مقالة منهجية

عزل، التمايز، والكمي للالإنسان الأجسام المضادة إفراز خلايا B من الدم: ELISPOT باعتبارها قراءات الوظيفية للالخلطية الحصانة

DOI:

10.3791/54582

⸱

ديسمبر 14, 2016

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم الدم المحيطي البشري بشكل شائع لتقييم الاستجابة المناعية الخلطية. هنا ، يتم وصف طرق عزل الخلايا البائية البشرية عن الدم المحيطي ، وتفريق الخلايا البائية البشرية إلى خلايا بائية تفرز الجسم المضاد (Ab) (ASCs) في الثقافة ، وتعداد إجمالي IgM- و IgG-ASCs عبر مقايسة ELISpot.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السمة المميزة للمناعة الخلطية هي لتوليد مخولا لصيانة طائرات وظيفية، التي تجميع وتفرز عبس محددة لمولدات المضادات (حج)، مثل مسببات المرض، وتستخدم للدفاع المضيف. لتحديد الكمي للوضع وظيفي للاستجابة المناعية الخلطية للفرد، يتم قياس كل من القيمة المطلقة المصل ومخولا لصيانة طائرات تعميم عادة باسم قراءات الوظيفية. في البشر، الدم المحيطي هو عينة الأكثر ملاءمة ويمكن الوصول إليها بسهولة والتي يمكن استخدامها لتحديد الاستجابة المناعية الخلطية التي تسببها الخلايا المضيفة (ب). متميزة فرعية B-الخلية، بما في ذلك مخولا لصيانة طائرات، ويمكن أن تكون معزولة مباشرة من الدم المحيطي عبر التحديد مع ميكروبيدات-نسب محددة أب مترافق أو عن طريق الفرز الخلية مع التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، النقاء الخلايا البائية ساذجة والذاكرة يمكن تفعيلها ومتباينة في مخولا لصيانة طائرات في الثقافة. الأنشطة الوظيفية للمخولا لصيانة طائرات للمساهمة في إفراز أب يمكن قياسها كميا بواسطة ELISPOT، وهو فحص أن يتقاطع انزيم-linked فحص immunoabsorbance (ELISA) والتكنولوجيات النشاف الغربية لتمكين تعداد مخولا لصيانة طائرات الفردية على مستوى خلية واحدة. في الممارسة العملية، تم استخدام فحص ELISPOT على نحو متزايد لتقييم نجاعة اللقاح بسبب سهولة التعامل مع عدد كبير من عينات الدم. طرق عزل الخلايا البائية الإنسان من الدم المحيطي، وسيتم وصف تمايز الخلايا البائية إلى مخولا لصيانة طائرات في المختبر، وتوظيف ELISPOT لتقدير حجم إجمالي IgM- و IgG-مخولا لصيانة طائرات هنا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا باء تلعب دورا محوريا في تطوير مناعة الخلطية. أن تتطور في البداية في نخاع العظم وتدخل مجرى الدم وخلايا ساذجة B، والتي يمكن أن تهاجر إلى الأنسجة اللمفاوية، مثل الطحال والغدد الليمفاوية، واللوزتين، لمزيد من التطوير. على لقاء حج، بعض الخلايا البائية ساذجة تهاجر إلى بصيلات اللمفاوية، حيث مركز جرثومي الخلايا باء يمكن أن تفرق في خلايا الذاكرة بي وplasmablasts (PBS) / خلايا البلازما (أجهزة الكمبيوتر). في حين أن معظم ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر الخروج في مجرى الدم، وعدد قليل يقيمون في نهاية المطاف في