبيق المخاطية يمكن دراستها على تفريغ عصب وارد. على هذا النحو، فقد تبين أن supernatans خزعة مخاطية القولون من المرضى الذين يعانون من متلازمة القولون العصبي يمكن أن تسبب فرط الحساسية في afferents القولون الماوس، خنزير غينيا الخلايا العصبية تحت المخاطية وجذور الماوس الظهريةالخلايا العصبية العقدية 21،23،24.

وأخيرا، وتسجيل نشاط الخلايا العصبية لا يقتصر على المساريقي و / أو الخلايا العصبية الحوض التعصيب الجهاز الهضمي. وقد أظهرت آخرون أن التسجيلات العصبية يمكن أن يؤديها في afferents تزويد مفصل الركبة 25، في حين أن البعض الآخر تتميز المثانة النشاط وارد العصبية فضلا 26-28، وتدلل على أن afferents الحوض من المثانة وكذلك الجهاز الهضمي تتلاقى، وربما أدى إلى العصبية الحديث المتبادل 29.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات هو موضح أدناه لجنة أخلاقيات الطبية واستخدام حيوانات التجارب في جامعة أنتويرب (ملف رقم 2012-42).

1. الأنسجة إعداد صائمية والقولون وارد الأعصاب

  1. إعداد عصب وارد صائمية
    1. أداء القتل الرحيم القوارض القوارض المراهقين أو البالغين التي تمت الموافقة عليها قبل التجربة من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية (على سبيل المثال، التخدير الطرفي تليها ثقب في القلب، خلع عنق الرحم، وما إلى ذلك).
      ملاحظة: استخدمنا خلع عنق الرحم للتضحية الحيوانات مما أدى إلى التجارب دون الحاجة لمزيد من التخدير والرعاية بعد الجراحة حيث يتم معالجة المزيد من الأنسجة في المختبر.
      وقد تبين أن العمر لتخفيف وارد المساريقي وظائف ميكانيكية حسية 30، وبالتالي فإننا ينصح الباحثون إلى الانضمام إلى الفئة العمرية المحددة لمدة ملاحظة:تجربة واحدة.
    2. وضع الحيوان مختبر ضحوا في موقف ضعيف وإجراء شق خط الوسط في البطن من خلال طبقة الجلد وعضلات البطن باستخدام مشرط، وتمتد من عملية سيفي الشكل حتى عظم العانة.
    3. يستحم تجويف البطن بمحلول كريبس البارد من أجل منع الأنسجة داخل البطن من الجفاف (كريبس التكوين: 120.03 ملي كلوريد الصوديوم، 6.22 ملي بوكل، 1.57 ملي ناه 2 ص 4، 15.43 ملم NaHCO 3، 1.21 ملي MgSO 4، 11.52 ملي مد الجلوكوز و1.52 ملي CaCl 2).
    4. بسرعة استئصال الصائم بأكمله باستخدام مقص حاد من قبل استئصال ما يقرب من 20 سم من الأمعاء الدقيقة تبدأ على الفور بشكل أقصى من الثنية الإثناعشرية الصائمية، مع الحرص على عدم الإضرار الهياكل المحيطة والحفاظ مساريق الأمعاء، والتي تحتوي على الأوعية الدموية صائمية والأعصاب وارد، سليمة.
      ملاحظة: للحصول على تشريح صائمية مجرد في تجويف البطن، واحد لا تحتاج إلى استخداملمجهر تشريحي، وهذا يمكن تصور بسهولة بالعين المجردة.
    5. وضع الصائم رفعه في حل كريبس المثلج والحفاظ على الجليد، في حين بالاكسجين الحل كريبس مستمر مع كربوجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2).
    6. قطع الصائم مع مقص حاد في حلقات طويلة حوالي 3 سم. مراقبة حزمة المساريقي الذي يحتوي على السفن والعصب الحشوي في مكان ما بالقرب من وسط حلقة منها.
    7. طرد كل قطعة مع حل كريبس باستخدام القسطرة حادة لإزالة محتويات اللمعية والكيموس لأن هذه تحتوي على الأنزيمات الهاضمة التي من شأنها تسريع تدهور عينة الأنسجة في المختبر.
