يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التنميط الجيني ل

9.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54623

⸱

نوفمبر 4, 2016

1Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، يتم استخدام فاصل الريبوسومات PCR (RS-PCR) جنبا إلى جنب مع نظام الرحلان الكهربائي المصغر كطريقة سريعة وعالية الدقة للتنميط الجيني S. aureus بتكاليف معتدلة تسمح بإنتاجية عالية.

الملخص

المباعد الريبوسومي PCR (RS-PCR) هي طريقة تنميط جيني قوية للغاية للكونكورويات العنقودية الذهبية تسمح بإنتاجية عالية بتكاليف معتدلة ، وبالتالي فهي مناسبة للاستخدام للأغراض الروتينية. للحصول على أفضل دقة وتقييم للبيانات وإدارة البيانات ، يلزم وجود نظام رحلان كهربائي مصغر. جنبا إلى جنب مع نظام الرحلان الكهربائي هذا والبرنامج المطور داخليا (متاح مجانا هنا) ، يتم توحيد تعيين نمط النطاقات إلى النمط الجيني ومباشرا. استخراج الحمض النووي بسيط (تحضير الغليان) ، وإعداد التفاعلات سهل ويمكن تشغيلها على أي جهاز PCR قياسي. يعد ركوب تفاعل البوليميراز المتسلسل أمرا شائعا باستثناء أوقات التصاعد والاستطالة لفترات طويلة. بالمقارنة مع الكتابة في السبا وكتابة تسلسل الموضع المتعدد (MLST) ، لا يتطلب RS-PCR تسلسل الحمض النووي مما يبسط التحليل إلى حد كبير ويسمح بإنتاجية عالية. علاوة على ذلك ، فإن دقة سلالات الأبقار من المكورات العنقودية الذهبية جيدة على الأقل مثل الكتابة في السبا وأفضل من MLST أو الرحلان الكهربائي للهلام النبضي (PFGE). وتشمل قاعدة بيانات RS-PCR حاليا ما مجموعه 141 نمطا ومتغيرا. ترتبط هذه الطريقة ارتباطا وثيقا بنمط جين الفوعة والعدوى والإمراضية لسلالات المكورات العنقودية الذهبية المتورطة في التهاب الضرع البقري. النمط الجيني للعقدية الذهبية B (GTB) معدي ويسبب مشاكل في القطعان تسبب تكاليف كبيرة في سويسرا ودول أوروبية أخرى. جميع الأنماط الجينية الأخرى التي لوحظت في سويسرا تصيب الأبقار والأرباع الفردية. يسمح التنميط الجيني بواسطة RS-PCR بالتنبؤ الموثوق به للإمكانات الوبائية والممرضة للمكورات العنقودية الذهبية المتورطة في عدوى الأبقار داخل الثدي (IMI) ، وهما عاملان رئيسيان للطب البيطري السريري. نظرا لهذه الخصائص المفيدة جنبا إلى جنب مع التكاليف المعتدلة وإنتاجية العينة العالية ، فإن الهدف من هذا المنشور هو تقديم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لإنشاء RS-PCR وتشغيله بسهولة للتنميط الجيني S. aureus في مختبرات أخرى.

المقدمة

المكورات العنقودية (S. المذهبة) كما هو معروف الممرض أهم المسؤولين في جميع أنحاء العالم للعدوى داخل الثدي (IMI) في الماشية 1. الدراسة التي فورنييه وآخرون. 2 موضح في الأبقار السويسرية والدراسات التي Cosandey وآخرون. (3) وبوس وآخرون. 4 في الأبقار من 12 دولة أوروبية أن س. العنقودية الذهبية المعزولة من الأبقار IMI هي مجموعة غير متجانسة وراثيا. بواسطة PCR التضخيم من 16S-23S الريباسي المنطقة فاصل بين الجينات (RS-PCR)، تم الكشف عن ما مجموعه 17 المورثات في البداية في 101 العزلات مستقلة وبائيا 2. كان النمط الجيني B و C التركيب الوراثي (GTC) الأكثر شيوعا (80٪)، في حين أن الأخرى 15 المورثات (GTS) وقعت نادرا، مما يجعل كل 1-4٪ من العزلات. على المستوى الأوروبي 3، GTB، GTC، GTF، كان GTI، وGTR التراكيب الوراثية أهم تضم 76٪ من جميع سلالات تحليلها (ن = 456). كانت تقع GTB في وسط أوروبا ثhereas وزعت على نطاق واسع في المورثات الأخرى. شملت 24٪ المتبقية من سلالات 41 المورثات، وكثير منهم، ومع ذلك، لوحظت مرة واحدة فقط.