نخاع العظام الخضوع التمايز النهائي إلى أجهزة الكمبيوتر طويلة الأمد 1. الخلايا البائية في التداول غير متجانسة، وفي حالة مستقرة، في برنامج تلفزيوني / أجهزة الكمبيوتر نادرة في الدم المحيطي 2. ونتيجة لتوافر علامات سطح-نسب محددة، أصبح التدفق الخلوي وسيلة شعبية لتحديد وتوصيف فرعية B-الخلية في الدم المحيطي. تطبيق موسعة من cytometr تدفقذ هو إضافة وظيفة الخلية فارز، الذي يسمح بفصل وعزل مجموعات فرعية فردية الخلايا البائية مع نقاء عالية. واستنادا إلى التعبير عن مستقبلات سطح محددة في مراحل نمو مختلفة، تصنف تعميم الخلايا البائية الإنسان عموما إلى ثلاث مجموعات سكانية فرعية رئيسية هي: الخلايا البائية ساذجة (CD19 + CD27 - CD38 -)، وخلايا الذاكرة بي (CD19 + CD27 + CD38 -)، و ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (الشكل 1). والخلايا البائية ساذجة بطبيعتها لم تواجه قسم الخدمات الزراعية. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تكون متباينة في الغلوبولين المناعي + CD27 + خلايا الذاكرة بي. على الرغم من أن الخلايا البائية ساذجة متجانسة في التعبير عن مستقبلات المستضد B-الخلية (BCR) جزيئات -associated (على سبيل المثال، CD19، CD20 CD22 و) وهم غير متجانسة في الغلوبولين المناعي ذخيرتهم 5. غالبية CD27 + خلايا الذاكرة بي يمكن أن تكون متباينة في CD27+ / مرحبا CD38 + ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر 6. وبالإضافة إلى ذلك، خلايا الذاكرة بي وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر هي بولكلونل ويحمل التنموي وظيفية التجانس 4-7. ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر في التداول قصيرة الأجل عادة ولا تعبر عن CD138، ولكن تلك التي ليستقر في نخاع العظام سوف يفرق عضال وتصبح طويلة الأمد. الميؤوس أجهزة الكمبيوتر متباينة تعبر عن CD138 وأسفل تنظيم جزيئات CD27 على سطحها 8. لأن كلا من برنامج تلفزيوني وأجهزة الكمبيوتر قادرة على إفراز عبس، في مناسبات عديدة يتم الرمز أنها مجتمعة باسم مخولا لصيانة طائرات. في المقابل، يمكن أن لا الخلايا البائية ساذجة ولا خلايا الذاكرة بي تنتج كميات لا يستهان بها عبس 9-10. ومع ذلك، عندما عزل، سواء ساذجة والذاكرة خلايا B ويمكن التفريق في مخولا لصيانة طائرات في 3-10 أيام عندما وضعت في ظروف التربية الصحيحة 6، 11-15. في الواقع، مخولا لصيانة طائرات المستمدة من في المختبر حصة التمايز تعبيرات سطح مماثلة من CD27 و CD38 مع تلك الاب معزولة مباشرةالدم المحيطي OM 6. بالإضافة إلى ذلك، مخولا لصيانة طائرات متباينة في المختبر تعبر عن تدني مستوى CD20 سطح، على غرار أن تعميم ميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر 6. على الرغم من أن مخولا لصيانة طائرات المستمدة من الثقافة كلها لم تدم طويلا، فإنها يمكن أن تفرز عبس، مما يشير إلى أنها المختصة وظيفيا وقادرة على المساهمة في مناعة الخلطية.