      ملاحظة: احرص على عدم الإضرار التجويف من الحلقة أثناء التنظيف، وتدمير الزغب سيؤدي إلى الإفراج عن وسطاء التي يمكن أن تغير النشاط وارد العصبية.
    8. تحديد شريحة لقياس النشاط العصبي وارد (على سبيل المثال، أول segme صائميةالإقليم الشمالي بشكل أقصى للرباط ترايتس أو الثنية الإثناعشرية الصائمية)، ومكان هذا في غرفة تسجيل بنيت لهذا الغرض المغلفة بطبقة سيليكون المطاط الصناعي.
      ملاحظة: بداية الصائم يعرف تشريحيا كجزء من الأمعاء الدقيقة حيث الرباط ترايتس يعبر الأمعاء الدقيقة، كما دعا الثنية الإثناعشرية الصائمية.
      ملاحظة: تغطية الجزء السفلي من غرفة تسجيل مع طبقة السيليكون المطاط الصناعي رقيقة في وقت مبكر قبل بدء التجربة. يجب أن يتم تنفيذ إعداد هذه الطبقة المطاط الصناعي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 1.
    9. يروي الغرفة باستمرار مع دافئة، carbogenated حل كريبس بمعدل 10 مل / دقيقة والحفاظ على درجة حرارة كريبس "في ثابت غرفة تسجيل في 34 درجة مئوية.
    10. تركيب شريحة صائمية في الحمام الجهاز بحيث يتم توصيل الطرف عن طريق الفم للسائق حقنة توفير تدفق اللمعية ومجافي الفم نهاية يتصل تدفق. قليلا الواحدتقيأ هذا الجزء ولكن الحرص على عدم ممارسة التوتر المفرط. نعلق طرفي باستخدام بحزم 4/0 اربطة الحرير إلى الموانئ التحتية وتدفق.
    11. إرفاق سائق المحقنة إلى نهاية عن طريق الفم، ويروي هذا الجزء صائمية intraluminally مع حل كريبس (غير المؤكسج، درجة الحرارة المحيطة) بمعدل 10 مل / ساعة.
    12. دبوس مساريق الشقة جزء المعوية التي شنت ضد الطبقة السفلية سيليكون المطاط الصناعي، وذلك باستخدام دبابيس الحشرات. تمتد مساريق خارج من أجل تحسين التصور من حزمة المساريقي. لا تمارس ضغطا على حزمة أو الصائم.
    13. إجراء اختبار انتفاخ منحدر (راجع أدناه) عن طريق إغلاق منفذ إخراج حتى الضغط داخل اللمعة الجزء الأمعاء يصل 60 مم زئبق، وذلك للتحقق من أنه لا يوجد حل كريبس داخل اللمعة تتسرب من شريحة مثبتة. نلاحظ ارتفاعا على نحو سلس في الضغط داخل اللمعة دون انقطاع.
    14. مراقبة تقلصات صغيرة من شريحة (الرعايا تحويوفاق) خلال مرحلة انتفاخ الأولية. إذا لزم الأمر، منع النشاط تحوي بإضافة 1 ميكرومتر من L-نوع محصرات قنوات الكالسيوم نيفيديبين إلى حل كريبس.
      ملاحظة: إضافة 1 ميكرومتر من الأتروبين إلى حل كريبس بالإضافة إلى نيفيديبين، سوف يشل تماما هذا الجزء الأمعاء. ولكن ليس لدينا أي تجربة شخصية مع استخدام وتأثير الأتروبين على تسجيل عصب وارد.
    15. تحت مجهر تشريحي، تبدأ برفق لتقشر الأنسجة الدهنية من مساريق التي تشيد برفق مع اثنين من ملاقط صغيرة، مع الحرص على عدم تلف الأوعية والأعصاب وارد أن مدفونة في الأنسجة الدهنية.
    16. تبدأ على مسافة بعيدة من الصائم، وفضح كل من الأوعية الدموية في حزمة المساريقي.
