مقالة منهجية

والاستشعار القائم بولي آنلين من الأحماض النووية

DOI:

10.3791/54590

⸱

نوفمبر 1, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأحماض النووية هي تحليلات شائعة لتقييم الأنظمة البيولوجية ؛ ومع ذلك ، فإن التحيز الناتج عن التلاعب الأنزيمي يمكن أن يسبب القلق. هنا يتم وصف طريقة للكشف الخالي من الملصقات عن الأحماض النووية باستخدام البولي أنيلين. يمكن لتقنية الاستشعار الحساسة والفعالة من حيث التكلفة التمييز بين الاختلافات في النيوكليوتيدات المفردة بين الجزيئات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الكشف عن الأحماض النووية في صميم تقنيات التشخيص المستخدمة في البحث والعيادة. تعتمد الأساليب القياسية المستخدمة في هذه التقنيات على التعديل الأنزيمي الذي يمكن أن يؤدي إلى التحيز والقطع الأثرية. سيكون الاستشعار الجزيئي المباشر عنصرا حاسما في منصات الكشف من الجيل التالي ، وبالتالي تجنب الحاجة إلى التضخيم أو التسميات. قد توفر المواد النانوية المتقدمة الطرائق الكيميائية المناسبة لتحقيق أجهزة استشعار خالية من الملصقات. تعتبر البوليمرات المترافقة مثالية للاستشعار البيولوجي ، وتمتلك خصائص متوافقة مع الجزيئات الحيوية وتظهر حساسية عالية للتغيرات البيئية الموضعية. في هذه المقالة ، يتم تقديم طريقة للكشف عن الأحماض النووية باستخدام بوليمر بوليمر التوصيل الكهربائي بولي أنيلين. يتم ربط قليل النوكليوتيدات البسيطة "مسبار" الحمض النووي المكملة للأحماض النووية المستهدفة إلكتروستاتيكيا بالبوليمر ، مما يخلق نظام استشعار يمكنه التمييز بين اختلافات النيوكليوتيدات المفردة في الجزيئات المستهدفة. خارج الطبيعة المحددة وغير المتحيزة لهذه التكنولوجيا ، فهي فعالة للغاية من حيث التكلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
توفر البوليمرات المترافقة < p class = 'jove_content'> العديد من الخيارات لأجهزة الاستشعار الجزيئية. يتضمن ذلك الاستجابات الفلورية والإلكترونيةواللونية 1. كانت هناك العديد من الجهود لدمج البوليمرات المترافقة في مستشعرات الحمض النووي. ومع ذلك ، تتطلب معظم الأنظمة اكتشافا ثانويا ، مما يحد من خيارات الاستشعار2. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا عن منصة استشعار مترافقة قائمة على البوليمر مبنية على مادة البولي أنيلين (PANI) التي تستغل خصائص هذا البوليمر ، مما يخلق نظاما خاليا منالملصقات 3. PANI عبارة عن بوليمر كهربائي نشط مترافق على نطاق واسع بخصائص مثل التألق والمقاومة المناسبة لقياس الأنظمةالبيولوجية 4. الإكسيتونات داخل الهيكل غير موضعية مما يؤدي إلى حركة الشحنة الموجبة بين الوحدات الفرعية الأحادية. يوفر هذا سقالة مرنة من الشحنات الموجبة التي يمكن أن تتفاعل مع العمود الفقري سالب الشحنة للحمض النووي5،6. الأهم من ذلك ، أن الحمض النووي المتصل إلكتروستاتيكيا موجه بحيث يمكن للقواعد النيتروجينية أن تشارك في إقران القاعدة. يغير الارتباط بالحمض النووي الخصائص الإلكترونية ل PANI ، وهو تأثير يمكن تعزيزه عن طريق الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 1) 3. باستخدام هذا النظام ، يمكن تثبيت قليل النوكليوتيدات المكملة للأحماض النووية المستهدفة على PANI. أظهرت دراسات متعددة أنه عند التهجين ، تنفصل قليل النوكليوتيدات الممتصة إلكتروستاتيكيا عن PANI أو المصفوفات الموجبة الأخرى بسبب التغيرات التوافقية الناتجة عن التحول إلى بنية الحمض النووي مزدوجةالشريطة 3،5،7.

في نظام الاستشعار حيث يعدل مرفق المسبار خصائص البوليمر المترافق ، يمكن تحويل أحداث التهجين بدون ملصقات أو تعديل إنزيمي للمجسات أو الأحماض النووية المستهدفة. توفر البوليمرات المترافقة مرونة كبيرة في طرق الكشف ، أحدها الفلور. من خلال مراقبة مضان PANI ، يمكن اكتشاف تركيزات الأحماض النووية المستهدفة التي تصل إلى 10-11 م (10 جزء في المليون)3. الاكتشاف سريع ، ويحدث في غضون 15 دقيقة من التهجين ، ومحددا حيث يمكن تمييز عدم تطابق واحد في جزيء مستهدف3.