كل من إليسا وELISPOT هي الآن الأساليب التطبيقية شيوعا التي للحصول على معلومات وظيفية على الاستجابة المناعية الخلطية. إليسا هو 96-كذلك فحص القائم على لوحة، وكثيرا ما يستخدم لقياس التتر من المصل عبس حج محددة والتحاليل الأخرى (على سبيل المثال، السيتوكينات). أنها مريحة وقابلة لل. تم تصميم ELISA لاستخدام الصلبة مرحلة انزيم فحص للكشف عن وجود عبس أو غيرها من المواد، مثل مصل، في عينة السائل 16. وقد استخدمت قراءات من ELISAs المصل على نطاق واسع لتمثيل الاستجابة المناعية للجسم. أداة ضرورية لاكتساب إعادةadouts من ELISA المقايسات هو قارئ صفيحة الطيفي. يمكن للقارئ أن تحديد الكثافة الضوئية (OD) من المنتجات النهائية عادة ينتج من تفاعل البيروكسيداز الفجل (HRP) -conjugated عبس كشف وركائز الخاصة بها (17). وفيما يتعلق الإبلاغ عن الاستجابة المناعية الخلطية، ومستويات أب المصل يحددها ELISA للدلالة على الجماعي، ولكن ليس الفردي، أداء مخولا لصيانة طائرات في الجسم. وبالإضافة إلى ذلك، ELISA لا يأخذ في الاعتبار مشاركة خلايا B الذاكرة، التي لا تفرز عبس.