    17. مراقبة العصب صائمية وارد بين كل من السفن باعتباره رقيقة، الخيط الأبيض مغلفة في الأنسجة الدهنية. تشريح فقط أكثر قريب نحو الصائم عن طريق تقشير بلطف الأنسجة الدهنية بعيدا باستخدام الملقط عندماتحديد أولي لكلا السفن المساريقي و / أو العصب وارد أمر صعب.
    18. تشريح العصب المساريقي صائمية الجزء الحرة لمسافة عدة مليمترات، عن طريق إزالة تمسكا الأنسجة الدهنية في العصب.
    19. القطع العصب باستخدام مقص الأنسجة حادة. إذا لزم الأمر، تقشر الأنسجة الدهنية والضام المتبقية، فضلا عن غمد epineuronal التي تشيد برفق مع ملاقط صغيرة.
    20. باستخدام micromanipulator، وانخفاض غيض من القطب الشفط، متصلة حقنة مع الغطاس، في حمام الجهاز. ثم، من خلال التلاعب الغواص، نضح بلطف بعض الحلول كريبس من حمام الجهاز بحيث يتم غمر غيض من القطب في حل كريبس (الشكل 1). ضمان أن الحل كريبس يغطي سلك كهربائي داخل القطب الشفط.
      ملاحظة: إعداد شفط الشعرية البورسليكات الزجاج الذي يحتوي على سلك كهربائي قبل بدء التجربة لناجي مجتذب ماصة.
    21. ضع غيض من القطب شفط مباشرة بجوار حبلا عصب وارد مقطوع ولفت حبلا عصب مقطوع في شعري على طوله بأكمله.
    22. مناورة غيض من القطب تجاه بعض الأنسجة الدهنية، ونضح هذا في الزجاج الشعرية بينما الشفط بحزم مع الغطاس، وبالتالي ميكانيكيا "الختم" العصب في شعري من محتويات الحمام الجهاز.
    23. التحقق من تسجيل النشاط العصبي وارد استخدام نظام الحصول على البيانات، على سبيل المثال، عن طريق إجراء الناجم عن الزيادة انتفاخ منحدر في وارد إطلاق النار (الأشعة تحت بنصيحة). بعد عزل العصب في القطب الشفط، وتحقيق الاستقرار في إعداد لمدة 15 دقيقة من أجل الحصول على النشاط العصبي وارد عفوية حالة مستقرة قبل إجراء التجارب الفعلية.
    24. لأداء منحدر انتفاخ، انتفخ قطاع الأمعاء عن طريق إغلاق منفذ إخراج، مما يؤدي إلى غرادارتفاع السياقية في الضغط في القطاع الأمعاء (ما يصل إلى 60 مم زئبق). فقط تنفيذ بروتوكول تجريبي المطلوبة عند ثلاثة الإنتفاخات منحدر متتالية (مع فاصل زمني 15 دقيقة) تسفر عن التفريغ وحدة متعددة استنساخه (الشكل 2).
  2. إعداد وارد قطني حشوي (عصب وارد القولون)
    ملاحظة: تشريح الأعصاب وارد القولون يتطلب تشريح أكثر تفصيلا. وترد الانحرافات عن بروتوكول "صائمية" السابق أدناه:
    1. الموت ببطء الحيوان عن طريق وسيلة إنسانية، وضعه في موقف ضعيف، تنفيذ البطن خط الوسط وبشكل مفرط من أجل حل كريبس المثلج في تجويف البطن. ملاحظة: كريبس التكوين: 118 مم كلوريد الصوديوم، 4.75 ملي بوكل، 1 ملم ناه 2 ص 4، 22 NaHCO 3، 1.2 ملي MgSO 4 و 11 ملي مد الجلوكوز و 2.5 ملي CaCl 2، 3 ميكرومتر الاندوميتاسين.
      ملاحظة: ملاحظة تكوين غيرت من الحل كريبس. يضاف الاندوميتاسين إلى ذلكlution من أجل منع التعديلات النشاط عصب وارد من قبل البروستاجلاندين.