تصنيع مستشعرات PANI أمر بسيط. يمكن توليد PANI عالي الوزن الجزيئي مشتتا جيدا في الماء باستخدام إجراءات التوليف القياسية التي تتضمن مونومر الأنيلين والفاعل بالسطح والإضافة الخاضعة للرقابة من المؤكسد. يمكن أن يكون العائد مرتفعا جدا وتمت إزالة المؤكسد غير المتفاعل عن طريق الغسيل بالماء ، مما يضمن عدم نمو PANI مرة أخرى. يحدث ارتباط مسبار PANI تلقائيا عند الخليط ، ويتم تعزيز التكوين المعقد من خلال التعرض الخفيف للأشعة فوق البنفسجية. يمكن إجراء التهجين على الفور ، وفحص التغييرات في مضان PANI بعد حضانة قصيرة. بساطة هذه التقنية تجعلها في متناول العديد من المختبرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. للمعالجة باني التجميعي

  1. حل الأنيلين (1 مل، 11 ملمول) تماما في 60 مل من الكلوروفورم في 250 مل قارورة جولة القاع. إثارة في 600 دورة في الدقيقة ل5 دقائق وبارد إلى 0-5 درجة مئوية مع الثلج. هذا عادة ما يستغرق 15-20 دقيقة (الشكل 2A).
  2. إضافة الصوديوم دوديسيل البنزين سلفونات (NaDBS) (7.44 غرام، 21 ملمول) إلى حل الأنيلين في دورق كروي، مع التحريك في 600 دورة في الدقيقة.
  3. حل فوق كبريتات الأمونيوم (APS) (3.072 غرام، 13.5 ملمول) في 20 مل من الماء وإضافة كل منها قطرة من الحكمة أكثر من 30 دقيقة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة رد فعل.
  4. تنفيذ رد فعل في 0-5 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، والسماح لها للوصول إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة أخرى.
  5. مراقبة خليط التفاعل بدوره في البداية أبيض حليبي بعد 15 دقيقة، والبني الداكن ثم بعد 2 ساعة وفي النهاية إلى اللون الأخضر الداكن ذلك بعد 24 ساعة (الشكل 2B-إف).
  6. تصفية حل باني-NaDBS مع قمع بوخنر. مزيج 80 مل الكلوروفورم، و 120 مل من الماء في النحوقمع eparation (الشكل 2G).
  7. احتضان الحل لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة وجمع باني خضراء داكنة من قمع الفصل، وترك NaDBS المتفاعل وكالة الأنباء الجزائرية في طاف مائي.

2. خلط باني مسبار الأشعة فوق البنفسجية والإشعاع

  1. تمييع باني حل 10X مع الكلوروفورم للماء (1: 3 ت / ت) ومزيج 200 ميكرولتر من باني المخفف مع 6.4 مكرومول من أليغنوكليوتيد] الحمض النووي التحقيق التي كتبها هزاز لطيف لمدة 15 دقيقة في أنبوب microfuge.
  2. أشرق الحل باني الحمض النووي مع 1200 μJ / الطول 2 من الأشعة فوق البنفسجية في crosslinker ل2 دقيقة. ومن الأهمية بمكان أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية يقتصر على المبلغ المشار إليه. مددت التعرض للأشعة فوق البنفسجية يهدد التغيير مضان في باني، من المحتمل بسبب التساهمية عبر ربط باني والحمض النووي.
  3. مجمعات بيليه بواسطة الطرد المركزي في 17000 x ج لمدة 6 دقائق، ويغسل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). بيليه مرة أخرى، وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني.

3. Hybridization من باني مسبار

  1. إضافة 8 ميكرولتر من 100 ميكرومتر أليغنوكليوتيد] الحمض النووي مكملة أو استهداف الأحماض النووية إلى 200 ميكرولتر من المجمعات باني مسبار.
  2. أداء التهجين التي تعصف حل الخليط لمدة 15 دقيقة في 40 ° C.
  3. بيليه المجمعات باني بواسطة الطرد المركزي في 17000 x ج لمدة 6 دقائق. يغسل مع برنامج تلفزيوني واعادة تعليق في الماء.

4. الانبعاثات مطرد القياس دولة الإسفار

  1. إضافة باني من العلاجات المختلفة في صفيحة 96 جيدا وقياس مضان الانبعاثات في نطاق 270-850 نانومتر الإثارة في 250 نانومتر. ينبغي مراعاة ذروة الانبعاثات لباني حوالي 500 نانومتر.