مثل إليسا، ELISPOT هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع للكشف ورصد الاستجابة المناعية في عينات الدم الطرفية 17-18. ELISPOT هي تقنية تتعلق شطيرة ELISA. في ذلك، وتوضع الخلايا في difluoride البولي فينيل (PVDF) آبار المدعومة من غشاء من 96 جيدا microplates للثقافة على المدى القصير. مقايسة ELISPOT مشابه لأداء الغربية النشاف على صفيحة والناميهز البقع على غشاء PVDF في كل بئر. مطلوب نظام قارئ ELISPOT الآلي أو مجهر تشريحي لالعد والفرز اليدوي. والميزة الرئيسية لELISPOT في الكشف عن رد فعل مناعي هي حساسية فائقة في تقدير حجم مخولا لصيانة طائرات والخلايا المفرزة للخلوى. فإنه تقارير الأنشطة الوظيفية في المناعة الخلطية والخلوية، على التوالي. في قياس وظيفة المناعة الخلطية، ومستويات أب المصل الذي يحدده إليسا وعدد من مخولا لصيانة طائرات تعداد بواسطة ELISPOT وغالبا ما ترتبط، ولكن قراءات البيانات من هذه المقايسات لهما بعض الاختلافات في الآثار الوظيفية 19-20. والميزة الرئيسية لELISPOT هي حساسيته من طريقة. وقدم مستوى التتر أب المصل كما ذكرت من قبل ELISA شبه كميا كما قراءات OD، تدل على مستوى أب النسبي، أو أكثر من الناحية الكمية، وقراءات تركيز عندما يتم تضمين كمية معروفة من isotypes المناسبة من القيمة المطلقة للرجوع إليها. في المقابل، فإن نتائج ELISPOT هي PRESENTEد كما أن العدد المطلق للمخولا لصيانة طائرات في بركة من الخلايا في المصالح (على سبيل المثال، غير المجزأ الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs) والخلايا البائية النقاء من PBMCs). ELISPOT يمكن الكشف عن ASC واحدة، ولكن إليسا يتطلب كميات أب من مخولا لصيانة طائرات للوصول إلى تركيزات تعتمد على الفحص الأمثل قبل القياس. وبالتالي، ELISPOT متفوقة الواضح أن إليسا في حساسية الكمي. وعلاوة على ذلك، ELISPOT هو أيضا مناسبة لقياس في المختبر مخولا لصيانة طائرات متباينة من خلايا الذاكرة B تفعيلها. خلايا الذاكرة بي لا تفرز عبس ولكن يمكن أن تفرق في مخولا لصيانة طائرات على تفعيل. وبالتالي ليس لديهم المساهمة في القيمة المطلقة المصل الكشف عنها بواسطة ELISA. وهكذا، ELISPOT هو الأسلوب المفضل في قياس الاستجابة المناعية للتعميم خلايا الذاكرة بي بعد التنشيط في الثقافة. انها تسمح لرصد من الحفاظ على مناعة الخلطية على المدى الطويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب الحصول على الدم المحيطي الإنسان من المتبرعين الأصحاء تحت الموافقة المستنيرة، واستخدام عينات الدم يجب أن تتفق مع المبادئ التوجيهية المعتمدة التي وضعتها مجالس المراجعة المؤسسية الفردية. في هذه الدراسة، وبروتوكول لاستخدام الدم البشري في مظاهرة لنتائج التدفق الخلوي (الشكل 1) والمقايسات ELISPOT (الشكل 3) وافق عليها مجلس مراجعة الداخلية من مستشفى جامعة تايوان الوطنية (عدد بروتوكول 201307019RINB).