أثبتت الدراسات التي فورنييه وآخرون. 2، Cosandey وآخرون. 3، وجرابر وآخرون. 5 أيضا أن المورثات كانت مرتبطة إلى حد كبير مع نمط الفوعة الجينات الخاصة بهم، وكذلك في سويسرا بصفتها ممثلة على المستوى الأوروبي. كشف مزيد من الدراسات اختلافات كبيرة في انتشار IMI بين س. أصيب النظر GTB، تصل إلى 87٪ من الأبقار في قطيع من هذا النمط الجيني: الذهبية GTB، GTC والمورثات الأخرى 2،5. في حالة GTC ومن المورثات الأخرى، ومع ذلك، IMI تم العثور فقط في 1-2 الأبقار من قطيع.

IMI التي تسببها س. الذهبية، يؤدي عادة إلى التهاب في الغدد الثديية المقابلة وبزيادة الخلايا الالتهابية في الحليب. ونتيجة لذلك، وشارك الخلايا الجسديةUNTS في الحليب (SCC)، المؤشر الرئيسي للجودة الحليب في معظم البلدان، وتزداد مما أدى إلى سعر الحليب انخفضت أو حتى توقف التسليم.

إلى جانب RS-PCR من فورنييه وآخرون. 2، وقد وصفت أساليب الكتابة الأخرى لعملية التصنيف الفرعي لسلالات الأبقار من S. الذهبية 8-11. تشمل اثنين من تلك الشائعة في الكتابة سبا 12 و متعدد الحالة رقم تسلسل الكتابة (MLST) 13. ويستند السابق واحد على تسلسل الحمض النووي في المنطقة هل المتغيرة من الجين الترميز سبا العنقودية للبروتين A، في حين أن واحدة الأخير يتطلب تسلسل 7 جينات التدبير المنزلي. هذا يعني أن واحدا 12 وسبعة تقارير إنجاز المشروعات 13، على التوالي، في حاجة إلى أن يقوم، تليها تنقية amplicon، رد فعل التسلسل والتحليل باستخدام معدات معينة. مقارنة RS-PCR، وهذه الأساليب تتطلب جهدا إضافيا كبيرا في المختبر مما أدى إلى سرعة عينة انخفاض وارتفاع التكاليف. الإنتاجية منخفضة بشكل خاص لPFGE. وبالنظر إلى قرار من هذه الأساليب لسلالات الأبقار من S. الذهبية، RS-PCR على الأقل جيدة كما سبا كتابة 4 وأفضل من MLST 4 أو PFGE 15.

أظهرت جميع هذه الطرق بما في ذلك الكتابة الثنائية 13 فعاليتها في الحصول على مزيد من التبصر في التسبب في الأبقار IMI التي تسببها س. الذهبية، ولكن بسبب القيود المذكورة هم أقل ملاءمة للتحقيقات سريرية واسعة النطاق. وبالإضافة إلى ذلك، التنميط الجيني عن طريق RS-PCR كما وصفها فورنييه وآخرون. 2 يسمح للتنبؤ موثوق لالوبائية واحتمال المسببة للأمراض من س. الذهبية تشارك في الأبقار IMI، قيمتين الرئيسية في الطب البيطري السريري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. المكورات العنقودية الذهبية العزلات

  1. نشر 10 ميكرولتر من س. الذهبية ثقافة الأسهم أو مستعمرة واحدة نمت على وسيلة انتقائية على لوحات أجار كولومبيا تحتوي على 5٪ الدم الأغنام (BA).
  2. احتضان هوائيا على 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة إلى 24 ساعة.