    2. تجاهل الأنسجة الدهنية والمثانة والأعضاء التناسلية الداخلية، وتحويل بلطف الأمعاء الدقيقة إلى جانب واحد في تجويف البطن. إجراء prelevation طويلة من الجزء الأعلى من القولون مع الأعصاب المساريقي سليمة من البطن.
      ملاحظة: المعالم الهامة التي يمكن إدراجها في هذا التشريح لمساعدة المزيد من إعداد الأنسجة تشمل الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف، والكلية اليسرى وعضلات قاع الحوض.
      ملاحظة: أثناء التشريح، والحرص على عدم ممارسة الجر على النسيج الذي يربط بين القولون والشريان الأورطي البطني، كما تحتوي هذه المنطقة القطنية الأعصاب الحشوية.
    3. نقل قطاع النسيج في المطاط الصناعي سيليكون اصطف غرفة تسجيل. استخدام الشريان الكلوي الأيسر، الذي ينبع من الشريان الأورطي البطني، كنقطة انطلاق. اتبع الشريان الأورطي البطني في الاتجاه مجافي الفم، تواجه mesenteri متفوقةج الشريان جنبا إلى جنب مع الاضطرابات الهضمية ومتفوقة العقدة المساريقي. وأخيرا، وتصل في النسيج الذي يربط بين الجزء الأعلى من القولون والشريان الأورطي، حيث يقع العصب من الفائدة.
    4. تحديد الشريان المساريقي السفلي القادمة من الشريان الأورطي البطني. ويمكن تحديد العصب القطني حشوي وارد في قاعدة الشريان المساريقي السفلي. تشغيله مواز للشريان (الشكل 3).
    5. بعد transection العصب، تقشر بلطف المحيطة غمد النسيج الضام وندف العصب إلى عدة المواضيع الجميلة. تأكد من أن تبقي على مسافة آمنة من القولون.
    6. رسم واحد من هذه المواضيع واحدة في شفط الكهربائي، "ختم" الشعرية مع توضيح الأنسجة الدهنية كما هو موضح سابقا وتنفيذ بروتوكول تجريبي المطلوب.
    7. تجاهل أي نوع من الأنسجة الزائدة التي موجود في الحمام الجهاز (على سبيل المثال، الكلى والأوعية البطن، الأنسجة العضلية)، لق هذه قد تعكر صفو إشارة وارد.
      ملاحظة: نيفيديبين (1μM) يمكن أن تضاف إلى الحل كريبس في حالة اضطراب الإشارة العصبية وارد من قبل حركة الأمعاء العفوية بسبب انكماش خلايا العضلات الملساء.
      ويمكن وصف الأدوية في ثلاثة مواقع مختلفة: ملاحظة: 1) serosally عن طريق إذابة المجمع المطلوب في كريبس أن perfuses غرفة تسجيل، 2) مباشرة في حمام الجهاز في حين وقف نضح مؤقتا أو 3) intraluminally عن طريق إذابة مجمع الفائدة في حل كريبس في محرك حقنة. يمكن أن تحدث الحساسية للعصب وارد عندما تدار الجرعات التراكمية من مركب سريع جدا على التوالي.

figure-protocol-1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطي المدمج الغرض غرفة تسجيل والكهربائي شفط نظرة عامة مفصلة من TECHNI. الإعداد كال مع القطب شفط وغرفة تسجيل في المكان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-2
الشكل 2: بحث عن المفقودين ممثل تسجيل في المختبر من صائمية وارد آخر العصب تسجيل نموذجي وحدة متعددة النشاط وارد العصبية صائمية (imp.sec -1) (اللوحة العليا) في الأساس، واستجابة ل2 الإنتفاخات المنحدر حتى 60 مم زئبق. (اللوحة السفلى)، وتحديد لاحق (تحليل شركة WaveMark) من مختلف وحدات واحدة في إشارة العصبية (الجلسة الثالثة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-3"الشكل 3" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54576 / 54576fig3.jpg" />
ونقلت التشريح العصبي للقولون أ) المعلومات الحسية من القولون عبر الأعصاب القولون القطنية (LCN) تجاه النظام العصبي المركزي، مع LCN تشغيل على مقربة من الشريان المساريقي السفلي (IMA): الشكل (3). وهناك جزء من الألياف من هذه العصبية القولون القطني بالطبع على طول العصب المساريقية (شبكة الإعلام العراقي) لتشكيل الأعصاب الحشوية القطنية (LSN). يقع العقدة المساريقي السفلي (IMG) في أصل IMA من الشريان الأورطي البطني. تسجيل بشكل أقصى للIMG إلزامي يجب يرغب الباحثون لدراسة النشاط وارد العصبية viscerofugal. ب) لمحة تخطيطية للانشاء التجريبية. يتم تنفيذ تسجيل وارد من LCN في الجهاز سواء عن طريق القطب شفط متصلا نظام الحصول على البيانات. منحدر انتفاخ لا يمكن أن يؤديها على إغلاق الميناء منفذا في الوقت الذي تواصل تدفقكريبس حل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الحصول على البيانات

  1. تسجيل النشاط العصبي عن طريق القطب شفط متصلة headstage. تضخيم (كسب 10K) وتصفية إشارة (ممر الموجة 500 - 5000 هرتز) 20.
    ملاحظة: يجب تضمين 50/60 هرتز الضوضاء المزيل في الإعداد التجريبية من أجل إزالة 50/60 هرتز التدخل الكهربائية إشارات الضجيج. والإشارة الرقمية تلقائيا وأخذ عينات في 20 كيلوهرتز لتحليلها.

3. تحليل 5،20

  1. عن أداء وارد العصبية كما أن العدد الإجمالي للنبضات / ثانية لالعصب بأكمله أو استخدام البرمجيات المتخصصة لإجراء مزيد من التحليل، والتسجيلات وحدة متعددة من النشاط العصبي عموما تحتوي على إمكانات العمل في شكل مختلف، والسعة والعرض، الموافق العصبية مختلفة الوحداتفي كل الألياف وارد (الشكل 2).
  2. تطابق wavemarks فرد إلى قوالب معدة مسبقا، مما يسمح بالتمييز بين وحدات واحدة. قبل تخصيص ارتفاع لبعض موجة علامة، نسبة الإشارة إلى الضوضاء> 2: 1 يجب أن تفرض.
    ملاحظة: خلال تحليل شركة WaveMark، ونحن بناء قالب جديد عندما يتم تحديد لا يقل عن 10 طفرات مماثلة من قبل برامج التحليل. يتم إنشاء أي قالب لأشكال نادرة من 1 في 50 المسامير. لا يوازيه اي ارتفاع في قالب باستخدام تحليل العنصر الرئيسي عندما لا يقل عن 80٪ من النقاط متطابقة مع ارتفاع القالب. مطابقة قالب يعتمد مشغل، وينبغي أن يكون دائما القيام بها من قبل الباحث نفسه بطريقة أعمى.
  3. حساب العمل الردود المحتملة من خلال طرح النشاط العفوي في الأساس (الضغط داخل اللمعة من 0 مم زئبقي) من خلال استجابة انتفاخ في نقطة زمنية محددة (5 مم زئبق من زيادة 0-20 مم زئبق ضغط داخل اللمعة، بزيادة نسبتها 10مم زئبق من 20 مم زئبق فصاعدا). قياس التصريف وارد الأساسي باستخدام حجم بن ل10 ثانية.
  4. استخدام التحليل وحدة واحدة لتصنيف الألياف على أساس سمات التفريغ أثناء انتفاخ المنحدر (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تحليل وحدة واحدة لدراسة الملف الشخصى حساس للكيماويات من أنواع مختلفة من وحدات، وليس كل أنواع الوحدات سيتم عرض نفس النشاط اطلاق تغير في الاستجابة للدواء أو مركب.