1. عزل وتنقية الخلايا الطرفية الإنسان الدم B

  1. رسم ~ 10 مل من الدم من الوريد المرفقي المتوسط (في الجزء الأمامي الحفرة المرفقي إلى الكوع) في أنبوب 15 مل تحتوي على K 2 EDTA (1،5-2،0 ملغ / مل دم) وعكس على الفور الأنبوب عدة مرات لمنع تجلط تشكيل.
  2. إضافة 35 مل من تعقيمها (121 درجة مئوية، لمدة 15 دقيقة) خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة (150 ملي NH 4 CL، 10 ملي KHCO 3، و 1 ملي EDTA؛ عH 7.4) إلى الأنبوب الذي يحتوي على عينة من الدم الطازج (≥ 3: 1 المجلد / المجلد)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
    ملاحظة: مظهر انتقال الضوء من خلال أنبوب يشير إلى الانتهاء من RBC تحلل.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج في RT لمدة 5 دقائق. تأكد من أن بيليه هو أبيض اللون.
  4. Resuspend وبيليه مع 10 مل من تعقيمها الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 4.3 ملي نا 2 هبو 4، و 1.47 ملي KH 2 PO 4؛ ودرجة الحموضة 7.4) وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.3.
  5. تجاهل طاف، resuspend الكرية مع 10 مل من المتوسط ​​1640 RPMI (المكملات الغذائية: 10٪ الجنين مصل العجل، و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين، 0.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، و 2 مم L-الجلوتامين)، ثم طبق من ل خلايا في طبق ثقافة 10 سم (10 مل من الدم في طبق). وضع الطبق في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة.
  6. دوامة بلطف الطبق الثقافة عدة مرات ووضعمستنبت (خلايا تعليق) في 15 مل من البلاستيك أنابيب مخروطية. تجاهل الخلايا الملتصقة (ومعظمهم الضامة) على أطباق الثقافة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج في RT لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
  8. Resuspend وبيليه مع 1 مل من المتوسط ​​1640 RPMI. حساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي.
    ملاحظة: الجدوى من الكريات البيض معزولة هي عادة أكبر من 90٪ من الاستبعاد التريبان الأزرق.
  9. الطرد المركزي كما في الخطوة 1.7 و resuspend الخلايا في ~ 200 ميكرولتر من العازلة الباردة برنامج تلفزيوني (0.5٪ زلال المصل البقري (BSA) و 2 ملي EDTA) في تركيز 5-10 × 10 6 خلية / مل.
  10. إضافة 5 ميكرولتر من المعقدة البيروكسيديز كوكتيل أب مكافحة الإنسان محددة لخلايا الدم (لاختيار السلبية للخلايا B) في 10 6 خلايا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة 21.
    ملاحظة: أب كوكتيل مكافحة الإنسان ينبغي أن تشمل على الأقل عبس محددة لCD2 (أو CD3)، CD14، CD16 و.
  11. إضافة حجم فائض بمقدار 10 أضعافمن برنامج تلفزيوني العقيمة إلى الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف.
  12. إضافة كميات متساوية من ميكروبيدات-streptavidin مترافق (5 ميكرولتر في 10 6 خلايا) إلى بيليه وتخلط جيدا.
  13. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في أنبوب 15 مل من البلاستيك مخروطي.
  14. إضافة 2 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني في أنبوب.
  15. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي واحتضان على RT لمدة 8 دقائق. سوف ميكروبيدات البني إرفاق تدريجيا إلى جدار الأنبوب بجانب المغناطيس 22.
  16. مع أنبوب المتبقية في الوقوف المغناطيسي، ونقل بعناية طاف في معقم جديد أنبوب 15 مل 22.
  17. كرر الخطوات 1،14-1،16، والجمع بين supernatants اثنين التي تحتوي على الخلايا البائية يمسها. تجاهل ميكروبيدات.
  18. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج في RT لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
  19. resuspend الكرية في المتوسط ​​1640 RPMI للتجارب المصب.
    ملاحظة: عادة، 1-5 × 10 5 الخلايا ب خفة دمها نقاء أكبر من 95٪ من 10 مل من الدم المحيطي يمكن عزل 23.