2. استخراج الحمض النووي

  1. إعداد عازلة هاتف تحتوي على 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك و 10 ملي نا 2 EDTA، ودرجة الحموضة 8.5. إعداد قسامات والأوتوكلاف على 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. جمع 1 مستعمرة من BA باستخدام حلقة عقيمة البلاستيك أو اختيار الأسنان الخشبي المعقم و resuspend في 100 هاتف ميكرولتر. استخدام 1.5 مل أنابيب مع قبعات المسمار.
  3. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. بعد ذلك، ضع عينات فورا على الجليد الرطب.
  4. تمييع عينات 1: 100 في H 2 O مناسبة لPCR (= قالب الحمض النووي للPCR). يمكن حفظ العينات غير المخفف والمخفف في -20 درجة مئوية لمدة 1 شهر.

3. RS-PCR

    لكل ماصة العينة إلى PCR أنبوب 1.5 ميكرولتر H 2 O، 12.5 ميكرولتر طق ميكس ماستر، 2 ميكرولتر G1 التمهيدي 10 ميكرومتر، 2 ميكرولتر التمهيدي L1 10 ميكرومتر، و 7 ميكرولتر من الحمض النووي القالب الذي يتوافق مع حوالي 30 نانوغرام من الذهب الخالص الحمض النووي (2).
  1. تشغيل برنامج الدراجات التالية في cycler على PCR القياسية: 15 دقيقة 95 درجة مئوية، تليها 27 دورات تضم 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها منحدر 2 دقيقة والصلب في 55 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. بعد 2 دقيقة منحدر آخر، تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. إنهاء PCR بواسطة ملحق النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها تهدئة إلى 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: منتجات PCR يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
  2. لكل شوط من RS-PCR تشمل مراقبة إيجابية، أي عينة مع النمط الجيني المعروف (عادة GTB)، والسيطرة السلبية (H 2 O).

4. الكهربائي

  1. استخدام عدة الكهربائي المنمنمة التجارية لالحمض النووي (مجموعة MED) معامع bioanalyzer متصلة بجهاز كمبيوتر والبرامج المثبتة. دراسة الأدلة المقابلة من الشركة المصنعة بعناية.
  2. إعداد محطة فتيلة رقاقة وضبط مقطع حقنة وفقا لدليل من الشركة المصنعة.
  3. تحضير مزيج هلام صباغة وفقا لدليل من الشركة المصنعة.
  4. تحميل مزيج هلام صباغة (وفقا لدليل من الشركة المصنعة).
    1. تتوازن مزيج هلام الصبغة لRT لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
    2. وضع رقاقة الحمض النووي الجديد على محطة رقاقة فتيلة. ماصة 9 ميكرولتر من هلام الصبغة في G. جيدا ملحوظ
    3. تأكد من أن يتم وضع المكبس في 1 مل ثم قم بإغلاق محطة رقاقة فتيلة. الصحافة المكبس حتى يتم عقد من قبل مقطع حقنة. انتظر بالضبط لمدة 30 ثانية ثم حرر مقطع حقنة.
    4. الانتظار لمدة 5 ثوان. سحب ببطء مرة أخرى المكبس إلى 1 مل الموقف.
    5. فتح رقاقة محطة فتيلة وماصة 9 ميكرولتر من هلام الصبغة في كل من الآبار ملحوظ 'G'.
  5. تحميل Marker
    1. ماصة 5 ميكرولتر من علامة في جميع الآبار عينة 12 وفي سلم أيضا. لا تترك أي من هذه الآبار 13 فارغة.
  6. تحميل سلم والعينات.
    1. ماصة 1 ميكرولتر من سلم ال DNA إلى تميز جيدا مع علامة سلم.
    2. ماصة 1 ميكرولتر من عينة (الآبار المستخدمة) أو 1 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات (الآبار غير المستخدمة).
    3. وضع رقاقة أفقيا في محول ودوامة لمدة 1 دقيقة في 2400 دورة في الدقيقة.
    4. تشغيل رقاقة في bioanalyzer خلال 5 دقائق.
  7. تشغيل تحليل
    1. بدء bioanalyzer وجهاز كمبيوتر متصل. فتح البرنامج.
    2. فتح غطاء bioanalyzer ووضع رقاقة في حامل رقاقة (شريحة يناسب طريقة واحدة فقط). إغلاق الغطاء بعناية.
    3. في سياق صك البرنامج حدد "الكهربائي"> "dsDNA"> "DNA 7500". استعرض بادئة الملف الحالي من البرنامج أو تعديله.
    4. انقر على زر البداية موجودة في البرنامج. أدخل أسماء عينة في البرنامج. عندما يتم الانتهاء من تشغيل رقاقة (بعد حوالي 30 دقيقة) يظهر نهاية الرسالة تشغيل في البرنامج bioanalyzer.
    5. إزالة الشريحة وتنظيف الأقطاب من bioanalyzer وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

