مقالة منهجية

التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/54599

⸱

أكتوبر 18, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة عن المظهرية والتحليل الكمي الضامة المقيمين من الكلى الفئران عن طريق التدفق الخلوي. الخلايا الملون الناتجة يمكن أن تستخدم أيضا لتطبيقات أخرى، بما في ذلك فرز الخلايا، تحليل التعبير الجيني أو الدراسات الوظيفية، وبالتالي زيادة المعلومات التي تم الحصول عليها في النموذج التجريبي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك أدلة متزايدة تشير إلى الدور المهم للالتهاب ، وبالتالي البلاعم في تطور وتطور أمراض الكلى. الضامة هي خلايا غير متجانسة متورطة في إصابة الكلى. يمكن تصنيف البلاعم إلى نمطين ظاهريين مختلفين: البلاعم المنشطة كلاسيكيا (الضامة M1) ، التي تطلق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات وتعزز التليف. وبدلا من ذلك ، يتم تنشيط الضامة (M2 الضامة) المرتبطة بوظائف تنظيم المناعة وإعادة تشكيل الأنسجة. تحتاج هذه الأنماط الظاهرية للبلاعم إلى التمييز وتحليلها لتحديد مساهمتها في إصابة الكلى. ومع ذلك ، هناك دراسات نادرة تشير إلى معلومات متسقة من النمط الظاهري والوظيفي حول الأنواع الفرعية للبلاعم في نماذج أمراض الكلى الالتهابية ، خاصة في الفئران. قد تكون هذه الحقيقة مرتبطة بعلامات البلاعم المحدودة المستخدمة في الفئران ، على عكس الفئران. لذلك ، فإن الاستراتيجيات الجديدة ضرورية لتحديد وتوصيف المحتوى الكلوي لهذه الخلايا المتسللة بطريقة موثوقة. توضح هذه المخطوطة بالتفصيل بروتوكولا لهضم الكلى والمزيد من التحليل الظاهري والكمي للبلاعم من كلى الفئران عن طريق قياس التدفق الخلوي. باختصار ، تم تحضين الكلى بالكولاجيناز وتم تحديد البلاعم الكلية وفقا للوجود المزدوج ل CD45 (مستضد الكريات البيض المشترك) و CD68 (علامة البلاعم PAN) في الخلايا الحية. تبع ذلك تلطيخ سطح CD86 (علامة M1) و CD163 (علامة M2). تم استخدام البلاعم البريتونية للفئران كعنصر تحكم إيجابي للكشف عن علامات البلاعم عن طريق قياس التدفق الخلوي. أدى بروتوكولنا إلى انخفاض معدل الوفيات الخلوية وسمح بتوصيف علامات البروتين المختلفة داخل الخلايا والسطحية ، مما يحد من فقدان السلامة الخلوية التي لوحظت في البروتوكولات الأخرى. علاوة على ذلك ، يسمح هذا الإجراء باستخدام البلاعم لمزيد من التقنيات ، بما في ذلك فرز الخلايا ودراسات mRNA أو التعبير البروتيني ، من بين أمور أخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الكلى هو مشكلة صحية عالمية ، مع زيادة الانتشار ، ويرتبط بارتفاع معدلات المراضة والوفيات1. يعد الالتهاب من أهم الآليات المشاركة في تطور وتطور إصابة الكلى ، والذي يسببه البلاعم بشكل أساسي. تلعب البلاعم دورا محوريا في العديد من الأمراض الالتهابية ، بما في ذلك اضطرابات الكلى2. وبالتالي ، تم الإبلاغ عن وجود مرتفع للضامة المتسللة في خزعات المرضى الذين يعانون من إصابة الكلى الحادة (AKI) أو أمراض الكلى المزمنة (CKD) 3،4. تشير الدراسات الحديثة إلى أن النتيجة طويلة المدى لمرض الكلى يمكن السيطرة عليها بواسطة البلاعم5،6. استجابة للبيئة المكروية المحلية ، قد تتمايز البلاعم إلى أنماط ظاهرية مختلفة تلعب وظائف بيولوجيةمتنوعة 7. تم إنشاء نوعين من البلاعم المتمايزة جيدا: البلاعم المنشطة كلاسيكيا (البلاعم M1) والضامة المنشطة بدلا من ذلك (M2)8. تعمل البلاعم M1 على تعزيز الالتهاب ، في حين أن البلاعم M2 لها دور مضاد للالتهابات وتشارك في إصلاحالأنسجة 9. لذلك ، من الضروري معرفة أفضل بعدم تجانس البلاعم لفهم تنظيمها ومساهمتها في أمراض الكلى وتطوير مناهج علاجية جديدة.

تم استخدام كل من نماذج الفئران والجرذان على نطاق واسع لفهم الآلية الجزيئية والخلوية المشاركة في إصابة الكلى10. ومع ذلك ، هناك اختلافات جوهرية في العلامات المتنوعة المستخدمة لتحديد الأنماط الظاهرية للبلاعم بين هذه القوارض. وبالتالي ، لا يتم استخدام العديد من علامات الفئران ، مثل F4 / 80 أو Ly6C في الفئران ، مما يحد من استقراء النتائج بين هذه الأنواع. علاوة على ذلك ، هناك عدد محدود من العلامات التي تصف الأنماط الظاهرية للبلاعم في الفئران ، مما يفسر الدراسات النادرة التي تحلل عدم تجانس البلاعم في هذه مقارنة بالفئران. لذلك ، فإن الاستراتيجيات الجديدة لتوصيف المجموعة الفرعية للبلاعم ضرورية لفهم دور البلاعم في نماذج أمراض الكلى في الفئران.

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا للتحليل الظاهري والكمي للبلاعم من كلى الفئران عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن أن تتبع هذه التقنية أيضا العديد من المقايسات ، بما في ذلك فرز الخلايا ودراسات mRNA أو التعبير البروتيني للسماح بالتوصيف المتعمق لدور الضامة في أمراض الكلى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل المحلية المؤسسي رعاية الحيوان واللجان استخدم التالية التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي الصادر عن البرلمان الأوروبي والإرشاد القومي 53/2013.

1. إعداد الكواشف وحلول

  1. إعداد جميع الكواشف والحلول تحت ظروف معقمة وتستخدم تحت غطاء تدفق الصفحي. حافظ على الحلول في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد عازلة تلطيخ (2٪ مصل بقري جنيني (FBS) في برنامج تلفزيوني 1X Dulbecco و).
  3. يعد حل كولاجيناز بإضافة 0.5 ملغ من كولاجيناز لكل مل من المياه المالحة.
  4. يعد حل التخدير الكيتامين / زيلازين (2: 1 ت / ت).

2. الكلى الإرواء واستخراج

  1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين (75 ملغ / 12 ملغم / كغم من وزن). بعناية قرصة أضعاف صغيرة من الجلد، للتأكد من أن هذا الحيوان هو تخدير بما فيه الكفاية. ثم، وتغطية العينين مع مرهم بيطري لمنع جفاف بينما تحت التخدير. ملاحظة: 4-مونوتستخدم الفئران ويستار عشر من العمر في هذا الاختبار.
  2. مرة واحدة يتم تخدير الفئران تماما، ووضعه على طاولة العمليات الجراحية في موقف ضعيف.
  3. تطبيق 70٪ من الإيثانول في البطن.
  4. جعل شق المركزي من خلال الجلد في منطقة البطن والصفاق، من العانة إلى القفص الصدري، لفضح تجاويف الجنبي والبطن.
  5. حقن محلول ملحي (0.9٪) في الشريان الأورطي البطني ليروي الكلى باستخدام نظام نضح حتى تتم إزالة كل الدم من الكليتين. قطع الشريان الأورطي على مستوى البطن للمساعدة في الافراج الدم.
  6. إزالة كل من الكليتين من الفئران عن طريق قطع من نقير كلوي (الوريد الكلوي، الشريان والحالب). لdecapsulate الكلى، اضغط على حافة الكلى باستخدام الأصابع، التي تفصل بعناية كبسولة 11.
  7. وضع الكلى في محلول ملحي متوازن هانكس ".

الهضم 3. الكلى وتعليق خلية

  1. قطع نصف الكلى مع مقص الى قطع صغيرة وضعتقطع في أنبوب 1.5 مل.
    ملاحظة: يتم احتساب جميع التركيزات التالية ل1 عينة (الكلى 1/2 فأر).
  2. إضافة 1 مل من محلول كولاجيناز واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. مزيج من قبل انعكاس كل 5 دقائق للتأكد من أن الحل كولاجيناز بالوصول إلى الأنسجة بأكملها.
  3. جمع الحل وتمريرها من خلال مصفاة (40 ميكرون) بمساعدة الغواص، و resuspend في 10 مل من العازلة تلطيخ.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 15 دقيقة.
  5. إعادة تعليق بيليه في 1 مل ACK (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم) الناشر العازلة. بعد 1 دقيقة و 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة، إضافة 10 مل من العازلة تلطيخ لوقف التفاعل.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  7. إعادة تعليق بيليه في حجم كاف من تلطيخ عازلة (1 مل) وتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة (30 ميكرون).
  8. حساب عدد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق على عدادة الكريات وإضافة 2 مليون خلية إلى أنبوب 1.5 مل لستاining.