5. مضان المجهر قياس تهجين دوبلكس

  1. إسقاط معطف باني على ساترة البورسليكات الزجاج وجافة عند 40 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. إضافة التحقيق (8 ميكرولتر من 100 ميكرومتر) على فيلم باني المجففة وأشرق ذلك مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (1200 μJ / سم 2 ) لمدة 2 دقيقة.
  3. غسل فيلم باني مسبار مع برنامج تلفزيوني وجافة عند 40 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  4. أداء التهجين لمدة 15 دقيقة وذلك بإضافة الهدف الأحماض النووية. هذا يمكن أن يكون عينة بيولوجية أو قليل النوكليوتيد تحكم الهدف (8 ميكرولتر من 100 ميكرومتر). اتبع مع غسل برنامج تلفزيوني.
  5. الحصول على صور الفلورسنت في 40X التكبير، مع 500 نانومتر تمريرة طويلة التصفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 2A يلتقط الإعداد رد فعل في بداية عملية البلمرة، أي قبل وكالة الأنباء الجزائرية بالإضافة. تشكيل مذيلة هو الخطوة الأولى في رد فعل يحدث التوليف عملية باني في واجهة micellar. الشكل 2B يظهر حل حليبي بعد 5 دقائق. 30 دقيقة بعد إضافة APS رد الفعل يتحول إلى اللون البني قليلا. ويبين الشكل 2C تغيير لون يرتبط مع تشكيل الأوليغومرات. ويبين الشكل 2D اللون البني الداكن بعد 4 ساعات، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جهاز استشعار على أساس باني من الأحماض النووية يتطلب الإذابة من البوليمر في الماء من أجل التفاعل مع الحمض النووي والحمض النووي الريبي. ويتم إنجاز تشتت باني في المياه باستخدام السطحي لتشكل المذيلات كما ذكرت سابقا 8. بالإضافة إلى NaDBS المستخدمة هنا الأخرى أنيوني السطحي مثل استر دوديسيل حامض 4-sulfophthalic، السطحي غير أيوني مثل ethoxylate نونيل الفينول، أو السطحي الموجبة مثل بروميد cetyltrimethyl الأمونيوم ويمكن أيضا أن تستخدم لتخليق للمعالجة باني 9،10. تركيب و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل من قبل كلية العلوم والتكنولوجيا بجامعة جنوب ميسيسيبي وكلية ميسيسيبي للعلوم والتكنولوجيا وبرنامج ميسيسيبي INBRE (الجائزة رقم P204M103476 من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة).

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنيلين فيشر العلمية A7401-500 ACS ، سائل ، مبرد
بيروكسي دي كبريفات الأمونيومفيشر العلمية A682-500 ACS ، بلوري
سلفونات دوديسيل بنزين الصوديومPfaltz & Bauer D56340 95٪ صلب
كلوروفورمفيشر العلمية MCX 10601 سائل
بادئات الحمض النوويMWG أوبرونن / تسلسلالحمض النووي المخصص ~ 20 & nbsp; بت في الثانية
Microplate الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1402-9800 96 حسنا ، بولي بروبلين لأنه غير متفاعل مع الكلوروفورم
فيلم لاصق Microplateالولايات المتحدة الأمريكية العلمية 2920-0000 يقلل من التلوث من البئر إلى البئر وانسكاب العينات والتبخر
غطاء مجهر زجاجفيشر العلمية 12-544-D PANI مطلي بزجاج الغطاء المشع بالأشعة فوق البنفسجية
الأشعة فوق البنفسجية UVP HL-2000 الطاقة: X100 & mu ؛ J / سم < سوپ > 2 < / سوب> ؛ الوقت: 2 دقيقة
فرن تهجينVWR01014705 Tدرجة الحرارة: 400 & nbsp; ° C; مع هزاز لمدة 15 دقيقة
جهاز زجاج   ؛فيشر العلميثلاثة قارورة أسفل مستديرة العنق لرد الفعل; إسقاط القمع, سدادات, مكثف, فصل قمع
مجهرلايكا مايكسيستمز تكبير Leica IMC S8020X ؛ اللون الزائف 536 نانومتر ؛ التعرض 86 مللي ثانية ؛ كسب 1.0x ؛ Gamma 1.6
Microplate Readerالأجهزة الجزيئية 89429-536

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
  2. Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
  4. Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).
  5. Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
  6. Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
  7. Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).
  8. Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
  9. John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
  10. El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
  11. Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
  12. Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
  13. Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
  14. Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
  15. Kadashchuk, A., et al. Localized trions in conjugated polymers. Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).
  16. Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
  17. Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة