مقالة منهجية

ال ذبابة الفاكهة تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

DOI:

10.3791/54585

⸱

أكتوبر 6, 2016

 , 
1Institute for Genetics, Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول كيفية توليد أورام نسيلي ملحوظ fluorescently، الذي يعرف وراثيا في ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي antennal (EAD) العين /. فهو يصف كيفية تشريح EAD والدماغ من يرقات العمر الثالث وكيفية معالجتها لتصور وتحديد التغييرات التعبير الجيني وغزو الورم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة السوداء برزت كنظام تجريبي قوي للدراسات الوظيفية والميكانيكية لتطور الورم وتطوره في سياق كائن حي كامل. تسهل التقنيات المتطورة لتوليد الفسيفساء الجينية تحريض المستنسخة المحددة وراثيا والمحددة بصريا والمحاطة بأنسجة طبيعية. يمكن تحليل المستنسخة من خلال الأساليب الجزيئية والخلوية والميكروبات المتنوعة. توضح هذه الدراسة كيفية توليد أورام نسيلة مصنفة بالفلورسنت ذات أورام خبيثة متفاوتة في الأقراص الخيالية للعين / الهوائي (EAD) ليرقات ذبابة الفاكهة باستخدام تحليل الفسيفساء باستخدام تقنية علامة الخلية القابلة للكبت (MARCM). يصف الإجراءات وكيفية استعادة الفسيفساء EAD والدماغ من اليرقات وكيفية معالجتها للتصوير المتزامن للمراسلين المعدلين وراثيا الفلورية وتلوين الأجسام المضادة. لتسهيل التوصيف الجزيئي لأنسجة الفسيفساء ، نصف بروتوكولا لعزل الحمض النووي الريبي الكلي عن EAD. إجراء التشريح مناسب لاستعادة EAD والأدمغة من أي مرحلة من مراحل اليرقات. يعمل بروتوكول التثبيت والتلوين للأقراص الخيالية مع عدد من المراسلين المعدلين وراثيا والأجسام المضادة التي تتعرف على بروتينات ذبابة الفاكهة. يمكن تطبيق بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي على أعضاء اليرقات المختلفة واليرقات الكاملة والذباب البالغ. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي الكلي لتنميط تغييرات التعبير الجيني باستخدام الأساليب المرشحة أو على مستوى الجينوم. أخيرا ، نقوم بتفصيل طريقة لقياس غزو الأورام النسيلية. على الرغم من أن هذه الطريقة لها استخدام محدود ، إلا أن مفهومها الأساسي ينطبق على نطاق واسع على الدراسات الكمية الأخرى حيث يجب تجنب التحيز المعرفي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمثل سرطان واحدة من أكثر المجموعات غير المتجانسة وراثيا من الأمراض، التي يتزايد بشكل كبير، وخاصة بين كبار السن في جميع أنحاء العالم حدوث وفيات. السرطان ينشأ متطابق بسلالة من خلية بدء الورم الذي يهرب آليات القامع الورم الكامن ويقسم خارج نطاق السيطرة. تراكم تدريجي من الآفات الوراثية التي تعزز تعاوني النمو والانتشار والحركة في حين تمنع الموت والتمايز يحول فرط حميدة الأولي إلى ورم خبيث للغاية، المنتشر والقاتل. أصبح من الواضح أنه بالإضافة إلى تغيرات جينية، تطور الورم يتطلب تغييرات في سدى المحيطة بها، والحديث المتبادل بين أنواع الأورام ومتعددة الخلية (على سبيل المثال، الخلايا الليفية، الخلايا المناعية والبطانية) في المكروية لها. فهم مبادئ الجزيئية الكامنة وراء التحول السرطاني بما في ذلك التفاعلات ورم سدى له أهمية كبيرة لتطوير الحيلولة دوناستراتيجيات نشوئها والفحص المبكر، فضلا عن علاجات جديدة وفعالة لمكافحة ورم خبيث من السرطان ومقاومة المخدرات.

أصبح ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة نظام جذابة لأبحاث السرطان 1-4 بسبب الوقت جيل سريع لها، والحفاظ على ملحوظا من الإشارات العقد بين الذباب والبشر، والتكرار الجيني المحدود وثروة من الأدوات الجينية المتقدمة التي تسهل التلاعب في الجينات أي تقريبا في بطريقة مقيدة مؤقتا ومكانيا. الأورام محددة وراثيا متفاوتة خبيثة يمكن هندستها بتكاثر في ذبابة الفاكهة عن طريق إدخال gain- والطفرات الخسارة من وظيفة في مجموعة فرعية من الأسلاف في الأنسجة نوع خلاف البرية باستخدام تقنية MARCM 5. الأداة MARCM يجمع FLP / FRT (FLP recombinase / FLP الاعتراف الهدف) بوساطة إعادة التركيب الإنقسامية 6 مع FLP التدريجي 7 و GAL4 / UAS (المنبع تنشيط تسلسل) الجين 8 الهدفنظم التعبير 9. مع هذا التعبير أسلوب أي التحوير أساس UAS، بما في ذلك الجين الورمي أو cDNAs بروتين فلوري أو تكرار الحمض النووي مقلوب لإسكات الجينات التي يسببها الرنا المزدوج الجديلة، سوف تقتصر على استنساخ الخلايا التي فقدت موضع الجيني المحدد وكاظمة GAL4 المقرر أن إعادة التركيب (الشكل 1A). بقع نسيلي التي تحمل علامة فلوري الأخضر (GFP) أو البروتينات الفلورية الحمراء (على سبيل المثال، طلب تقديم العروض، عن dsRed، mCherry) يمكن تعقبها بسهولة في جميع أنحاء التنمية، معزولة وتحليلها. الأهم من ذلك، يمكن مقارنة سلوكهم مباشرة إلى الأنسجة المجاورة نوع البرية. وبالتالي، ذات الصلة الأسئلة إلى الخلية آثار المستقلة وغير المستقلة من الآفات الوراثية يمكن دراستها بشكل ملائم. على غرار الثدييات، الحيوانات المستنسخة فقط التي يتم فيها مجتمعة تصبح عدة آفات أنكجنيك خبيث في ذبابة الفاكهة وألخص بصمات الرئيسية لسرطان الثدييات. أنها overproliferate، التهرب من موت الخلايا المبرمج، وحمل الالتهاب، تصبح خالدة وINVAالجديد إنجازا هاما، مما أسفر عن مقتل نهاية المطاف المضيف 10-17.

هنا، نحن تصف بروتوكول لتوليد أورام نسيلي محددة وراثيا في أنسجة العين / antennal والدماغ من يرقات ذبابة الفاكهة باستخدام تقنية MARCM. يعتمد الأسلوب على MARCM الأسهم اختبار الذي يعبر عن FLP recombinase الخميرة تحت سيطرة محسن بلا عيون (eyFLP) 18،19. وبهذه الطريقة، يتم إنشاء الحيوانات المستنسخة GFP المسمى في كل من ظهارة peripodial وعمودية من هيئة البيئة والظهارة العصبية للدماغ طوال المراحل الجنينية واليرقات (الشكل 1A، B والمرجعية 20). الحيوانات المستنسخة يمكن اتباعها بسهولة حتى سن البلوغ كما يطور EAD في العين الكبار، هوائي ورئيس كبسولة في حين أن الظهارة العصبية تثير neuroblasts التي تنتج متباينة الخلايا العصبية الفص البصري.

لتسهيل التوصيف الجزيئي، وظيفية والمظهري واسعة من النسيج الفسيفساء، فإننا ديالكاتب بروتوكول لتشريح EAD والدماغ من يرقات العمر الثالث والخطوط العريضة لكيفية معالجتها لمدة ثلاثة تطبيقات مختلفة: (ط) الكشف عن صحفيين الفلورسنت المعدلة وراثيا والمناعية، (ب) الكمي لغزو الورم و (ج) تحليل يتغير التعبير الجيني باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR) أو الإنتاجية العالية مرنا تسلسل (مرنا وما يليها) (الشكل 1C).

بروتوكول المناعية يمكن استخدامها لتصور أي بروتين من الفائدة مع الأجسام المضادة المحددة. توفر المعدلة وراثيا للصحفيين النسخي الفلورسنت المعلومات الزمانية المكانية مريحة ودقيقة عن النشاط لمسار الإشارات معين. خلية نسب للصحفيين معين، من ناحية أخرى، تعكس التغييرات النوعية والكمية في أعداد الخلايا داخل الأنسجة الفسيفساء وبين الأورام من التراكيب الوراثية المتميزة. الكمي للسلوك الغازية يسهل المقارنة بين الأورام الخبيثة السرطانية بين النمط الجينيالصورة. وأخيرا، فإن بروتوكول يصف جمع ومعالجة EAD الفسيفساء لعزل الحمض النووي الريبي هو مناسبة للتطبيقات المصب الصغيرة والكبيرة مثل النسخ العكسي تليها QRT-PCR وعلى نطاق الجينوم مرنا وما يليها على التوالي. البيانات النوعية والكمية التي تم الحصول عليها من هذه المقايسات توفر رؤى جديدة في السلوك الاجتماعي للأورام نسيلي. وعلاوة على ذلك، فإنها تنتج أساسا متينا للدراسات وظيفية على دور الجينات الفردية والشبكات الوراثية والمكروية الورم في مراحل مختلفة، وجوانب من تكون الأورام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: هذا العمل يستخدم في eyFLP1. عمل> ص +> GAL4، UAS-GFP. FRT82B وحوض استحمام-Gal80 MARCM 82B الأخضر خط اختبار 11. عبور العذارى اختبار MARCM 82B الأخضر للذكور السلالات مثل ث. UAS واحد. سوف UAS-B رني، FRT82B ج موت الوراثي ينتج ذرية التي سوف تحدث إعادة التركيب الإنقسامية بين أحضان اليمنى من الكروموسومات المتجانسة 3 الثالثة. وبهذه الطريقة، سيتم إنشاء استنساخ متحولة متماثل لج الجين الموجود البعيدة إلى الموقع FRT82B داخل هيئة البيئة والظهارة العصبية في الدماغ. وهذه الحيوانات المستنسخة التعبير عن GFP، التحوير ووالرنا المزدوج الجديلة لجين ب (الشكل 1A). وقد تم إنشاء العديد من خطوط اختبار eyFLP-MARCM لإعادة التركيب على X، 2L، 2R، 3L و3R وتتوفر داخل المجتمع الطاير.

1. يطير المناولة والصلبان، والتدريج

  1. توسيع المخزون MARCM اختبار المناسب في درجة حرارة الغرفة عن طريق ملء بو متعددةttles في نفس الوقت. الوجه البالغين في زجاجات جديدة كل 2-3 أيام حتى يمكن جمعها أن العذارى كافية لالصلبان اللاحقة.
    ملاحظة: عندما جمع العذارى، تجنب التعرض لفترات طويلة إلى CO 2، وهذا يقوض خصوبة الإناث.
  2. اعتمادا على حجم التجربة، وإنشاء تقاطعات ذبابة في قارورة استخدام لا يقل عن 10 العذارى اختبار MARCM و 4 ذكور (على سبيل المثال، للتصوير من الصحفيين الفلورسنت والمناعية) أو في زجاجات مع لا يقل عن 30 من الحور العين و 10 من الذكور (على سبيل المثال، ل عزل الحمض النووي الريبي وتقدير من الغزو).
  3. رفع ذرية عند 25 درجة مئوية تحت يوم طويل 16 ساعة / 8 ساعة دورة ضوء الظلام. الوجه الآباء في قوارير / زجاجات جديدة كل 24 ساعة لتسهيل انطلاق استنساخه من اليرقات ومنع الازدحام.
    ملاحظة: ابتداء من يوم 6 بعد وضع البيض (AEL)، في وقت متأخر الثالثة السيطرة الطور توقف اليرقات التغذية، تبدأ تجول وتدخل pupariation. في المقابل، بداية التحول اليرقات، العذراء يمكن إزالةخلال الموسم أو غير موجودة في اليرقات مع EAD تحمل الأورام نسيلي المفرطة التصنع أو الخبيثة.

2. جمع ثالثا الطور يرقات

  1. لالمناعية، وجمع حوالي 20 في وقت متأخر الثالثة يرقات العمر (تجول على الحائط، وتلك من حجم الجسم مقارنة من الطعام). استخدام ملقط لاختيار بلطف اليرقات من القنينة أو زجاجة ونقلها إلى طبق الجنين زجاجية مملوءة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
    1. لعزل الحمض النووي الريبي وتقدير من الغزو، وجمع ما لا يقل عن 80 في وقت متأخر الثالثة يرقات العمر (تجول على الحائط، وتلك من حجم الجسم مقارنة من الطعام). استخدام زجاجة بخ بخ برنامج تلفزيوني في زجاجة الطيران التي تحتوي على يرقات حتى يتم تغطية السطح.
    2. تنعيم الطبقات العليا من الطعام مع ملعقة وصب الهريس الأغذية التي تحتوي على اليرقات في طبق بتري. باستخدام ملقط، واختيار بلطف اليرقات ونقلها إلى طبق الجنين زجاجية مملوءة برنامج تلفزيوني.
  2. غسل اليرقات مع برنامج تلفزيوني الاتحاد الوطني للعمالايل تتم إزالة جميع المواد الغذائية المتبقية. تفقد اليرقات تحت مجهر تشريحي الفلورسنت مع 8 إلى 16X التكبير إلى تجاهل كل "اليرقات الفهد" التي تحمل البقع GFP إيجابية عشوائية في جميع أنحاء الجسم اليرقات (الشكل 2A، 2B وانظر القسم مناقشة).
    ملاحظة: للحصول على عزل الحمض النووي الريبي تشمل خطوة الغسيل قبل الأخيرة في ETOH 70٪ لمدة 1 دقيقة.
  3. ضع صحن يحتوي اليرقات مختارة في برنامج تلفزيوني على الجليد حتى تشريح. اليرقات عملية في غضون 30 دقيقة لتجنب الآثار السلبية من البرد والجوع.

3. تشريح اليرقات

  1. لتشريح EAD تحت مجهر تشريحي، استخدم زوج واحد من ملقط للضغط بلطف على الجزء الأوسط من يرقة ضد أسفل الطبق الزجاجي. مع ملقط الثانية، والاستيلاء على السنانير الفم اليرقات وسحبها بعيدا عن الجسم (الشكل 2C).
    ملاحظة: قوة جذب في كثير من الأحيان ما يكفي لكسر سيقان البصرية التي تربط EAD بايص لفصوص الدماغ. إذا كان الدماغ أو في أجزائه البقاء تعلق على EAD، وليس هو المطلوب وجودها لمزيد من التطبيقات، وقطع سيقان البصرية مع بمساعدة اثنين من أزواج من الملقط. للأورام الغازية (على سبيل المثال، رأس V12 scrib 1) العلاقة بين هيئة البيئة وفصوص الدماغ يصبح حجب نحو متزايد مع الوقت من خلال زيادة في النمو والخلايا المهاجرة نسيلي.
    1. لإعداد مجمع EAD / الدماغ مع الحبل العصبي البطني سليمة (VNC) (الشكل 2D)، استخدام ملقط لقطع يرقة في وسط الجسم. تجاهل النصف الخلفي.
    2. عقد النصف الأمامي من الجسم اليرقات بين نصائح من احد ملقط، والوجه اليرقة من الداخل إلى الخارج عن طريق دفع في الفم السنانير مع غيض من ملقط الثانية وقبل المتداول بشرة أكثر من ذلك مع أول زوج ملقط.
  2. باستخدام ملقط إزالة بعناية جميع أنسجة غريبة (على سبيل المثال، الغدد اللعابية، الدهون في الجسم، والأمعاء)، في حين ترك الزوج EAD أومجمع EAD / الدماغ مرتبطة السنانير الفم. فصل السنانير الفم من بشرة الفوقية. تحرير VNC بقطع التوقعات محور عصبي يمتد إلى عضلات الجسم والبشرة (أرقام 1B، 2C، 2D).
    ملاحظة: والسنانير الفم تسمح للتلاعب آمن من النسيج مع ملقط وتسهيل غرق أكثر كفاءة وسهولة التعرف على الأنسجة أثناء الغسل. تشريح EAD تغيير التشكل سريع نسبيا عندما أبقى غير المثبتة في برنامج تلفزيوني. يحدد الوقت تشريح ل20-30 دقيقة.
  3. لنقل الأنسجة، ومعطف P20 micropipette غيض من قبل pipetting الجسم المتبقية جثث عدة مرات صعودا وهبوطا. لنقل المجمعات الكبيرة EAD / الدماغ، وقطع micropipette غيض P20 مع مقص.
    ملاحظة: الإجراء طلاء أمر بالغ الأهمية لمنع الالتصاق وفقدان الأنسجة تشريح أثناء النقل. استخدام micropipette P20 يقلل من نقل برنامج تلفزيوني في حل تثبيتي، والحد من التخفيف غير المرغوب فيها.
    1. لالمناعية، ونقلتشريح EAD في أنبوب 0.5 مل مليئة 400 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) مثبت. استخدام أنبوب 1.5 مل مع 1 مل PFA لEAD أكبر / المجمعات الدماغ المخصصة لالتهديف من الغزو.
      تنبيه: PFA شديدة السمية. ارتداء القفازات والملابس الواقية. تجنب ملامسة الجلد أو العينين أو الأغشية المخاطية.
    2. لعزل الحمض النووي الريبي نقل EAD تشريح في طبق زجاج جديد مليئة برنامج تلفزيوني الباردة. استخدام ملقط لتنظيف EAD من الحلبة، والغدد الليمفاوية، للحد من التلوث العينة.
    3. فصل EAD من السنانير الفم عن طريق قطع الاتصال بين أقراص الهوائي والسنانير الفم باستخدام ملقط (الشكل 2E). لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي والجينات التحف التعبير، والحد من الوقت تشريح لمدة 30 دقيقة. انتقل إلى الخطوة 7.
      ملاحظة: باحث ذوي الخبرة يمكن تشريح حوالي 60 اليرقات في 30 دقيقة باستثناء الوقت اللازم لجمع اليرقات والغسيل. تعتمد مجموع عائدات RNA على حجم EAD التي تختلف بين الأنماط الجينية وdevelopmentaمراحل لتر. تشريح 80-100 أزواج السيطرة EAD من أواخر يرقات العمر الثالثة ينبغي أن تسفر 5-8 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع.

4. إصلاح، المناعية، وتركيب

  1. إصلاح العينات في PFA تثبيتي لمدة 25 دقيقة في حين الإيماء في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تمديد الوقت تثبيت ما يصل إلى 60 دقيقة دون تغيير التشكل الأنسجة واستضداد من البروتينات.
  2. إزالة تثبيتي، وغسل العينات مع PBST (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100) ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة باستخدام nutator. استخدام كمية كافية من PBST لكل خطوة الغسيل (400 ميكرولتر أنبوب / 0.5 مل).
    يعني الثابتة مجمعات / الدماغ EAD عن التهديف من الغزو لا تتطلب المناعية: ملاحظة. تبقى إشارة GFP مرئية جيدا بعد التثبيت. انتقل إلى الخطوة 4.4 لتشريح النهائي.
    1. لالمناعية والأنسجة كتلة في 200 ميكرولتر من عرقلة الحل (PBST مع 0.3٪ BSA) لمدة 20 دقيقة مع الإثارة لطيف في درجة حرارة الغرفة.
      1. احتضان مع متزمتالأجسام المضادة آرى مخففة في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في حين يهز بلطف. الرجوع إلى ورقة البيانات الأجسام المضادة الأولية أو الكتابات المنشورة عن الموصى تخفيف الأجسام المضادة.
        ملاحظة: قد يحتاج تخفيف الأجسام المضادة الأولية على الوجه الأمثل.
      2. وبعد خمسة 10 يغسل دقيقة في PBST، الأنسجة وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المخفف في عرقلة الحل في حين يهز بلطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام.
      3. غسل العينات ثلاث مرات 10 دقيقة في PBST.
  3. استبدال PBST مع 500 ميكرولتر من محلول دابي تلطيخ. لتسمية F-الأكتين، إضافة phalloidin مترافق إلى صبغة الفلورسنت إلى حل دابي تلطيخ. بعد 15 الإيماءة دقيقة في الظلام، وغسل الأنسجة مرة واحدة لمدة 10 دقيقة مع PBST.
    ملاحظة: يمكن أن يتم وضع العلامات F-الأكتين بشكل مستقل من تلطيخ دابي.
  4. للخطوة تشريح النهائية، نقل أنسجة الظهر في طبق زجاجي برنامج تلفزيوني باستخدام بي 1 ملpette. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط مقطع من السنانير الفم.
    1. فصل العقول التي سيتم استخدامها لتقدير حجم غزو من هيئة البيئة عن طريق قطع ساق البصرية وEAD متضخمة قد تعيق التحليل.
  5. وضع قطرة من متوسطة تركيب (15 ميكرولتر ل22 ملم × 22 ملم ساترة) على شريحة موضوعية. مع مساعدة من ملقط نصائح، توزيع المتوسطة إلى طبقة رقيقة. نقل EAD، والعقول أو المجمعات EAD / الدماغ في المتوسطة المتزايدة مع micropipette P20.
  6. استخدام النصائح ملقط أو قضيب التنغستن لتوزيع الأنسجة وتصويب VNC على الشريحة.
  7. لتجنب تشكيل فقاعات في حين تصاعد، أول لمسة حافة واحدة من ساترة إلى تصاعد المتوسط ​​ومن ثم انخفاض ببطء على المتوسطة المتزايدة بمساعدة ملقط. استخدام قطع صغيرة من ورق الترشيح أو أنسجة مسح لاستيعاب المتوسطة تصاعد الزائدة حول حواف ساترة.
    ملاحظة: DABCO / بولي (كحول الفينيل) 4-88 تصاعد يصلب المتوسطةفي 4 درجات مئوية في غضون ساعة. ويمكن تخزين الشرائح لعدة أشهر في 4 درجات مئوية.

5. متحد البؤر التصوير

  1. الحصول على أقسام مبائر واحدة ومداخن باستخدام مجهر متحد البؤر مجهزة 20X والأهداف النفط 40X 60X و.
  2. منع بكسل التشبع. استخدام معلمات الحصول على الصور نفسها بما في ذلك دقة وضوح الصورة، والليزر مدخلات الطاقة، وزيادة، ويقابل، والإطار المتوسط، حجم خطوة في زي سلسلة والحفاظ على هذه الإعدادات لكافة الأنماط الوراثية للسماح لمقارنة شدة بكسل بين التراكيب الوراثية المختلفة 21،22.
    ملاحظة: للحصول على تصور لهيئة البيئة / مجمع الدماغ، وتوليد أقصى قدر التوقعات وغرزة منها، الصور المجاورة. لإعداد الصورة النهائية، استخدم آخر برامج معالجة الصور لتجميع الفريق ولضبط السطوع والتباين.

6. الكمي لغزو الورم

  1. تعريف نظام التهديف من شأنها أن تميز مستويات مختلفة من invasivenes الورمليالي النظر في نمط المكاني للغزو وكمية من الخلايا GFP إيجابية تنتشر في الدماغ وفنك. إعداد ورقة تقييم للوثائق (الشكل 3A).
  2. جبل لا يقل عن 80 الثابتة العقول سليمة لكل النمط الجيني على شريحة واحدة باستخدام 40 ميكرولتر من المتوسطة المتزايدة في 24 ملم × 50 ملم ساترة.
    1. للسماح التهديف غير متحيزة، اطلب من طرف محايد لتجهيل الشرائح، بحيث الإجراء التهديف غير متحيزة. تقييم الشرائح مجهولة المصدر من قبل اثنين من أعضاء مختبر مستقل. الكشف عن المورثات فقط بعد الانتهاء من فرز الأصوات.
  3. تقييم درجة خباثة من قبل التهديف أعمى من العقول التي شنت تحت مجهر تشريحي الفلورسنت مجهزة بمجموعة مرشح GFP. استخدام علامة لتسمية العقول التي تم عرضها بالفعل لتجنب العد المزدوج (الشكل 3B).
  4. حساب النسبة المئوية من العقول الوقوع في كل فئة من الفئات الغازية محددة في التركيب الوراثي. تحديد الصورة الإحصائيةignificance باستخدام اختبار مربع كاي (الشكل 3C).

7. عزل الحمض النووي الريبي، الدناز العلاج، وفحص الجودة

ملاحظة: جميع الكواشف (حلول، بلستيكور) المستخدمة في الخطوات التالية يجب أن تكون خالية من النشاط ريبونوكلياز. دائما ارتداء القفازات واستخدام غطاء الكيميائي للعمل مع المذيبات العضوية.

  1. نقل EAD نظيفة مع المغلفة طرف P20 micropipette في أنبوب 1.5 مل.
  2. السماح بالوعة الأنسجة إلى أسفل الأنبوب، وإزالة بعناية برنامج تلفزيوني واستبدالها مع 100 ميكرولتر كاشف RNA تحلل (يكفي لمدة تصل إلى 140 EAD).
  3. الأنسجة ليز قبل vortexing. في هذه المرحلة، يمكن أن العينات تكون عميقة المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية أو معالجتها مباشرة مع بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي القياسية.
    ملاحظة: عينات من المورثات مماثلة من جولات تشريح متعددة يمكن تجميعها مرة واحدة في الحمض النووي الريبي تحلل كاشف.
  4. ملء حجم العينة إلى 0.9 مل مع كاشف RNA تحلل. إضافة 0.2 مل من الكلوروفورم ومزيج عينات vigorously لمدة 15-20 ثانية.
  5. بعد 2-3 حضانة دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وأجهزة الطرد المركزي العينات في 10000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. نقل عديم اللون العلوي المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي في أنبوب جديد من دون إزعاج البيني. البقاء بعيدا عن البيني كما أنه يحتوي على البروتينات والحمض النووي الجيني.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم تعافى حوالي 60٪ من حجم كاشف RNA تحلل تستخدم لالتجانس.
  7. ترسيب الحمض النووي الريبي إضافة 0.5 مل من الكحول الآيزوبروبيل. دوامة واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  8. الطرد المركزي العينات في 10000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  9. تجاهل طاف ويغسل بيليه RNA مرة واحدة مع 600 ميكرولتر من 75٪ من الإيثانول. بعد دوامة قصيرة والطرد المركزي (10000 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية) تجاهل كل الايثانول والسماح للبيليه RNA الهواء الجاف لمدة 5-10 دقائق وضع أنبوب مفتوحة على منديل نظيف مسح.
    ملاحظة: بيليه RNA قد تكون واضحة على أنه صغير مبهمة الأبيض ST /ناضجة في الجزء السفلي من أنبوب أو غير مرئية. قطرات الايثانول المتبقية يمكن إزالتها بعناية مع طرف P10 micropipette.
  10. حل الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر من DEPC المياه المعالجة قبل vortexing أو تمرير حل عدة مرات خلال قمة ماصة.
  11. للحد من التلوث مع الحمض النووي الجيني، علاج الحمض النووي الريبي مجموع مع الدناز بإضافة 50 ميكرولتر من مزيج يحتوي على 1 ميكرولتر من الدناز (يو 2 / ميكرولتر) و 10 ميكرولتر من 10X العازلة الدناز في المياه المعالجة DEPC. دوامة وتدور باستمرار.
  12. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة التدفئة لمدة 30 إلى 40 دقيقة. بعد الحضانة، وإضافة 100 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC في كل عينة.
  13. لتعطيل النشاط الأنزيمي والجيش الملكي النيبالي نظيف من الدناز، إضافة 200 ميكرولتر من الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1) حل، دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي العينات في 10000 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
  14. نقل بعناية المرحلة المائية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي في أنبوب جديد. إضافة حجم مساو (200 ميكرولتر)من الكلوروفورم، وخلط وكرر الخطوة الطرد المركزي من فوق.
  15. جمع بعناية المرحلة العليا ويعجل الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 10/01 حجم 3 M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2 أعد DEPC H 2 O و 2.5 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج دقيق من قبل vortexing.
    ملاحظة: إضافة 0.5 ميكرولتر الجليكوجين (20 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى خليط هطول الأمطار تساعد على تصور بيليه الحمض النووي الريبي. لتقليل الخسائر RNA، استخدم صلكنزد، وأنابيب microcentrifuge 1.5 مل منخفضة ملزم.
  16. ترسيب الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
    ملاحظة: يمكن حمل الحضانة بين عشية وضحاها. عينات يمكن وضعها في -80 ° C كذلك.
  17. بيليه RNA عن طريق الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. غسل والجافة بيليه بعد وصف في 7.9.
  18. حل الحمض النووي الريبي في 10-15 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
  19. تحديد كمية ونقاء من الحمض النووي الريبي عن طريق قياس OD في 230 نانومتر و 260 نانومتر و 280 نانومتر باستخدام مطياف. حساب RNA المشتركncentration عن طريق تطبيق الاتفاقية أن 1 OD في 260 نانومتر يساوي 40 ميكروغرام / مل RNA.
    ملاحظة: نسبة و260/280 من الحمض النووي الريبي "النقي" يساوي 2.0 في حين ينبغي أن يكون نسبة و260/230 في مجموعة من 2،0-2،2. عينات الحمض النووي الريبي مع ونسبة 260/280 ما بين 1.7 و 2.0 هي مناسبة للتطبيقات المصب مثل التوليف [كدنا]. لإعداد مكتبات مرنا وما يليها نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي يجب أن يتم التحقق باستخدام نظام الكهربائي الآلي. وينبغي أن تكون نسبة 28S / 18S فوق 1.8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتدليل على إمكانات تقنية eyFLP-MARCM لتوليد بقع بعلامات GFP من التراكيب الوراثية المحددة في ذبابة الفاكهة EAD، والناجم عن ثلاثة أنواع من الحيوانات المستنسخة: (1) التحكم في التعبير عن GFP فقط، (2) الأورام الخبيثة معربا عن شكل أنكجنيك من الصغيرة G-بروتين رأس (رأس V12) في خلفية فقدان متماثل من خربشات الورم القامع الجينات (scrib 1)، و (3) زيادة في النمو ولكن غير الغازية رأس V12 scrib