2. تنقية وفصل الذاكرة والسذاجة ب خلايا من خلايا B معزولة

  1. استخدام الخلايا تنقيته من الخطوة 1 وتحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة في برنامج تلفزيوني البارد بعد الطرد المركزي في 600 x ج و RT لمدة 5 دقائق.
  3. إضافة 1-2 ميكروغرام من البيروكسيديز ماب CD27 في 10 6 خلايا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. إضافة 10 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني في أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من العازلة في برنامج تلفزيوني.
  6. إضافة كميات متساوية من ميكروبيدات المغناطيسية streptavidin (1-2 ميكروغرام / 10 6 خلايا) إلى خلايا في أنبوب مخروطي البلاستيك 15 مل.
  7. المزيج بلطف جيد واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  8. إضافة 2-3 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني للأنبوب.
  9. ضع الأنبوب في موقف المغناطيسي واحتضان على RT لمدة 8 دقائق للسماح للميكروبيدات البني لنعلق على الجانب الأقرب إلى المغناطيس.
  10. مع أنبوب في موقف المغناطيسي، ونقل بعناية الكسر طاف في أنبوب معقم الجديد. يحتوي هذا الجزء على CD27 المخصب - الخلايا البائية ساذجة.
  11. إضافة 5 مل إلى الأنبوب الذي يحتوي على ميكروبيدات و resuspend بلطف ميكروبيدات (أي الجزء المخصب من CD27 + خلايا الذاكرة بي) 24-25.
  12. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج في RT لمدة 5 دقائق. Resuspend والكريات مع المتوسط ​​1640 RPMI للتجارب المصب.
    ملاحظة: عادة، ~ 30 - 60٪ من الخلايا البائية يمكن تنقيته من خلايا الذاكرة CD27 + من PBMCs من متبرع سليم 7، 25-26.

3. الفرز الخلية لجمع الخلايا السذاجة B، خلايا الذاكرة B، وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر

  1. استخدام الخلايا تنقيته من الخطوة 1، وتحديد عدد الخلايا باستخدام hemocytomeثالثا أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. resuspend الخلايا في العازلة في برنامج تلفزيوني الباردة في تركيز 10 7 لكل مليلتر في أنبوب البوليسترين 5 مل.
  3. إضافة 1-2 ميكروغرام من مفتش الإنسان في 10 6 خلايا واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة للكتلة لكرة القدم.
  4. إضافة 1 ميكروغرام لكل من مكافحة CD19-APC (استنساخ: HIB19)، ومكافحة CD27-eFluor450 (استنساخ: O323)، ومكافحة CD38-PE (استنساخ: HIT2) في 10 6 خلايا. تخلط جيدا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة 4، 27.
  5. في 5 دقائق الماضي في الخطوة 3.4، إضافة 5 ميكرولتر من 7 aminoactinomycin التجاري D (7-AAD).
  6. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. resuspend الخلايا في فرز عازلة (برنامج تلفزيوني العقيمة مع 2٪ BSA و 2 ملي EDTA) بتركيز 1-5 × 10 7 خلايا لكل مليلتر في أنبوب 15 مل.
  8. تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية شبكة من النايلون (40 ميكرون حجم المسام) للقضاء على كتل الخلايا.
  9. فصل الخلايا مع cytometric نوع تدفقإيه مجهزة ثلاثة الليزر: البنفسجي (405 نانومتر) والأزرق (488 نانومتر)، والأحمر (640 نانومتر).
    ملاحظة: ليزر أزرق وحدها تكفي لمدة 3-اللون قياس التدفق الخلوي 27-28.
  10. نوع الخلايا في ثلاثة أنابيب 15 مل (التي تحتوي على 5 مل من RPMI المتوسطة) لجمع في وقت واحد من الخلايا البائية ساذجة (CD19 + CD27 -)، وخلايا الذاكرة بي (CD19 + CD27 +)، وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر (CD19 + CD27 + / مرحبا CD38 +) 3-4، 28.
    ملاحظة: الترتيب الخلايا البائية ساذجة والذاكرة يمكن أن يكون مثقف كما هو موضح في الخطوة 4.

4. التمايز في المختبر من خلايا معزولة CD19 الإنسان + B، CD19 + CD27 + الذاكرة B الخلايا، وCD19 + CD27 - السذاجة B الخلايا

  1. استخدام الخلايا تنقيته في خطوات 1.19، 2.10، 2.11 و 3.10، وتحديد عدد الخلايا مع عدادة الكريات أو عداد الخلايا التلقائي.
  2. resuspend الخلايا مع المتوسط ​​1640 RPMIبتركيز من 1 - 10 × 10 5 لكل مليلتر وقسامة لهم في الآبار من لوحة ال 12 أيضا.
  3. إضافة الدليل السياسي الشامل (ODN 2006) في 5 ميكروغرام / 10 6 خلية / مل 18، 29.
  4. ثقافة الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 5 أيام.
  5. حصاد الخلايا من كل بئر، ووضع كل منها على حدة في أنابيب 15 مل، إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني على كل أنبوب، وأجهزة الطرد المركزي لهم في 600 x ج و RT لمدة 5 دقائق.
  6. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو عداد الخلايا التلقائي. resuspend الخلايا بتركيز من 1 - 10 × 10 5 في مل مع RPMI 1640 المتوسطة.

5. ELISPOT الفحص

  1. إضافة 30 ميكرولتر من 35٪ من الإيثانول في الماء المقطر إلى كل بئر من لوحات ELISPOT لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: عندما pipetting ل، وتجنب لمس الغشاء في الآبار في جميع الأوقات.
  2. عكس لوحات ELISPOT لإزالة الإيثانول.
  3. وضع 150 ميكرولتر من ده تعقيمها 2 O في كل بئر واحتضانلهم في RT لمدة 5 دقائق لطرد قبالة الإيثانول المتبقية. اتبع مع غسل من برنامج تلفزيوني العقيمة في RT لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: الخطوات 5،1-5،3 قد يكون اختياري، وهذا يتوقف على تصنيع لوحات.
  4. وضع 50 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل بولكلونل F (أ ب ') 2 جزء من مكافحة الإنسان الإيج (مفتش + الغلوبولين المناعي + ايغا) (في برنامج تلفزيوني) في كل بئر من لوحات ELISPOT واحتضان لهم عند 4 درجات مئوية خلال الليل (المفضلة) أو 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة 11.
    ملاحظة: ختم حواف الصفائح مع بارافيلم حتى الاستخدام.
  5. عكس لوحات لإزالة عبس غير منضم، إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على كل جانب، واحتضان لهم مرتين في RT لمدة 3 دقائق في كل مرة.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 5٪ BSA (أو المتوسط ​​1640 RPMI) إلى كل بئر من أجل الحيلولة دون واحتضان لهم في RT لمدة 2 ساعة.
  7. عكس لوحات لإزالة عازلة تمنع. يغسل كل مرتين جيدا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، كما في الخطوة 5.5.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​1640 RPMI إلى كل بئر واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية.
  9. عندما تصبح جاهزة للبذور الخلايا، عكس لوحات لإزالة المتوسطة RPMI 1640.
  10. البذور 100 ميكرولتر (5 × 10 4)، 50 ميكرولتر (2.5 × 10 4)، و 25 ميكرولتر (1.25 × 10 4) من الخلايا (من الخطوات 1.19، 2.10، 2.11، 3.10، و 4.6) في الآبار ل ELISPOT لوحة. مع RPMI 1640 المتوسطة، وتحقيق وحدة التخزين إلى 150 ميكرولتر / جيد.
    ملاحظة: ما لا يقل عن واحد أو اثنين من التخفيفات المسلسل 2 أضعاف لطلاء الخلايا يوصى.
  11. احتضان لوحات في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ل8-14 ساعة 18. تجنب نقل لوحات أثناء الحضانة.
  12. عكس لوحات لإزالة الخلايا والمتوسط ​​1640 RPMI.
  13. إضافة 200 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني-T (برنامج تلفزيوني مع توين 20 0.05٪)، واحتضان لهم 5 مرات في RT، في كل مرة لمدة 3 دقائق. عكس لوحة لإزالة غسل العازلة بين كل من 5 يغسل.
  14. إضافة إما الماعز مكافحة الإنسان الفوسفاتيز القلوية مفتش-(ا ف ب)، وتقاسم المنافع Fcγ محددة (للكشف مفتش، 1: 5000 في برنامج تلفزيوني-T) أو الماعز مكافحة الإنسان الغلوبولين المناعي-AP، Fcμ-جزء محدد القيمة المطلقة (للكشف عن الغلوبولين المناعي، 1: 5000 في برنامج تلفزيوني-T) في الآبار المعينة واحتضانها في RT لمدة 2 ساعة في الظلام.
  15. يغسل كل مرتين جيدا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، كما في الخطوة 5.5.
  16. إضافة 50 ميكرولتر / بئر bromochloroindolyl فوسفات نيترو نتروبلو الأزرق (BCIP / NBT) حل الركيزة. تظهر بقع أرجوانية اللون عادة في 5-15 دقيقة.
  17. إضافة 100 ميكرولتر / بئر [ده 2 O لمنع الإفراط في تطوير المواقع.
  18. شطف لوحات مع تشغيل ماء الصنبور بعد تطوير كاملة لجميع البقع.
  19. إزالة underdrain من لوحات والسماح لهم الهواء الجاف في الظلام.
  20. عدد النقاط باستخدام قارئ لوحة الآلي مع وحدة الحصول على الصور / التحليل (على سبيل المثال، ماسح تلقائي أو يدويا عن طريق مجهر تشريح).
    ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في RT في الظلام وتحليلها في وقت لاحق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استنفاد PBMCs من كرات الدم الحمراء وخلايا ملتصقة (الخطوات 1،2-1،7). تعرض قسامة (2 × 10 6) من الخلايا لتحليل تدفق cytometric لتوضيح سكان خلايا ساذجة B، خلايا الذاكرة بي، وميزانيتي / أجهزة الكمبيوتر في الدم المحيطي (الشكل 1). في PBMCs هذه الجهة المانحة، فإن حوالي 10٪ من الخلايا الليمفاوية CD19 + B الخلايا. في مقصورة B-الخلية، نسبة CD19 + CD27 - كانت الخلايا البائية ساذجة حوالي 50٪. من نا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل وتنقية الخلايا الطرفية الإنسان الدم B

عادة، كرات الدم الحمراء يمكن أن تمزق بكفاءة وبرأت التي تحلل العازلة (الخطوة 1.2). ومن المهم عدم احتضان PBMCs مع العازلة تحلل RBC أطول من 5 دقائق، وبقاء الخلية قد تتأثر كلوريد الأمونيوم. بدلا من ذلك، كرات الدم الحمراء والصفائح الدموية يمكن إزالتها في وقت واحد بواسطة بروتوكول التالي.

خلط الدم الطازج كامل مع (...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن صاحب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة بمنحة بحثية من وزارة العلوم والتكنولوجيا في اليوان التنفيذي لتايوان (NSC99-2320-B-002-011). أود أن أنوه بالخدمة الممتازة التي يقدمها جوهر التحليل والفرز الخلوي للتدفق في المختبر الأساسي الأول في كلية الطب بجامعة تايوان الوطنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BD Vacutainer K2EBD Biosciences367525أنبوب 10 مل
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02خال من السموم
الداخلية محلول تريبان الأزرق 0.5٪الصناعات البيولوجية03-102-1B
IMag مجموعة تخصيب الخلايا الليمفاوية البشرية BBD Biosciences558007
Biotinylated CD27 mAbBiolegend302804استنساخ O323
Streptavidin الميكروبيدات المغناطيسيةBD Biosciences9000810
15 مل أنابيب الصقرBD Falcon352196
مصفاة خلية شبكية من النايلون الأزرق ، 40 & مBD Falcon352340
مضاد للإنسان CD19-APCBiolegend302212استنساخ HIB19
مضاد للإنسان CD27-eFluor 450eBioscience48-0279-42استنساخ O323
مضاد للإنسان CD38-PE-Cy7Biolegend303516استنساخ HIT2 & nbsp ؛
مضاد للإنسان CD38-PE-Cy7BD Biosciences560677استنساخ HIT2 & nbsp ؛
استنساخ مضاد للإنسان CD45-FITCBiolegend304006HI30
مضاد للإنسان CD45-FITCBD Biosciences555482استنساخ HI30
مضاد للماوس / الفئران / الإنسان CD27-PerCP Cy5.5Biolegend124213استنساخ LG.3A10
مضاد للإنسان CD27-PerCP Cy5.5BD Biosciences65429استنساخ L128
مضاد للإنسان CD19-FITCMiltenyi Biotec130-098-064استنساخ LT19
مضاد للإنسان CD19-FITCGeneTexGTX75599استنساخ LT19
مضاد للإنسان CD20-FITCBD Biosciences555622استنساخ 2H7
بيوتينيل مضاد للإنسان CD27Biolegend302804استنساخ O323
البيوتينيل المضاد للإنسان CD27eBioscience13-0279-80استنساخ O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD)BD Biosciences559925
CpG (ODN 2006)  InvivoGentlrl-2006النوع B CpG
المؤتلف البشري IL-2PeproTech200-02
المؤتلف البشري IL-10PeproTech200-10
المؤتلف البشري IL-21PeproTech200-21
المؤتلف البشري sCD40LPeproTech310-02
بروتين أ من S. aureus < / em>Cowan (SAC)Sigma-Aldrich82526
Pokeweed mitogen (PWM)Sigma-AldrichL9379
لوحات الترشيح متعددة الشاشات ، 0.45 & micro ؛ حجم المسامm Merck MilliporeMSIPS4510لوحة مرشح معقمة وشفافة 96 بئر مع غشاء PVDF مسعور
محلول BCI / NBTSigma-AldrichB6404
BCI / NBT كاشف واحد ، ركيزة الفوسفاتيز القلويةMerck MilliporeES006
Human IgGJackson ImmunoResearch009-000-003
Human IgG ، Fc جزءجاكسون ImmunoResearch009-000-008
F (ab') 2< / sub> جزء من الماعز المضاد للإنسان Ig (IgG + IgM + IgA)Jackson ImmunoResearch109-006-127
الماعز المضاد للإنسان IgG-alkaline phosphatase ، FC & gamma ؛ جزء خاصJackson ImmunoResearch109-055-008
الفوسفاتيز القلوي IgM المضاد للإنسان ، FC & micro جزء خاصجاكسون ImmunoResearch109-055-043
الماعز المضاد للإنسان IgG-peroxidase، FC & جزء خاصJackson ImmunoResearch109-035-008
الماعز المضاد للإنسان IgM-peroxidase، FC & micro خاصب Jackson ImmunoResearch109-035-095
BD ELISPOT AEC مجموعة الركيزةBD Biosciences551951
CTL محلل ImmunoSpotسي تي إل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
  2. Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
  3. Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
  4. Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
  5. Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
  6. Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
  7. Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81(2011).
  8. Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108(2014).
  9. Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
  10. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
  11. Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
  12. Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
  13. Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806(2012).
  14. Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
  15. Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
  16. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
  17. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
  18. Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
  19. Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403(2016).
  20. Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
  21. Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  22. Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
  23. Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
  24. Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  25. Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
  26. Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
  27. Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  28. Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
  29. Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
  30. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  31. Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
  32. Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
  33. Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
  34. Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
  35. Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
  36. Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
  37. Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
  38. Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
  39. Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
  40. Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
  41. Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972(2009).
  42. Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
  43. Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ELISpot

مقالات ذات صلة