  5. تصنيف الألياف كما ألياف منخفضة عتبة ( "LT"، وعادة ما سيمارس زيادة الإفرازات في الضغوط انتفاخ أقل)، ألياف عالية عتبة ( 'حزب التحرير'، وتظهر زيادة في الإفرازات على أعلى الضغوط انتفاخ)، والألياف واسعة النطاق الديناميكي ( 'تقرير التنمية في العالم "، وإظهار زيادة اطلاق النار خلال انتفاخ منحدر بأكمله) أو وارد حساسة ميكانيكيا ( 'MIA "، والألياف العصبية التي عادة لا تستجيب للمنحدر الإنتفاخات) 5؛ 20.
  6. تعلن الرد اطلاق العصبية في 20 مم زئبق كما عercentage للاستجابة اطلاق القصوى خلال انتفاخ (LT٪) لأنه يعبر عن مدى باطلاق النار على انخفاض ضغط انتفاخ.
    ملاحظة: لذلك، تتميز ألياف LT قبل LT٪> 55٪، في حين HT يتم تحديدها من خلال قيمة من <15٪. قيم الوحدات WDR تتراوح بين 15 و 55٪ (20). يعرض MIA اطلاق ارد العفوي الذي لا يتأثر الإنتفاخات.

figure-protocol-4
تصنف التمثيل التخطيطي من وحدات وارد الألياف المختلفة بناء على Mechanosensitive ملفهم الشخصي وحدات على أساس النسبة المئوية (LT٪) من معدل نيرانهم على 20 مم زئبق ضغط انتفاخ مقارنة استجابة اطلاق القصوى خلال انتفاخ: الرقم 4. ألياف منخفضة عتبة (لوحة اليسرى العليا) عرض في الغالب على نشاط العصب زيادة في الضغوط انتفاخ منخفضة، مما أدى إلى LT و٪ من أكثر من 55٪. وحدات عتبة عالية (أعلى اليمينلوحة) على العكس من ذلك عرض فقط زيادة في اطلاق المعدل الضغوط الضارة (٪ LT <15). واسعة النطاق الديناميكي الألياف (اللوحة السفلى اليسرى) عرض زيادة تدريجية في النشاط العصبي خلال انتفاخ بأكمله (٪ LT تتراوح بين 15 و 55)، في حين أن الألياف غير حساسة ميكانيكيا (اللوحة السفلى اليمنى) لا تستجيب لزيادة الضغوط انتفاخ. LT٪: (وارد يطلقون النار على 20 مم زئبقي / القصوى اطلاق النار وارد) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد تم قياس النشاط عصب وارد صائمية في الأساس وردا على منحدر انتفاخ في 9 الذكور لمدة ثمانية أسابيع من العمر OF-1 الفئران. وتم إيواء الحيوانات في مجموعات في ظروف موحدة (6 الحيوانات في قفص، 20-22 درجة مئوية والرطوبة 40 - 50٪، 12 ساعة دورة ضوء الظلام) مع وصول غير محدود للاستفادة من المياه وطعام منتظمة. عرض شرائح صائمية من الفئران التفريغ وارد عفوية غير النظامية العصبية في الأساس عند ضغط داخل اللمعة من 0 مم زئبق (يعني النشاط العفوي 11.47 ± 3.31 عفريت / ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول في هذه الورقة يصف تقنية المختبرات استنساخه لدراسة النشاط العصبي وارد المساريقي في القوارض كما يستخدمه مجموعتنا وغيرها 3،4،7،8،12،20،21،31. وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول العزلة السريع للأنسجة، تطلع حبلا العصب في القطب الشفط و "الختم" كاف من الزجاج الشعرية من حمام الجهاز بواسطة الشفط المحيطة الأنسجة الدهنية في شعري. الفتحة من الزجاج الشعرية ينبغي أن تحدد بالضبط: سوف فتحة صغيرة جدا تعقيد تطلع حبلا العصبية في القطب، في حين أن فتحة واسعة جدا وسوف تعيق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

أجرت

SN التجارب الموضحة أعلاه ، وأجرت تحليل البيانات وصاغت المخطوطة. نفذت AD و JDM هذه التقنية في مرافقنا البحثية وساعدتا في تحليل البيانات. ساعد HC في إجراء التجارب. ساعد WJ و CK و DG في تنفيذ تقنية القياس الواردة في مختبرنا ، وتحليل البيانات وتفسير النتائج. صممت SF و JDM و BDW الدراسة. قرأ جميع المؤلفين المخطوطة النهائية ووافقوا عليها بشكل نقدي. SN هو أحد المرشحين لصندوق البحث العلمي (FWO) ، فلاندرز (11G7415N). وحظي هذا العمل بدعم مالي من منظمة FWO (G028615N و G034113N).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)VWR للكيماويات27،810،295مركب كريبس محلول
كلوريد البوتاسيوم (KCl)أكروس العضوي196770010مركب محلول كريبس
فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم (NaH2< / sub>PO4< / sub>) VWRChemicals1،063،461،000مركب محلول كريبس
بيكربونات الصوديوم (NaHCO3)ميرك1،063،291،000مركب محلول كريبس
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4< / sub>)ميرك1،058،861،000مركب محلول كريبس
كلوريد الكالسيوم (CaCl2< / sub>)Merck23،811،000مركب محلول كريبس
D-glucoseVWR Chemicals1011175Pمركب محلول
كريبسمحلول كريبس
أنابيب PVCمستلزماتالعلمية يجب تركيب الجزء المعوي فوق أنابيب PVC
أنابيب سيليكونمستلزماتالعلمية بقية الأنابيب ، من الناحية المثالية القائمة على السيليكون - إزاحة الحطام بسهولة أكبر في
الأنبوب خيط الحريرPearsall Limited10B15S220إرفاق الجزء فوق محرك حقنة الأنابيب البلاستيكية
هارفارد55-2222التسريب داخل اللمعة لمنظار كريبس
- بما في ذلك تكبير 10X في العينZeiss STEMI 2000التصور الأمثل لتشريح العصب الوارد
وحدة التحكم في بطانية الحرارةهارفارد507214تسخين غرفة
الأعضاءحمام عضو مخصص مع Sylgard مغطى أسفل
برنامجتسجيل وتحليل البيانات
دبابيس الحشرات ، 500 قطعة ، الفولاذ المقاوم للصدأ ، قطر 0.2 ممدبابيس الحشرات Austerlitz minutiens تشريحالعصب الوارد
الملقط Dumont # 5 inox 11 سمأداة الدقة العالمية500341تشريح العصب
الواردمقص ، زنبرك ، 14 سمأداة الدقة العالمية15905تشريح العصب الوارد
DB digitimer   ؛NL 108T2 / 10محول الضغط
MicromanipulatorNarishigeM-3333التلاعب ثلاثي الأبعاد لقطب الشفط
MicromanipulatorX-4 كتلةالتلاعب ثلاثي الأبعاد لقطب الشفط
MicromanipulatorGJ-8 حامل3D التلاعب بقطب
الشفط LightSourceEuromex مجاهر هولندا EK-1التصور الأمثل لتشريح العصب الوارد
CED 1401 جهازتسجيل نشاط العصب الوارد
Humbug 50/60 هرتز مزيل الضوضاءQuest الأدواتالقضاء على ضوضاء الخلفية
مضخة التسريبGibson Minipuls 2ضخ حجرة العضو التي يتم تركيب
الجزء فيهاحامل القطب الكهربائي الدقيق نصف الخلايا 1.5 ممأداة الدقة العالميةMEH2SWقطب شفط لعزل
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات المصنوعة من الألياف الواردة ، 300 قطعة ؛ 1.5 / 0.84 OD / IDWorld Precision Instrument1B150-4الشعيرات الدموية لعزل العصب الوارد
مركب الماء المقطر المختبرات المختبرات جهاز المنزلية جهاز Spike2 دوارة مغناطيسي التسجيل العلمية

المراجع

  1. Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
  2. Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
  3. Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
  4. Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
  5. Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
  6. Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22(2015).
  7. Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  8. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310(2015).
  9. Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179(2013).
  10. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
  11. Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
  12. Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
  13. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
  14. Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
  15. Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
  16. De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
  17. Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
  18. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
  19. Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
  20. Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
  21. Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
  22. Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
  23. Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
  24. Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
  25. Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
  26. Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
  27. Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
  28. Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
  29. Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
  30. Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
  31. Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة