مقالة منهجية

تطبيقات pHluorin لالكمي، الحركية وعالية الإنتاجية تحليل الإلتقام في مهدها الخميرة

DOI:

10.3791/54587

⸱

أكتوبر 23, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
غالبا ما يوفر >jove_content<القياس الكمي الدقيق لأحداث الاتجار الحويصلي بنتائج تحليلات رئيسية حول أدوار بروتينات معينة وتأثيرات الطفرات. تقدم هذه الورقة طرقا لاستخدام pHluorin الفائق ، وهو متغير GFP حساس للأس الهيدروجيني ، كأداة للقياس الكمي للأحداث الداخلية في الخلايا الحية باستخدام المجهر الفلوري الكمي وقياس التدفق الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأخضر بروتين فلوري (GFP) ومشتقاته وتستخدم على نطاق واسع أدوات لدراسة توطين البروتين وديناميكية الأحداث مثل إعادة هيكل الخلية والاتجار حويصلي في الخلايا الحية. وقد تم تطوير منهجيات الكمية باستخدام اندماج GFP خيالية للعديد من التطبيقات؛ ومع ذلك، GFP إلى حد ما على مقاومة التحلل البروتيني، وبالتالي استمرار مضان لها في يحلول / فجوة، والتي يمكن أن تعوق الكمي الاتجار البضائع في مسار التقامي. طريقة بديلة لقياس الإلتقام وبعد التقامي الأحداث الاتجار يجعل من استخدام superecliptic pHluorin، وهو البديل الحساسة درجة الحموضة من GFP أن تطفأ في البيئات الحمضية. الانصهار خيالية من pHluorin إلى ذيل حشوية من البضائع عبر الغشاء البروتينات النتائج في الملطف من مضان عند التأسيس من البضائع إلى الهيئات عديد الحويصلات (MVBs) ونقلهم إلى لمعة يحلول / فجوة. وهكذا، تبريد مضان فجوي يسهل quantifiالموجبة الإلتقام والأحداث في وقت مبكر في مسار التقامي. وتصف هذه الورقة طرق استخدام الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin لتقدير حجم الإلتقام عبر المجهر مضان، وكذلك فحوصات على أساس السكان باستخدام التدفق الخلوي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاتجار حويصلي يلعب دورا هاما في الحفاظ على الهوية عضية وظيفة في الخلايا حقيقية النواة، وهو الآلية الرئيسية لتنظيم البروتين وغشاء تكوين الأجزاء الخلوية الفردية. في غشاء البلازما، والانصهار من الحويصلات exocytic يسلم البروتينات والأغشية جديدة إلى سطح الخلية، في حين الحويصلات الناتجة من خلال الإلتقام إزالة غشاء والبروتينات من سطح لإعادة التدوير لاحق أو استهداف لليحلول. وهكذا، الإلتقام مهم لامتصاص المواد الغذائية والردود على البيئة خارج الخلية. ومتوازنة إيماس والإلتقام لتنظيم مساحة غشاء البلازما، والسماح للدوران من البروتينات التالفة.

وقد حددت الدراسات في الخميرة وخلايا الثدييات عدد كبير من البروتينات المشاركة في الإلتقام، فضلا عن عدة مسارات التقامي التي تعزز استيعاب الشحنات محددة أو هذا الفعل ردا على مجموعة متنوعة من ENشروط vironmental. مسار أفضل درس هو بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME)، الذي بالكلاذرين والاكسسوار عصاري خلوي البروتينات التجمع في بنية معطف لتحقيق الاستقرار في الحويصلة التقامي الوليدة. وقد أسفرت التجارب في مهدها خميرة خميرة الأفكار الرئيسية في ديناميات والنظام التجنيد للعديد من البروتينات التقامي 1-3. والجدير بالذكر أن آلية التعليم الطبي المستمر وحفظها للغاية من خلال تطور من هذا القبيل أن الغالبية العظمى من البروتينات المرتبطة التعليم الطبي المستمر في الخميرة لها orthologs الإنسان؛ وبالتالي، فقد كان في مهدها الخميرة أداة مهمة لفهم آليات الإلتقام أن يتم حفظها في حقيقيات النوى أعلى. على سبيل المثال، الدراسات التي تستخدم في مهدها الخميرة قرر أن تشكيل ونضوج هياكل التعليم الطبي المستمر (المشار إليها بقع الأكتين كما القشرية في الخميرة) ينطوي على تجنيد متتابعة من العديد من البروتينات، بدءا بالكلاذرين والبروتينات محول ملزم البضائع، تليها توظيف ملحق التقامي إضافية البروتينات،تفعيل بلمرة الأكتين بوساطة 3 Arp2 /، وتوظيف البروتينات المشاركة في 1،2 حويصلة انفصال. توظيف البروتينات الآلات التعليم الطبي المستمر لالقشرية بقع الأكتين هو عملية أمر غاية والنمطية، ولقد تم إنشاء نظام دقيق للتجنيد بالنسبة للعديد من البروتينات فيما يتعلق المكونات الأخرى للجهاز التعليم الطبي المستمر. الأهم من ذلك، وقد أكدت الدراسات الحديثة وجود أمر مماثل التوظيف للبروتينات التعليم الطبي المستمر في حفر المغلفة بالكلاذرين في خلايا الثدييات 4.