5. استنتاج التركيب الوراثي من الكهربائي الملف الشخصي

  1. تحميل البرنامج محل (البرنامج متاح بحرية من المؤلفين).
  2. بيانات الاستيراد إشارة إلى البرنامج محل: "ملف"> "استيراد بيانات المرجع"
  3. فتح الكهربائي تشغيل في سياق البيانات من البرنامج bioanalyzer. حدد ملف تعريف الكهربائي من عينة واحدة.
  4. تحقق من القمم ذات الصلة.
    1. استخدام البرنامج محل للتحقق من القمم ذات الصلة: "أدوات"> "يعني الإسفار". أدخل في مربع "الإسفار"وأشارت القيم مضان وحدات مضان (FU) لأنها يمكن أن تقرأ من برنامج bioanalyzer. إدراج 4 (3) قمم مع أعلى مضان في ترتيب تصاعدي ومفصولة بفواصل. مثال: 126130132137.
      ملاحظة: إذا لم يكن كل هذه القمم FU بالرمز البرنامج bioanalyzer، فإنها تحتاج إلى أن يقدر من خلال قراءة لهم للخروج من هذه المؤامرة.
  5. اضغط على زر "حساب". الذروة هي ذات الصلة إذا تجاوز مضان احظ قيمة معينة في مربع "ذروة ارتفاع الحد الأدنى".
  6. استدلال على التركيب الوراثي.
    1. إدراج في محل النص "قمم الإدخال (بي بي)" أحجام في بي بي من كل القمم ذات الصلة في ترتيب تصاعدي ومفصولة بفواصل. على سبيل المثال: 440.462.519.579.637.
      ملاحظة: إذا يشار ليس كل من هذه الأحجام الذروة من قبل البرنامج bioanalyzer، فإنها تحتاج إلى أن يقدر من خلال قراءة لهم للخروج من هذه المؤامرة.
  7. اضغط على زر "حساب".
  8. في القائمةمربع، والبحث عن الحد الأدنى المربعة مسافة Mahalanobis "D2M". إذا كانت قيمة P المقابلة الحق في ذلك هو ≥0.05 ثم احتمال هو ≥5٪ أن فرضية H باطل 0 تم رفض (H 0: لوحظ والتعريف إشارة متطابقة) وهذا يعني أن الشخصية احظ قبلت أن تكون مطابقة ل البيانات الشخصية المرجعية من النمط الجيني المشار إليه.
  9. إذا D2M هو الحد الأدنى لكن الحقل من قيمة P المقابلة فارغة، رفض H 0 مع وجود احتمال <5٪.
    ملاحظة: هذا يعني أن الشخصية هي غير متكافئة على الرغم من D2M هو الحد الأدنى. وقد يؤدي مثل هذه النتيجة من غير الظروف العادية الكهربائي.
    1. لتصحيح هذه الانحرافات، أدخل في مربع النص "لوحظ الذروة (بي بي)" قيمة 395 واضغط على زر "حساب". التحقق مرة أخرى لأدنى D2M و≥0.05 قيمة P المقابلة. إذا لم يكن ناجحا، حاول القيم 405، 415، و 425.
      ملاحظة: في بعض الأحيان خطوات أصغر، بل هيالمشار إليها. إذا كان لا يزال لم تكن ناجحة، والوضع احظ غير موجود في البيانات المرجعية، قد يكون من النمط الجيني الجديد أو البديل.
  10. لمحات مختلفة
    1. كرر الخطوات من 5،6-5،9 لكل ملف على حدة الكهربائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تعريف النمط الجيني ومشتقاته

ويعتبر ملف تعريف الكهربي مختلفة في الفرقة أكثر من واحد من كل المورثات التي تم تحديدها باعتبارها النمط الجيني الجديد. يتم تسمية المورثات جديدة وتمديد وفقا لفورنييه وآخرون. 5 المؤدية إلى المورثات GTA لGTZ، تليها المورثات GTAA إلى GTAZ، وGTBA إلى GTBZ، وGTCA إلى GTCC في الوقت الحاضر. ويعتبر الاختلاف في ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوة الأكثر أهمية الإجراء كله هو عندما يكون هناك فائض من الحمض النووي في RS-PCR (> 30 نانوغرام النقي DNA / الفحص) 2. بشكل عام، قرار من هذا التوصيف الأمثل إذا كان كل من مستويات الذروة التي بلغتها تبدأ وتنتهي عند خط الأساس. إذا قمتين متقاربة جدا، والقرار هو غير مكتمل. في ظل هذه الظروف، فإن البرنامج bioanalyzer قد يؤدي إلى تحديد الذروة غير مناسب بحيث يلزم تحديد اليدوي.

يتم تضمين كافة القمم فصل واضح و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلف R. Boss و A. Cosandey و C. Fournier و I. Ivanovic و J. Naskova على عملهم الممتاز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تريس (هيدروكسي ميثيل) -أمينوميثانميرك1.08382.0500ميغاواط = 121.14 جم / مول
تيتريبلكس الثالثميرك1.08418.0250ميغاواط = 372.24 جم / مول ؛ المادة تعادل Na2EDTA· 2H2< / sub>O
حمض الهيدروكلوريك 5 مول / لترميرك1.09911.0001
كولومبيا أجار + 5٪دم الأغنام bioM & eacute ؛ Rieux43049
Agilent DNA7500 KitAgilent Technologies5067-1504
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2940CA
Agilent 2100 expert sofwareAgilent Technologies
HotStarTaq master mix Qiagen203445
برايمر L1Mycrosinth5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1Mycrosinth5'GAA GTC GTA ACA AGG3'

المراجع

  1. Sears, P. M., McCarthy, K. K. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).
  2. Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
  3. Cosandey, A., et al. Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries. J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).
  4. Boss, R., et al. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer. J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).
  5. Graber, H. U., et al. Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties. J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).
  6. Heiniger, D., et al. Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben. Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).
  7. Hamann, J. Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition. IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).
  8. Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).
  9. Sakwinska, O., et al. Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley. Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).
  10. Rabello, R. F., et al. Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds. J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).
  11. Tavakol, M., et al. Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands. Acta Vet.Scand. 54, 28(2012).
  12. Harmsen, D., et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).
  13. Zadoks, R., et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).
  14. Cremonesi, P., et al. Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows. J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).
  15. Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تنميط Staphylococcus aureusطريقة RS-PCRالتهاب الضرع البقرياستخلاص الحمض النووي DNAتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل PCRالفصل الكهربائي المصغرنظام Bioanalyzerتحديد النمط الجينينمط جينات الضراوة
التنميط الجيني ل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.