4. خلية تحليل تلطيخ والتدفق الخلوي

  1. خلايا الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
  2. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من مصل الفئران (المخفف 1: 100) لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لمنع مستقبلات لكرة القدم.
  3. غسل بإضافة 1 مل من العازلة تلطيخ وأجهزة الطرد المركزي 100 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. مزيج الأجسام المضادة لتلطيخ سطح الخلية في 100 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل حالة: CD45 APC-Cy7 (1: 100)، CD163 A647 (4: 100)، والحل للكشف عن الخلايا الحية (3: 1000).
  5. إعادة تعليق بيليه خلية في مزيج الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  6. غسل بإضافة 1 مل من العازلة تلطيخ وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة.
  7. إضافة 600 ميكرولتر من التثبيت حل / Permeabilization لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  8. اغسل 2 مرات مع 1 مل العازلة Permeabilization / غسيل وأجهزة الطرد المركزي في 170 x ج لمدة 5 دقائق.
  9. إضافة الجسم المضاد CD68 FITC (35: 1000) لintracelتلطيخ lular إلى 100 ميكرولتر من العازلة Permeabilization / غسيل لكل حالة.
  10. إعادة تعليق بيليه في حل CD68 الأجسام المضادة واحتضان 50 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  11. تغسل مع 1 مل العازلة Permeabilization / غسيل وأجهزة الطرد المركزي في 170 x ج لمدة 5 دقائق.
  12. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة Permeabilization / غسيل، إضافة CD86PE الأجسام المضادة (35: 1000)، واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  13. غسل بإضافة 1 مل من Permeabilization / غسيل العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
  14. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة Permeabilization / غسيل وتمريرها إلى التدفق الخلوي أنبوب.
  15. تحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي. تحديد تلطيخ CD45 في الخلايا الحية مسور في ضوء / الضوء المتناثرة إلى الأمام، متناثرة الجانبية (/ FSC SSC) نافذة. في الخطوة الثانية، وتحليل CD86 والتعبير CD163 في خلايا CD68 +.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتحليل بلعم عدم التجانس في نموذج تجريبي من التهاب الإصابة الكلوية يرتبط بزيادة جود تسلل الضامة في الكلى. في هذا النموذج، وكان المستحث تلف الكلى من قبل إدارة الألدوستيرون (1 ملغ -1 كغم -1 اليوم)، بالإضافة إلى الملح (كلوريد الصوديوم 1٪) في مياه الشرب لمدة 3 أسابيع في فئران ويستار، كما ذكرت سابقا 12.

يظهر الجدول ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الضامة هي خلايا غير المتجانسة التي تلعب دورا مهما في الأمراض الالتهابية المختلفة، بما في ذلك اضطرابات الكلى. وهناك اهتمام متزايد في توصيف الضامة فرعية في أمراض الكلى لأن كل حيوانية بلعم يساهم بطريقة مختلفة لتنمية إصابة الكلى، كما ورد في التهاب كبيبات الكلى، اعتلال الكلية السكري وسرطان الكلى 14-16. في المراحل الأولى من الإصابة الكلوية الحادة، ويلاحظ غلبة الضامة M1، وتعزيز نخر أنبوبي والالتهابات. ومع ذلك، في مراحل لاحقة لوحظ ارتفاع محتوى الضامة M2 لحل التهاب والمشاركة في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من FIS / FEDER (Programa Miguel Servet: CP10 / 00479 و PI13 / 00802 و PI14 / 00883) ، والجمعية الإسبانية لتصلب الشرايين ، والجمعية الإسبانية لأمراض الكلى و Fundaciòn Kidney Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) لخوان أنطونيو مورينو. وتمول FIS/FEDER PI14/00386 ومعهد Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica إلى Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rabago إلى Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) إلى Alfonso Rubio Navarro.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شفاط التدفق الصفحيأسرعأو ما يعادلها من معدات
الطرد المركزيHettichأو المعدات المكافئة
مقياس التدفق الخلوي (FACSAria) BDBiosciences
مصل الأبقار الجنينيBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
كولاجينازسيجما ألدريتش12/1/9001
ACK Lysing BufferThermo Fisher ScientificA10492-01
مصافي قياس التدفق الخلوي BDBiosciences340626
مصافي خلايا الصقرThermo Fisher Scientific352340
أنابيب قياس التدفق الخلويFalcon3520525 مل أنابيب الطرد المركزي ذات الأنبوب المستدير
القاع Corning سنتريستار430791
حمام مائيMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 &# 176 ؛ C
محلول التثبيت / النفاذية أو النفاذية / الغسيل العازلةBD Biosciences554714
Rompum (Xylazine)Bayerأو ما يعادله
من Ketalar (Ketamine)Pfizerأو ما يعادله
من محلول الملح المتوازن من HanksSigma-AldrichH8264-500ML
محلول ملحيBraun622415
Anti-CD45 (استنساخ: OX-1) APC-Cy7Biolegend202216مخفف 1:100
Anti-CD68 (استنساخ: ED1) FITCBio-RADMCA341Fمخفف 35: 1,000
مضاد ل CD86 (استنساخ: 24F) PEBiolegend200307مخفف 35: 1,000
مضاد ل CD163 (استنساخ: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342Rمخفف 4:100
بقعة حية / ميتة المجسات الجزيئيةL34955مخففة 3: 1,000

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946(2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD45 CD68 CD86 CD163 M1 M2

مقالات ذات صلة