بالإضافة إلى التعليم الطبي المستمر، والعديد من أنواع الخلايا تمتلك واحدة أو أكثر التقامي (CIE) مسارات مستقلة بالكلاذرين التي تعتمد على آليات بديلة لتعزيز تشكيل الحويصلة واستيعاب من غشاء البلازما 5-7. في الخميرة، حددنا مؤخرا طريقا CIE التي تستخدم صغيرة GTPase Rho1 وتفعيل جوانين لها عامل الصرف النوكليوتيدات (GEF)، ROM1 8،9. Rho1 ينشط formin Bni1 لتعزيز الأكتين البلمرة 10،11، وهو مطلوب لهذا النوع من الإلتقام مستقلة بالكلاذرين في الخميرة 12. وعلاوة على ذلك، فإن الأسرة α arrestin من البروتينات توظيف يغاز اليوبيكويتين Rsp5 لتعزيز ubiquitination البضائع واستيعاب لاحق من خلال التعليم الطبي المستمر 13-17، وأيضا تعزيز استيعاب البضائع عبر مسار CIE، ربما من خلال التفاعل المباشر مع البروتينات المشاركة في CIE 18. مجموعة متنوعة من مسارات CIE توجد أيضا في خلايا الثدييات، بما في ذلك مسارات مستقلة بالكلاذرين وأكلة التي تعتمد على ortholog Rho1، RhoA 9،19. يساء فهمها دور RhoA في الثدييات CIE. وبالتالي، دراسات في مهدها الخميرة قد توفر رؤى الآلية الإضافية التي تنطبق على CIE الثدييات.

تقدير دقيق للأحداث التقامي يمكن أن توفر معلومات هامة حول دور بروتينات معينة في تنظيم الإلتقام، ويمكن أن تكشف عن آثار الطفرات على استيعاب البضائع أو بروجرسيون من خلال مسار التقامي. لهذا الغرض، ويمكن استخدام طرق البيوكيميائية لمراقبة امتصاص يجند أو لقياس معدلات تدهور البروتينات البضائع التقامي. في الخلايا الحية، مزيج من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ومشتقاته إلى الشحنات من الفائدة يسمح التصور المباشر لنقل البضائع. ومع ذلك، الشحنات GFP الموسومة ذات الاستخدام المحدود للالكمي من الإلتقام لأن GFP مقاوم للتحلل في يحلول (أو فجوة في الخميرة). وعلاوة على ذلك، GFP مضان ليست سوى حساسة جزئيا إلى التغيرات في الرقم الهيدروجيني، ويبقى اكتشافها داخل تجويف تجويف 20،21. ونتيجة لذلك، مضان من العلامة GFP استمر في فجوة بعد فترة طويلة قد تدهورت ما تبقى من البضائع، وكله الكمي القائم على خلية من كثافة الشحنة قد تكون غير دقيقة بسبب مضان GFP على المدى الطويل في فجوة.

من أجل التغلب على عيوب مضان فجوي GFP، التي قطعناها على أنفسنا قبل استخدام الرقم الهيدروجيني supereclipticluorin، وهو البديل الحساسة درجة الحموضة من GFP تتفلور الزاهية في الرقم الهيدروجيني محايدة، ولكن يفقد مضان في البيئات الحمضية مثل تجويف تجويف / يحلول 20،22،23. وضع علامة pHluorin على الذيل حشوية من الشحنات التقامي يسمح التصور من الشحنات في غشاء البلازما وعلى الإندوسومات في وقت مبكر، حيث لا يزال علامة pHluorin يتعرض إلى السيتوبلازم (الشكل 1A). كما الإندوسومات في وقت مبكر ناضجة، المطلوبة لحزم النقل (ESCRT) الأجهزة الشحنات مترجمة السطح إلى الحويصلات التي برعم في تجويف الاندوسوم endosomal الفرز المعقدة، وتوليد الهيئات عديد الحويصلات (MVBs) 24. لالشحنات التي تم إدراجها في الحويصلات MVB الداخلية، العلامة pHluorin تواجه نحو تجويف الحويصلة. ويحمض الحويصلات MVB الداخلية؛ وبالتالي، تفقد الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin مضان على الإندوسومات في وقت مبكر لأنها تنضج في MVBs 20. الانصهار لاحق من MVB مع فجوة يسلم محتويات MVB اللمعيةللتدهور، والعلامات وpHluorin تبقى مروي في البيئة الحامضية للالتجويف فجوة.