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنيات لتوليد الفسيفساء الوراثية في ذبابة الفاكهة هي من ضمن الأدوات الأكثر تطورا لتحليل والتلاعب وظيفة الجين 33. وقد ثبت أن نظام eyFLP-MARCM قوية وقوية لأنها تتيح للتحريض ملحوظ بصريا، استنساخ محددة وراثيا بطريقة مقيدة مكانيا، أي في الأنسجة حيث محسن بلا عيون نشط 9،18. وهذا أمر مهم خاصة عندما يتم الجمع بين آفات جينية متعددة في نفس الخلايا. بينما تسمح هذه البقع الشاذة للغاية نمو اليرقات عندما يقتصر على EAD والدماغ neuroepithelia، فإنها...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مركز بلومنجتون للمخزون (بلومنجتون ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ديرك بوهمان ، كاتيا بروكنر وإيستفان أندو على مخزون الذباب والأجسام المضادة. نشكر ماريك جيندرا وكولين دونوهو على التعليقات على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة Sofja Kovalevskaja ل M.U. من مؤسسة Alexander von Humboldt ومشروع DFG UH243 / 1-1 إلى M.U. من مؤسسة الأبحاث الألمانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجارجيو & uuml; rzmü hle Brecht ، Eggenstein ، ألمانيا00262-0500وصفة طعام الذباب: تحضير 20 لترا من طعام الذباب مع 160 جرام أجار ، 360 جرام خميرة ، 200 جرام دقيق الصويا ، 1.6 كجم دقيق الذرة الصفراء ، 1.2 لتر من مستخلص الشعير ، 300 مل من شراب الذرة الخفيف ، 130 مل من حمض البروبيونيك و 200 مل من النيباجين 15٪. يجب طهي طعام الذباب لمدة 1 ساعة في 85 & nbsp ؛ درجة مئوية.
شراب الذرةGrafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG ، مكنهايم ، ألمانيا01939
حمض البروبيونيكCarl Roth GmbH ، كارلسروه ، ألمانيا6026.1
CornmealReformKontor GmbH ، Zarrentin ، ألمانيا4010155063948
مستخلص الشعيرCSM Deutschland GmbH ، بريمن ، ألمانيا728985
دقيق الصوياStockmeier Food GmbH ، هيرفورد ، ألمانيا1000246441010
خميرةWerner Ramspeck GmbH ، شواباخ ، ألمانيا210099K
ميثيل -4-بنزوات / نيباجينسيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانياH5501قم بإعداد محلول مخزون بنسبة 15٪ مع 70٪
قوارير طعام ذبابة الفاكهة EtOHKisker Biotech ، شتاينفورت ، ألمانيا789008
مقابس قارورةK-TK e.K. ، ريتزشتات ، ألمانيا1002
ذبابة الفاكهة زجاجات طعام ذبابةGreiner Bio-One ، Frickenhausen ، ألمانيا960177
سدادات الزجاجاتK-TK e.K. ، Retzstadt ، ألمانيا1002 S
Poly (كحول فينيل) 4-88 / [-CH2< / sub>CHOH-]n< / sub>Sigma-Aldrich ، Deisenhofen ، ألمانيا81381وصفة متوسطة التركيب: قم بإذابة 6 جم بولي (كحول فينيل) 4-88 في 39 & nbsp ؛ مل Millipore H2< / sub>O ، 6 مل 1 م تريس (درجة الحموضة 8.5) و 12.5 مل جلسرين. يقلب طوال الليل عند 50   ° C وأجهزة الطرد المركزي 20   دقيقة عند 5,000 دورة في الدقيقة. أضف DABCO إلى المادة الطافية للحصول على تركيز نهائي بنسبة 2.5٪. تخزين الحصص في -20  درجة مئوية.
1،4-ديازابيسيكلو[2.2.2]أوكتان/ DABCO سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانياD2522
Triton X-100Sigma-Aldrich ، Deisenhofen ، ألمانيا9002-93-1
محلول ملحي مخزن بالفوسفات / PBS137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار Na 2< / sub>HPO4< / sub> و 1.8 ملي مولار KH2< / sub>PO4< / sub> ، الرقم الهيدروجيني 7.4 في Millipore H2< / sub>O
PBST0.1٪ Triton X-100 في PBS
Paraformaldehyde / PFASigma-Aldrich ، Deisenhofen ، ألمانيا1581274٪ وصفة تثبيت PFA: إذابة 4 & nbsp ؛ ز PFA في 80 مل Millipore H2< / sub>O على لوحة محرك مغناطيسية مسخنة إلى 55   ؛ °C. أضف 1 M هيدروكسيد الصوديوم بالتنقيط حتى تذوب جميع جزيئات PFA. أضف 10 مل 10x PBS واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع 1 M HCl. امزج في 100 وميكرو ؛ ل Triton X-100 وملء مع Millipore H2< / sub>O إلى 100 مل. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية ، تجنب الذوبان المتكرر. (تنبيه: PFA شديد السمية. تحضير مثبت PFA في غطاء الدخان. ارتد جهاز تنفس وقفازات وملابس قائمة بذاتها. تجنب ملامسة الجلد أو العينين أو الأغشية المخاطية.)
ألبومين مصل الأبقار / BSASigma-Aldrich ، Deisenhofen ، ألمانياA3059وصفة محلول الحظر: قم بإذابة 0.3٪ BSA في PBST
الفلودين Invitrogen المسمى بالفلورسنت، كارلسروه ، ألمانيا ، المجسات الجزيئيةA12379 ، A22283 ، A22284محلول مخزون الفالويدين: قم بإذابة المسحوق (300 U) في 1.5 مل من الميثانول. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. للتلوين ، استخدم في التخفيف 1: 250 (A12379 ، A22283) و 1: 100 (A22284) في PBST.
4',6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid / DAPICarl Roth GmbH ، كارلسروه ، ألمانيا6335محلول تلطيخ DAPI: قم بإعداد محلول مخزون بمقدار 5 مجم / مل في Millipore H2< / sub>O وقم بتخزين الكميات عند 4 درجات مئوية.
الفأر المضاد للجسم المضاد H2Kurucz et al. ، 2003يستخدم في التخفيف 1: 500 في محلول الحجب
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L) JacksonImmunoResearch ، سوفولك ، المملكة المتحدة715-175-151يستخدم في التخفيف 1: 500 في محلول
الحجب Dumont # 5ملقط أدوات العلوم الدقيقة ، هايدلبرغ ، ألمانيا11295-10
طبق جنين زجاجي (30   ؛ مم)Thermo Scientific ، Schwerte ، ألمانياE90
إبر التنغستنأدوات العلوم الدقيقة ، هايدلبرغ ، ألمانيا10130-20
دبوس مطلي بالنيكلأدوات العلوم الدقيقة ، هايدلبرغ ، ألمانيا26018-17
شرائح مجهرVWR ، دارمشتات ، ألمانيا631-1553
أغطية 22 × 22 مم (# 1 Menzel-Gl & auml ؛ ser)VWR ، دارمشتات ، ألمانيا631-1336
أغطية 24 × 50 مم (0.13-0.16   ؛ مم)Thermo Scientific ، Schwerte ، ألمانيا1076371
Kimtech Science Precision مناديل مبللةThermo Scientific ، Schwerte ، ألمانيا06-677-70
تشريح المجهر المجسمأوليمبوس ، هامبورغ ، ألمانياSZX7 (DF PLAPO 1X-4 اليابان)
المجهر المجسم الفلوريأوليمبوس ، هامبورغ ، ألمانياSZX16 (SDF PLAPO 0.8X اليابان) مع كاميراDP72 CCDمجهزة بمجموعة مرشح ممر النطاق الأزرق الضيق لإثارة GFP الفلوروكرومات الزرقاء الأخرى القابلة للإثارة (مرشح الإثارة BP460-480 نانومتر ، مرشح الحاجز BA495-540 نانومتر) ومرشح حاجز الإثارة الخضراء الضيقة ومرشح حاجز التمرير الطويل ل RFP وغيرها من الفلوروكرومات الخضراء القابلة للإثارة (مرشح الإثارة BP530-550 ، مرشح الحاجز BA575IF). البرنامج: Olympus cellSens Standard 1.11.
مجهر متحد البؤرأوليمبوس ، هامبورغ ، ألمانياFV1000مزود بمجهر IX81 مقلوب. الأهداف: 20 & مرات ؛ UPlan S-Apo (NA 0.85) ، 40 & مرات ؛ UPlanFL (NA 1.30) و 60 & مرة ؛ UPlanApo (NA 1.35). الليزر: ليزر الأشعة فوق البنفسجية LD405 (50   ميغاواط) ، ليزر الأرجون ، متعدد الخطوط 457 / (476) / 488/515 (40   ؛ ميغاواط) ، الصمام الثنائي ليزر الأصفر / الأخضر LD560 (15   ؛ mW) و Red Laser Diod 635 (20   ميغاواط). البرنامج: Fluoview 2.1c Software
ذبابة الفاكهة حاضنة مبردةEwald Innovationstechnik GmbH ، باد نيندورف ، ألمانيا  ؛ Sanyo MIR553
زجاجة بخVWR ، دارمشتات ، ألمانيا215-8105
BD Clay Adams Nutator MixerVWR ، دارمشتات ، ألمانيا15172-203
ELMI Digital Rocking ShakerVWR ، دارمشتات ، ألمانياDRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis ReagentVWR ، دارمشتات ، ألمانيا2302700البروتوكول متوافق مع الكواشف الأخرى المستندة إلى TRIzol ، على سبيل المثال < / em> ، TRIreagent من Sigma (Cat. رقم T9424) ، كاشف TRIzol من Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
ثنائي إيثيل بيروكربونات / DEPCسيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانياD5758مخفف DEPC 1: 1،000 في Millipore H2< / sub>O ، يقلب طوال الليل والأوتوكلاف.
UltraPure Phenol: الكلوروفورم: كحول Isoamyl (25: 24: 1)ThermoFischer Scientific ، Invitrogen ، Karlsruhe ، ألمانيا15593-031
ChloroformMerck ، دارمشتات ، ألمانيا102445
TURBO DNase (2 U/µ ؛ ل)Thermo Scientific ، Schwerte ، ألمانياAM2238
Invitrogen UltraPure GlycogenThermoFischer Scientific ، Invitrogen ، Karlsruhe ، ألمانيا10-814-010
أسيتات الصوديوم ثلاثي هيدراتVWR ، دارمشتات ، ألمانيا27652.232قم بإعداد محلول أسيتات الصوديوم 3 M مع DEPC-H2< / sub>O واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.2
2-PropanolMerck ، دارمشتات ، ألمانيا109634
الإيثانولميرك ، دارمشتات ، ألمانيا100983إعداد تخفيف EtOH بنسبة 75٪ باستخدام DEPC-H2< / sub>O.
الأشعة فوق البنفسجية / Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000Thermo Scientific ، Schwerte ، ألمانياND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (مبردة)Thermo Scientific ، Schwerte ، ألمانيا5417R
Experion RNA StdSens Analysis KitBio-Rad Laboratories GmbH ، M & uuml ؛ nchen ، ألمانيا7007103
Experion Automated Electrophoreses StationBio-Rad Laboratories GmbH ، M & uuml ؛ nchen ، ألمانيا7007010
SuperScript III Reverse TranscriptaseThermo Scientific ، Schwerte ، ألمانيا18080044
Oligo d (T) PrimerIntegrated DNA Technologies ، لوفين ، بلجيكاتعد 100 & micro ؛ حلول مخزون M في DEPC-H2O وتخزينها عند -20 درجة ؛ C
dNTP خليطTakara Bio Europe / Clonetech ، Saint-Germain-en-Laye ، فرنسا4030تخزين كميات كبيرة من 25 & ل عند -20 درجة ؛ C
CFX96 Touch Real-Time Detection PCR SystemBio-Rad Laboratories GmbH ، M & uuml ؛ nchen ، ألمانيا1855195
iQ SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories GmbH ، M & uuml ؛ nchen ، ألمانيا170-8882
ألواح PCR ذات القشرة الصلبة 96 بئر ، جدار رقيقBio-Rad Laboratories GmbH ، M & uuml ؛ nchen ، ألمانياHSP9601
Microseal 'B' FilmBio-Rad Laboratories GmbH ، Mü ؛ nchen ، ألمانياMSB1001
rp49< / em> Forward primerIntegrated DNA Technologies ، لوفين ، بلجيكا5 'TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49< / em> التمهيدي العكسيتقنيات الحمض النووي المتكاملة ، لوفين ، بلجيكا5 'CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1< / em> تقنيات الحمض النووي المتكاملةإلى الأمام ، لوفين ، بلجيكا5 'AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1< / em> التمهيدي العكسيتقنيات الحمض النووي المتكاملة ، لوفين ، بلجيكا5 'ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'
حامل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
  2. Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
  3. Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
  4. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  6. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  7. Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
  8. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  9. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  10. Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
  11. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
  12. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
  13. Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).
  14. Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
  15. Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
  16. Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
  17. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  18. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
  19. Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
  20. Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
  21. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  22. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  23. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
  24. Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
  25. Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
  26. Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063(2012).
  27. Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  28. Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
  29. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  30. Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
  31. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
  32. Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
  33. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
  34. Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
  35. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  36. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  37. Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
  38. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
  41. Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
  42. Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).
  43. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  44. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila Imaginal DiscGenetic MosaicsMARCM TechniqueFluorescent MicroscopyConfocal ImagingRNA IsolationTumor InvasivenessJNK SignalingHemocyte InfiltrationMMP1 Expression

مقالات ذات صلة