تقدم هذه الورقة وصفا تفصيليا لفحوصات التقامي الكمية باستخدام الشحنات مع به pHluorin هيولي في الخميرة. سلالات التعبير عن الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin ويمكن استخدامها في المقايسات الحركية و / أو نقطة النهاية، وهذا يتوقف على سلوك خصائص والاتجار في البضائع محددة. وبالإضافة إلى ذلك، بعض الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin-قابلة للطرق التحليل الإنتاجية العالية، بما في ذلك التدفق الخلوي. الأهم من ذلك، العلامة pHluorin هو أداة مرنة لدراسة الأحداث التقامي في الخلايا الحية، مما يسمح الكمي لالإلتقام والمقارنة وظيفة التقامي في البرية من نوع وسلالات متحولة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. حلول والإعلام

  1. إعداد ما يلي الأرصدة والإعلام ولوحات:
    1. لإعداد 10X YNB، حل 67 غرام من الخميرة قاعدة النيتروجين تفتقر إلى الأحماض الأمينية في 1 لتر من الماء. تعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرون النيتروسليلوز.
    2. إعداد المتوسطة YNB باستخدام 1X YNB (من 10X الأسهم) مع 2٪ سكر العنب (من معقمة 50٪ ث / الأسهم ت) وخليط 1X الأحماض الأمينية / المغذيات (من 100X الأسهم، راجع الخطوة 1.1.4). لاختيار البلازميد، حذف الأحماض الأمينية الفردية أو العناصر الغذائية حسب الحاجة. لتحريض التعبير Mup1، بالإضافة إلى حذف ميثيونين من خليط الأحماض الأمينية / المغذيات.
    3. إعداد لوحات YNB باستخدام 1X YNB (من 10X الأسهم)، 2٪ سكر العنب (من معقمة 50٪ ث / الأسهم الخامس)، 0.7 غرام / لتر الأحماض الأمينية / المغذيات خليط (راجع الخطوة 1.1.5) و 2.5٪ أجار. إعداد لوحة المتوسط ​​عن طريق التعقيم 25 غراما من أجار و 0.7 غرام من خليط الأمينية حمض / المغذيات في 860 مل من الماء. يسمح هذا المزيج ليبرد إلى 55 درجة مئوية، ثم يضاف 100 مل من 10X YNB و 40 مل سو 50٪ جلوكوز. صب لوحات (حوالي 30 مل من المتوسط ​​في صحن 10 سم)، والسماح على المديين المتوسط ​​ويصلب في درجة حرارة الغرفة، وألواح تخزينها في 4 درجات مئوية.
    4. إعداد 100X حل الأحماض الأمينية / الأسهم المغذيات (المتوسطة السائل) عن طريق إذابة التالية في 100 مل من الماء منزوع الأيونات: 0.1 ز L-ميثيونين، 0.3 غرام لكل من L-ليسين ولام، ليسين، و 0.2 غرام لكل من L-الحامض الاميني (قد يتم تضمين الأحماض الأمينية والمواد المغذية الأخرى حسب الحاجة لسلالات معينة)، تريبتوفان، الأدينين واليوراسيل. استخدام الحرارة لطيف إذا لزم الأمر إلى حل، وتعقيم من خلال مرشح 0.45 ميكرون النيتروسليلوز. تخزين في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. لاختيار البلازميد، وإعداد الحلول الأسهم التي تفتقر إلى عناصر محددة حسب الحاجة.
    5. إعداد الأحماض الأمينية / خليط المواد الغذائية (لوحات) عن طريق الجمع بين ما يلي: 0.5 غرام من الأدنين، 4 غرام من L-ليسين، و 2 غرام لكل من L-الحامض الاميني، L، ليسين، L-ميثيونين، ل تريبتوفان، L- التيروزين واليوراسيل. طحن مع هاون ومدقة، وتخزينها مع المواليةاحلماية من الضوء. لاختيار البلازميد، وإعداد الخلائط التي تفتقر إلى عناصر محددة حسب الحاجة، واستخدام 0.7 غرام من خليط من الأحماض الأمينية للتر الواحد من المتوسطة لوحة (راجع الخطوة 1.1.3).
  2. إعداد الشرائح غرفة 8-جيدا للفحص المجهري بواسطة طلاء سطح الشريحة مع كونكانافالين ألف (كونا). إلى كل بئر من الشريحة غرفة، إضافة 25 ميكرولتر من 2 ملغ / مل كونا المذاب في الماء. باستخدام طرف ماصة، وانتشار كونا عبر السطح السفلي من البئر، ثم السماح الشريحة في الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 4-8 على الأقل ساعة. من الناحية المثالية، واستخدام الشرائح غرفة خلال 24 ساعة من كونا الطلاء.
  3. توليد سلالات الخميرة مع اندماج في إطار GFP أو pHluorin إلى البضائع التقامي الاهتمام باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) طريقة التكامل المستندة إلى وصفها في Longtine وآخرون. وغولدشتاين ومكسكر 25،26.
    ملاحظة: البلازميدات تحتوي على pHluorin علامات الأشرطة مع الجينات المقاومة لكانامايسين (KANMX6) وnourseothricin ( NATMX4) سابقا 20.
    1. تضخيم GFP أو pHluorin الأشرطة التي تحتوي على علامات اختيار مع الاشعال تحتوي على تسلسل إضافية محددة لموقع التكامل الجيني 20،25.
    2. تحويل منتج PCR مما أدى إلى سلالة الخميرة المطلوب باستخدام الليثيوم طريقة خلات 27.
    3. حدد لدمج الكاسيت من خلال زراعة الخلايا على لوحات YPD التي تحتوي على المخدرات المناسبة. لإعداد لوحات، الأوتوكلاف 10 ز خلاصة الخميرة، و 20 غراما ببتون، 0.1 غرام التربتوفان و 25 غراما أجار في 960 مل من الماء. قبل صب لوحات، والسماح للخليط لتبرد إلى 55 درجة مئوية، ثم إضافة 40 مل من الجلوكوز 50٪ وإما G418 إلى التركيز النهائي من 200 ميكروغرام / مل لاختيار KANMX6، أو nourseothricin إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل ل اختيار NATMX4.
    4. تأكيد تكامل GFP أو علامة pHluorin في المستعمرات الفردية عن طريق PCR و / أو النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP،وكذلك من خلال الكشف عن البروتين تصفها مضان المجهر 20.
      ملاحظة: سلالات الخميرة محددة والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة هي مدرجة في الجدولين 1 و 2 على التوالي.

2. نقطة النهاية الفحص لالإسفار ثابت للدولة بشكل جوهري المنضوية التقامي البضائع

  1. تطعيم الخلايا (~ 3 مستعمرات صغيرة) في 5 مل من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية أو العناصر الغذائية على النحو المطلوب لصيانة بلازميد (إن وجدت). تنمو الخلايا لمدة 16-24 ساعة في حاضنة تهتز المدارية عند 30 درجة مئوية، مع 250 دورة في الدقيقة تهتز. بدلا من ذلك، خط ل~ مستعمرة مم 1-2 الخلايا على طبق من ذهب YNB تفتقر إلى الأحماض الأمينية أو العناصر الغذائية لاختيار البلازميد، وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  2. قياس كثافة (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. إعداد التخفيف 5 مل في ،35-،4 OD 600 / مل في YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية أو العناصر الغذائية لجيش التحرير الشعبى الصينىصيانة SMID، وتنمو لمدة ما يقرب من 3 ساعات في 30 درجة مئوية مع الهز. إذا يشوبه باستخدام الخلايا على طبق من ذهب، تخطي هذه الخطوة والمضي قدما في خطوة 2.4 (أنظر أدناه).
  3. قياس كثافة (OD 600) من الخلايا، التي ينبغي أن تكون الآن بين 0،6-1،0 OD 600 / مل. نقل 1.5 مل من ثقافة إلى أنبوب microfuge، والخلايا بيليه في 8000 دورة في الدقيقة (6،800 x ج) لمدة 2 دقيقة. إزالة 1475 ميكرولتر من طاف.
  4. جلب الخلايا إلى مضان المجهر. قبل تصوير كل عينة، وإعداد الشرائح عن طريق إعادة التعليق الخلايا في المتوسط ​​المتبقية، وجبل 3 ميكرولتر من تعليق خلية تحت زلة غطاء. بدلا من ذلك، وإعداد الشرائح غرفة 8-جيدا كما هو موضح أدناه في بروتوكول 3، وذلك باستخدام المتوسطة YNB بما يتناسب مع اختيار البلازميد. من الناحية المثالية، خلايا صورة مع 100X، 1.4 أو أعلى الفتحة العددية (NA) الغمر النفط عدسة الهدف، وكاميرا 12- أو 16 بت، والمرشحات الإثارة / الانبعاثات الأمثل لمضان GFP.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم الخلايا المزروعة عن طريق تسليط الضوء على سنا لوحة، وإعداد الشريحة من خلال وضع 3 ميكرولتر من المتوسطة YNB جديدة على زلة غطاء. باستخدام طرف ماصة، وجمع مستعمرة صغيرة من الخلايا من لوحة، وتفريق الخلايا في المتوسط ​​YNB، وجبل تعليق الناتجة على شريحة زجاجية مباشرة قبل التصوير.
  5. الصورة 4-6 حقول عشوائية من الخلايا لكل حالة، وذلك باستخدام المعلمات نفس اقتناء (أي مجموعات مرشح وزمن التعرض) لجميع الصور داخل التجربة.
    ملاحظة: يمكن جمع وbrightfield أو صورة مدينة دبي للإنترنت لكل حقل يكون من المفيد للخلايا حيث تطفأ إشارة pHluorin في MVB ومقصورات فجوي.
  6. قياس كثافة مضان من 30-50 خلايا على الاقل لكل حالة (انظر بروتوكول 5).

3. الحركية الفحص لالكمي لالإلتقام من الشحنات التي تخضع للرقابة الإلتقام

  1. تطعيم 2-3 مستعمرات خلايا الخميرة (حوالي 2 مم في القطر في مستعمرة) في 5 مل من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى ميثيونين وإضافةالأحماض الأمينية itional أو المواد الغذائية للحفاظ على اختيار البلازميد. تنمو الثقافات ل16-24 ساعة عند 30 درجة مئوية مع الهز.
    ملاحظة: في هذه الورقة، وبروتوكولات لدراسة تنظيم البروتينات البضائع التقامي الاستفادة من بيرمياز ميثيونين، Mup1. الشحنات الأخرى التي تخضع لالإلتقام المنظم هي أيضا مناسبة لوضع علامات مع pHluorin (على سبيل المثال، واليوراسيل بيرمياز Fur4، الذي يتراكم في غشاء البلازما في غياب اليوراسيل، ويذوت ردا على تطبيقها خارجيا اليوراسيل)؛ لهذه الشحنات، يجب أن يتم تعديل الأوضاع وسائل الإعلام لتعكس الظروف المحددة التعبير، تحريض واستيعاب لهذه البضائع.
  2. قياس كثافة (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها تقريبا 3 ساعات قبل التصوير. إعداد التخفيف 5 مل في ،35-،4 OD 600 / مل في YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية الميثيونين والإضافي أو المواد الغذائية لصيانة البلازميد، وتنمو حتى 30 درجة مئوية مع الهز.
  3. قبل تتوازن ميكروالتعامل الغرفة البيئية أو مرحلة ساخنة (إن وجد) إلى 30 درجة مئوية خلال الحضانة 3 ساعات من الخطوة 3.2.
  4. نقل 1 مل من ثقافة الخلية إلى أنبوب microfuge، والخلايا بيليه في 8000 دورة في الدقيقة (6،800 x ج) لمدة 2 دقيقة. إزالة 975 ميكرولتر من طاف.
  5. إعداد تعامل كونا، 8 جيدا القاع الزجاجي شريحة غرفة للتصوير (بروتوكول 1.2).
  6. إضافة 200 ميكرولتر من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية الميثيونين والإضافي أو المواد الغذائية لاختيار البلازميد كل بئر. Resuspend وبيليه الخلية من الخطوة 3.4 في طاف المتبقية، وإسقاط 2.5 ميكرولتر من تعليق خلية في وسط كل بئر. تفريق الخلايا عبر سطح البئر من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وتسمح للخلايا ليستقر لمدة 5-10 دقائق.
  7. ضع الشريحة الغرفة على مجهر مضان مقلوب معايرتها إلى 30 درجة مئوية (راجع الخطوة 3.3). تحديد حقل من الخلايا باستخدام brightfield الإضاءة.
  8. إضافة 50 ميكرولتر من YNB متوسطة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل ميثيونين(قبل تحسنت إلى 30 درجة مئوية) إلى 200 ميكرولتر من المتوسط ​​في البئر للحصول على تركيز ميثيونين النهائي من 20 ميكروغرام / مل. تجنب تعطيل المتوسطة في البئر من أجل منع الخلايا من العائمة من القاع.
  9. السماح للخلايا لكي تتوازن لمدة 2 دقيقة قبل البدء في التصوير. على الفور قبل التقاط الصورة الأولى، وضبط المجهر لطائرة التنسيق المطلوب (عادة طائرة التنسيق الاستوائية يعمل بشكل أفضل).
  10. الحصول على صور GFP وbrightfield (أو DIC) في 5 فترات دقيقة عن 45-60 دقيقة، وذلك باستخدام المعلمات الاستحواذ متطابقة لجميع الصور ضمن سلسلة زمنية (على سبيل المثال، 100X 1.4 NA الهدف غمر النفط و 500 اكتساب الوقت مللي ثانية باستخدام فلتر GFP، 100 اكتساب الوقت مللي ثانية باستخدام فلتر DIC).
    ملاحظة: إذا مرحلة المجهر والتصوير البرامج لا تسمح للتصحيح التلقائي للانحراف طائرة الوصل، فإنه قد يكون من الضروري إعادة ضبط التركيز قبل كل نقطة زمنية التصوير يدويا. وعلاوة على ذلك، سوف مدة التحصيلتختلف بين المجاهر بسبب الاختلافات في الإضاءة والمرشحات، وينبغي تحديد الظروف المثلى مسبق يدويا لبدء التجربة. إذا تم استخدام البضائع التقامي أخرى من Mup1، قد يكون من الضروري تعديل اكتساب الوقت والتصوير فترات، فضلا عن مدة التجربة، لتعكس حركية استيعاب تلك البضائع.
  11. قياس كثافة مضان من الخلايا الفردية في كل نقطة زمنية (انظر بروتوكول 5)، والتعبير عن القيم كنسبة مئوية من شدة الأولية للصورة الأولى.

4. نقطة النهاية الفحص لالكمي لالتقامي الشحنات التي تخضع للرقابة الإلتقام

  1. إعداد الخلايا للتصوير كما هو موضح في البروتوكول 3 (الخطوات 3.1 خلال 3.6).
  2. الصورة 4-5 حقول عشوائية من الخلايا لكل حالة على الفور قبل إضافة الميثيونين، وذلك باستخدام brightfield ومرشح GFP مجموعات.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من YNB متوسطة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل ميثيونين (ما قبل الحربميد إلى 30 درجة مئوية) إلى 200 ميكرولتر من المتوسط ​​في البئر للحصول على تركيز ميثيونين النهائي من 20 ميكروغرام / مل. تجنب تعطيل المتوسطة في البئر من أجل منع الخلايا من العائمة من القاع.
  4. الصورة 4-5 حقول عشوائية من الخلايا 30 دقيقة بعد إضافة الميثيونين، وذلك باستخدام نفس المعلمات الحيازة وفقا لنقطة زمنية 0 دقيقة (الخطوة 4.2).
  5. قياس كثافة مضان من 30-50 خلايا على الاقل لكل نقطة زمنية (انظر بروتوكول 5). قيم صريحة كنسبة مئوية من Mup1-pHluorin المنضوية بعد 30 دقيقة باستخدام المعادلة التالية: [أن يعني كثافة في 0 دقيقة - يعني كثافة في 30 دقيقة] / [متوسط ​​كثافة في 0 دقيقة] × 100٪.
    ملاحظة: من الممكن إجراء في وقت واحد ما يصل الى ثمانية نقاط النهاية المقايسات التي كتبها مذهلة وقت بدء كل فحص ويقدم الجدول 3 سير عمل المثال لمدة ثمانية فحوصات في وقت واحد.

5. بعد اكتساب تحليل

  1. تصدير الصور من برنامج الحصول على أنها 16-بت تنسيق ملف الموسومة صورة (. TIF أو تنسيق TIFF.).
    ملاحظة: قد يكون تنسيقات الملفات الأخرى أيضا مناسبة، وينبغي من الناحية المثالية تستخدم خوارزميات ضغط ضياع. الصور 8 بت هي عموما ليست مناسبة لأغراض القياس الكمي.
  2. فتح الملفات باستخدام برنامج ImageJ (متاحة بحرية الخيار 'فتح' في في القائمة 'ملف'. استخدم صورة مضان لتقدير، وbrightfield / صورة مدينة دبي للإنترنت كمرجع لتحديد موقع الخلايا وشاملة جميع الخلايا الميتة (إذا كان موجودا )، والتي تظهر أكثر قتامة من الخلايا الحية عندما ينظر إليها من قبل مدينة دبي للإنترنت وautofluorescent عندما ينظر اليها مع المرشحات GFP الإثارة / الانبعاثات.
  3. إجراء خلفية الطرح على الصورة مضان. للصور مع إشارة الخلفية متفاوتة، استخدام 'خلفية الطرح "خوارزمية العثور عليها في" القائمة العملية ". استخدام الإعداد الافتراضي (المتداول الكرة دائرة نصف قطرها 50 بكسل)، وهو ما يكفي عادة لأغراض القياس الكمي.
    ملاحظة: إن backgro البديليوصف أسلوب الطرح اوند للصور مع خلفية موحدة في خطوة 5.3.1.-5.3.2. ومع ذلك، يعمل الأسلوب أعلاه أيضا عن خلفية موحدة.
    1. للصور مع خلفية موحدة (أي شدة خلفية ثابتة تقريبا في جميع الحواف وفي وسط الصورة)، إجراء خلفية الطرح اليدوي. انقر على زر "التحديدات مرفوعة" وجدت في نافذة يماغيج الرئيسي، وحدد 3-5 المناطق العشوائية داخل الصورة التي لا تحتوي على خلايا.
    2. فتح وظيفة 'مجموعة القياسات "الموجود في قائمة" تحليل "، حدد المعلمة" يعني رمادي القيمة، وقياس قيم الكثافة باستخدام وظيفة "قياس" (كما وجدت في القائمة' تحليل '). حساب متوسط ​​قيمة من المناطق قياس 3-5، وطرح من جميع القياسات اللاحقة في هذه الصورة.
  4. لالكمي من المقايسات الحركية (بروتوكول 3)، تولد، صورة واحدة مكدسة لتيمسلسلة ه. فتح الصور مضان من كل نقطة زمنية في الترتيب الزمني، وتوليد كومة باستخدام "الصور إلى كومة 'وظيفة (وجدت في القائمة" صورة "، تحت القائمة الفرعية الأكوام).
  5. الخطوط العريضة لخلية باستخدام أداة التحديد اليدوي، مع التأكد من تضمين الخلية بأكملها ولكن المنطقة كما تذكر خارج الخلية ممكن.
  6. قياس المعلمات التالية: "المنطقة، الكثافة المتكاملة" و "متوسط ​​رمادي القيمة. حدد المعلمات باستخدام وظيفة "تعيين القياسات"، وتقع في القائمة 'تحليل'.
    ملاحظة: المتكاملة كثافة يتوافق مع مجموع كل شدة بكسل داخل المنطقة المحددة، ومتوسط ​​رمادي القيمة يتوافق مع [المتكاملة الكثافة / المنطقة]، الذي يصحح قيم الكثافة لحجم الخلية.
  7. فتح "مدير العائد على الاستثمار" الموجود في قائمة "تحليل"، تحت القائمة الفرعية لل'أدوات'. في إطار إدارة العائد على الاستثمار، انقر فوق الزر 'إضافة' لدخول رجو الضوءن كمنطقة جديدة من الاهتمام (ROI).
  8. كرر الخطوات من 5.4 خلال 5.6 للحصول على الخلايا المتبقية في الصورة. استبعاد أي خلايا ميتة وفقا لتقييم brightfield / مدينة دبي للإنترنت ومضان (الخلايا الميتة تبدو أغمق في صور مدينة دبي للإنترنت، ويكون إشارة هيولي autofluorescent عندما ينظر اليها مع GFP الإثارة / الانبعاثات؛ انظر الشكل 2F)، وأي الخلايا التي تلمس حافة الصورة. حفظ رويس المحددة كملف الرمز البريدي عن طريق النقر على زر "المزيد" في نافذة "مدير العائد على الاستثمار، وتصدير جميع القياسات إلى جدول بيانات أو برامج التحليل الإحصائي.
  9. لالكمي من المقايسات الحركية (بروتوكول 3)، الخطوط العريضة وقياس خلية من نقطة زمنية الأولية كما هو موضح في الخطوات 5.4 و 5.5. استخدام نفس العائد على الاستثمار لقياس كل نقطة زمنية لاحقة في التجربة.
  10. لفحوصات نقطة النهاية (بروتوكولات 2 و 4)، وقياس ما لا يقل عن 30-50 خلايا لكل حالة. أداء الكمي لمدة 2-3 على الأقل الصور، وتشمل جميع الخلايا في كلالصورة التي تلبي المعايير المحددة في الخطوة 5.8 في التحليل.
  11. تقييم دلالة إحصائية بين العينات باستخدام في اتجاه واحد أنوفا، تليها التجارب المقارنة متعددة توكي للالتحليل اللاحق.

6. تحليل السكان من Mup1-pHluorin الإلتقام بواسطة التدفق الخلوي

  1. تطعيم 2-3 مستعمرات خلايا الخميرة (حوالي 2 مم في القطر في مستعمرة) في 0.5 مل من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى ميثيونين والأحماض الأمينية إضافية أو المواد الغذائية للحفاظ على اختيار البلازميد. زراعة خلايا في 5 مل أنابيب جولة القاع ل16-24 ساعة عند 30 درجة مئوية على طبل الدوارة.
  2. إضافة 1.5 مل من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية الميثيونين والإضافي أو المواد الغذائية لصيانة البلازميد، وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات إضافية على طبل الدوارة.
  3. نقل 1 مل من الخلايا في كل واحد منهما 5 مل أنابيب جولة القاع. إضافة 0.25 مل من YNB -Met المتوسطة إلى الأنبوب الأول (حالة -Met)، و 0.25 مل من YNB متوسطة تحتوي على 100 ميكروغرام/ مل ميثيونين في أنبوب الثاني لإعطاء تركيز ميثيونين النهائي من 20 ميكروغرام / مل (حالة + الحد). احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على طبل الدوارة.
  4. تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي، واختيار قدما مبعثر (FS) كمقياس لحجم الخلية، وMup1-pHluorin كثافة مضان من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) مرشح كمقياس لاستيعاب البضائع.
  5. استخدام أزرار التمرير لضبط الجهد للFS وقنوات FITC لتحسين الكشف عن مدى حجم ومضان كثافة خلايا الخميرة المستخدمة (لهذه التجارب، كانت الإعدادات المستخدمة 50 V لFS و 400 V لFITC).
    ملاحظة: سوف الجهد لكل من قنوات تختلف تبعا لقياس التدفق الخلوي المستخدمة. وينبغي أن يتم هذه الخطوة قبل أو أثناء فترة العلاج 45 دقيقة مع ميثيونين (الخطوة 6.3).
  6. قياس FS وكثافة مضان ل 10،000 الخلايا من كل حالة، وذلك باستخدام إعداد معدل تدفق عالية. توليد مؤامرة مبعثر من FS ضد فلووrescence كثافة: انقر فوق "إضافة الرسم البياني"، حدد FITC (محور س) وFS (المحور الصادي)، والرسم البياني 1000 نقطة (يقوم البرنامج بعرض قيم 1000 الخلايا، حتى ولو تم قياس 10000 الخلايا).
    ملاحظة: للحصول على تناسق القصوى وتحليل خلايا 45-50 دقيقة بعد إضافة الميثيونين. للتجارب التي تشمل عددا كبيرا من العينات، ارباك إضافة الميثيونين لاستيعاب الوقت اللازم لتحليل التدفق الخلوي.
  7. وتشمل الشروط -Met و+ الأرصاد لالبرية من نوع (WT) خلايا كمجموعة تحكم. باستخدام وظيفة البوابة، تعيين بوابة العمودية باستخدام حالة WT + الأرصاد الجوية، مثل أن ما يقرب من 5٪ من ألمع خلايا تقع على يمين البوابة. استخدام هذا النابضة لجميع الشروط الأخرى في التجربة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توطين حالة استقرار وتقدير من البروتين البضائع التقامي المنضوية جوهري Ste3

لإثبات أن الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin-يمكن استخدامها لتقدير حجم الإلتقام في الخلايا الحية، توطين GFP خيالية واندماج pHluorin مع الذيل حشوية C-محطة من Ste3، ومستقبلات فرمون على عامل في الخميرة، وتمت مقارنة. Ste3 هو G البروتين يقترن مستقبلات (GPCR) ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطبيقات pHluorin لتقدير الأحداث التقامي في خلايا الخميرة يجعل من استخدام الشحنات عبر الغشاء الذي هو تنصهر علامة فلوري إلى ذيل حشوية من البروتين (الشكل 1A). لفحوصات وصفها هنا، الشحنات هي فلوري الزاهية عندما يتعرض العلامة pHluorin إلى بيئات محايدة، ولكن أصبح مروي عندما يصادف العلامة pHluorin الظروف الحمضية. وهكذا، تم الكشف عن البضائع التقامي الموسومة pHluorin-بسهولة في مواجهة حشوية من غشاء البلازما وعلى الإندوسومات في وقت مبكر، ولكن يصبح "قاتمة" عندما تدمج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر Gero Miesenböck و Tim Ryan لمشاركة pHluorin (cDNA) المستخدمة لتوليد الكواشف في هذه الدراسة ، وناثان رايت وجوانا بوبراوسكي وليديا نياساي على المساعدة الفنية الممتازة ، وأعضاء مختبر Wendland للمناقشات المفيدة ، ومايكل ماكافري وإيرين برايس في مركز التصوير المتكامل (جونز هوبكنز) للحصول على المشورة والمساعدة في الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (إلى BW ، GM60979) والمؤسسة الوطنية للعلوم (إلى BW ، MCB 1024818). تم دعم K.W. جزئيا بمنحة تدريبية من المعاهد الوطنية للصحة (T32-GM007231). تم دعم A.F.O. من خلال أموال تنموية من قسم العلوم البيولوجية في جامعة Duquesne ومنحة التوظيف لمؤسسة العلوم الوطنية 553143.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأدينينسيجماA8626-25Gاستخدم لتحضير خليط الأحماض الأمينية ومحلول المرق
باكتو أجارفيشرBP1423-2استخدم لتحضير وسائط الألواح
BD Difco قاعدة نيتروجين الخميرة (بدون أحماض أمينية)BD291920استخدم لتحضير وسائل الإعلام السائلة والألواح
Concanavalin ASigmaC5275-5MGاستخدم لطلاء الغرفة شرائح
سكر العنبفيشرBP350-1استخدم لتحضير وسائل الإعلام السائلة والصفائحية
L-HistidineFisherBP382-100استخدم لتحضير خليط الأحماض الأمينية ومحلول
المرق L-LeucineAcros125121000استخدم لتحضير خليط الأحماض الأمينية ومحلول المرق
L-LysineFisherBP386-100استخدم لتحضير خليط الأحماض الأمينية ومحلول المرق
L-MethionineFisherBP388-100استخدم لتحضير خليط الأحماض الأمينية ومحلول المرق
L-TryptophanFisherBP395-100استخدم لتحضير خليط الأحماض الأمينية ومحلول المرق
L-TyrosineAcros140641000استخدم لتحضير خليط الأحماض الأمينية
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8-well)155411العلمي الحراريللمقايسات الحركية ونقطة النهاية لاستيعاب Mup1-pHluorin
UracilSigmaU0750-100Gاستخدم لتحضير خليط الأحماض الأمينية ومحلول المخزون
Axiovert 200 مجهر مقلوبCarl ZeissCustom Build
100X / 1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective LensCarl Zeissيجب أن يكون الهدف 100X، 1.4NA أو أعلى
SensicamCooke Corporationعلى نطاق ديناميكي 12 بت أو أعلى
X-Cite 120PC Q IlluminationSource Excelitas Technologies
Slidebook 5 برنامجابتكارات التصوير
برنامج ImageJالمعاهد الوطنية للصحةhttp://imagej.nih.gov/ij/
استخدام يجب أن تحتوي كاميراالذكي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
  3. Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
  4. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).
  5. Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
  6. Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
  7. Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
  8. Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
  9. Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
  10. Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
  11. Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
  12. Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
  13. Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
  14. Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
  15. Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
  16. O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
  17. O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
  18. Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
  19. Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
  20. Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
  21. Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  24. Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
  25. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  26. Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
  27. Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
  28. Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
  29. Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
  30. Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
  31. Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
  32. Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
  33. Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
  34. Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
  35. Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
  36. Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
  37. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
  38. Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
  39. Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
  40. Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
  41. Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
  42. Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
  43. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
  44. Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

pHluorinEndocytosisFluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

مقالات ذات صلة