يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنبيغ-زرع نموذج الفأر من مرض تكاثر نقوي

11.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54624

⸱

ديسمبر 22, 2016

 ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, University of California, Irvine

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المخطوطة وصفا للمنهجية المستخدمة لإنشاء نماذج فأر التحويل والزرع. يتم تقديم وصف مفصل للأخطاء الفنية التي يجب تجنبها عند إجراء عمليات زرع نخاع العظم. يجب اكتساب فهم واضح لأهمية ارتفاع عيار الفيروس ، والتعدي / التنبيغ ، والتشعيع.

الملخص

زرع التنبيغ هو طريقة سريعة وفعالة لنمذجة الأورام الخبيثة الدموية البشرية في الفئران. ينتج عن هذه التقنية التعبير عن الجين المهم في الخلايا المكونة للدم ويمكن استخدامها لدراسة دور الجين في تكون الدم الطبيعي و / أو الخبيث. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا حول كيفية إجراء عملية نقل التنبيغ باستخدام طفرات الكالريتيكولين (CALR) التي تم تحديدها مؤخرا في الورم التكاثري النقوي (MPN) كمثال. في هذا البروتوكول ، يتم نقل خلايا نخاع العظم الكامل من الفئران المانحة المعالجة 5-flurouracil (5-FU) بفيروس قهقري يشفر CALR الطافرة وزرعها في مضيفين متجانسين معرضين للإشعاع المميت. يتم تمييز الخلايا المانحة التي تعبر عن CALR المتحور ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). تطور الفئران المزروعة نمطا ظاهريا ل MPN بما في ذلك الصفائح الدموية المرتفعة في الدم المحيطي ، وتوسع الخلايا الضخمة في نخاع العظام ، وتليف نخاع العظم. نحن نقدم وصفا خطوة بخطوة لكيفية توليد الفيروسات القهقرية ، وحساب العيار الفيروسي ، وتحويل خلايا نخاع العظم الكاملة ، وزرعها في الفئران المتلقية المشععة.

المقدمة

تنبيغ الزرع هو طريقة مفيدة لنموذج الأورام الخبيثة الدموية في الفئران. وكانت هذه التقنية قيمة خاصة لدراسة الأورام الخبيثة النخاعي التي يعود تاريخها إلى اول دليل على ان التعبير خارج الرحم من BCR-ABL1 يمكن أن ألخص بأمانة ابيضاض الدم النقوي المزمن في الفئران 1. وقد سهلت هذه التقنية فيما بعد دراسة مستفيضة من JAK2 V617F وMPL W515K / L تحور مرض تكاثر نقوي (MPN).

مبن مجموعة من الأورام الخبيثة الدموية التي تتميز الافراط في خلايا الدم النخاعي ناضجة وتليف نخاع العظام. تنشأ هذه الأمراض عموما من توسع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم الذي حصل طفرة جسدية في أي JAK2، MPL، أو CALR. تنبيغ-زرع JAK2 V617F وMPL W515K / نماذج L معرض المظاهر السريرية فيرا كثرة الحمر وتليف النقي 2-5 </ سوب>. في الآونة الأخيرة، كما تم إنشاء نموذج الفأر من-تحور calreticulin مبن مع أسلوب التنبيغ الزرع 6. هذه الفئران تطوير مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع زيادة الصفائح الدموية، وزيادة عدد الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. معا، وقد وفرت هذه النماذج ليس فقط الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على المرضية الجزيئية من مبن، ولكن أيضا القدرة على تطوير ودراسة العلاجات في أجواء ما قبل السريرية.

توفر هذه المخطوطة وصفا مفصلا لمنهجية التنبيغ الزرع مع التركيز على طفرة CALRdel52. تتضمن هذه التقنية زرع خلايا نخاع العظام transduced retrovirally معربا عن متحولة بناء في الفئران المتلقي مسانج المشع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة وتنفيذها وفقا لتوصيات لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كاليفورنيا في ايرفين. تم تنفيذ كافة الإجراءات تحت التخدير الأيزوفلورين وبذلت كل الجهود للحد من المعاناة.

1. توليد Ecotropic الارتجاعي

  1. إعداد البلازميدات ذات جودة عالية مع تركيز لا يقل عن 1 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام مجموعة ماكسي الإعدادية التجارية أو تنقية كلوريد السيزيوم.
    ملاحظة: وتشمل ناقلات MSCV العمود الفقري ترميز الجينات في المصالح (في هذه الحالة CALR 7،8) وعلامة الاختيار (GFP، النيو، الخ) وكذلك البلازميد التعبئة والتغليف ecotropic، ترميز هفوة-بول-الحياة الفطرية (المشار هنا البلازميد).
  2. ذوبان الجليد وتوسيع-مرور منخفض خلايا 293T في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS ولام الجلوتامين مع البنسلين / الستربتومايسين (D10). لوحة 5 × 10 6 الخلايا في الأنسجة طبق المعالجة ثقافة 10 سم في ترطيبنسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  3. توسيع الخلايا 293T في الثقافة. في اليوم قبل ترنسفكأيشن، وغسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني وطاف نضح في قارورة فراغ.
  4. يعرض للتريبسين الخلايا، إضافة 2 مل 0.05٪ التربسين واحتضان الأطباق في نسيج الثقافة الحاضنة ترطيب ل2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. لوقف trypsinization، إضافة D10 3 مل لطبق ونقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تدور الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  6. نضح طاف في قارورة فراغ و resuspend بيليه خلية في 2 مل D10.
  7. عدد الخلايا عن طريق الأزرق الاستبعاد التريبان باستخدام عدادة الكريات.
  8. البذور 2 × 10 6 خلايا في طبق إلى ثلاثة الأنسجة أطباق المعالجة ثقافة 10 سم في الفيروس الذي تم إنشاؤه.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا تسمح للخلايا تتجاوز 30-50٪ التقاء في وقت ترنسفكأيشن أو يمكن الحصول على عائد فيروس الفقراء.
  9. على الفور قبل ترنسفكأيشن،وسائل الاعلام نضح في قارورة فراغ واستبدالها مع 5 مل D10 جديدة.
  10. لكل 10 سم طبق بتري أن transfected إعداد العقيمة أنبوب microcentrifuge 1.5 مل الفردي.
  11. ماصة 760 ميكرولتر من تخفيض وسائل الاعلام المصل في كل أنبوب microcentrifuge، ثم يضاف بعناية 40 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مباشرة إلى وسائل الإعلام. احتضان الأنابيب في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  12. إضافة 30 ميكروغرام من ناقلات MSCV مع الجين (15 ميكروغرام في حالة استخدام ناقلات فارغة)، فضلا عن 5 ميكروغرام البلازميد إلى كل أنبوب منها والمزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. يحضن في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة إضافية.
    ملاحظة: ناقلات أصغر تميل إلى أن تكون عائدات الفيروسية أعلى.
  13. بعناية إضافة الحجم الكلي لكل من رد فعل (حوالي 800 ميكرولتر) قطرة من الحكمة في كل منها 10 سم طبق بتري وإمالة بلطف طبق من جانب إلى آخر لخلط. عودة الخلايا إلى مكعب الأنسجة مرطبحاضنة lture.
  14. بعد ساعة 8 أو الحضانة بين عشية وضحاها في نسيج الثقافة الحاضنة، ووسائل الإعلام نضح في قارورة فراغ وبلطف استبدال مع 10 مل من D10 جديدة.
  15. في 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن جمع طاف في حقنة 35 مل وتصفية من خلال 0.45 ميكرون غشاء لإزالة الحطام الخلية.
  16. يمكن حصادها مكان 10 مل D10 جديدة مرة أخرى على خلايا 293T وفيروس إضافية في 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن: اختياري.
  17. التخلص من الخلايا 293T في نفايات بيولوجية عندما يتم جمع أي فيروس إضافية.
  18. طاف الفيروسي قسامة في أحجام تستخدم مرة واحدة (على سبيل المثال 1 مل لعيار الفيروس أو 6.5 مل للعدوى BM). فيروس فلاش التجميد بالنيتروجين السائل وفيروس مخزن في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب تكرار دورات تجميد / الذوبان كما أنها تقلل إلى حد كبير عيار الفيروس.

2. تحديد عيار الفيروسية النسبي بواسطة التدفق الخلوي

  1. ذوبان الجليد 3T3 الخلايا والحفاظ في D10. ثقافة الخلايا في 10 سمالأنسجة الثقافة تعامل طبق في نسيج الثقافة حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. أداء عيار الفيروسية في ثلاث نسخ. لإعداد الخلايا، وغسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني وطاف نضح في قارورة فراغ.
  3. يعرض للتريبسين الخلايا، إضافة 2 مل 0.05٪ التربسين واحتضان الأطباق في نسيج الثقافة حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  4. لوقف trypsinization، إضافة D10 3 مل لطبق ونقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تدور الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  5. نضح طاف في قارورة فراغ و resuspend بيليه خلية في 2 مل D10.
  6. عدد الخلايا عن طريق الأزرق الاستبعاد التريبان باستخدام عدادة الكريات.
  7. البذور 3T3 الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 5 الخلايا في الأنسجة خمسة عشر أطباق المعالجة ثقافة 60 ملم واحتضان بين عشية وضحاها.
  8. جعل 1: 3، 01:10، 01:30 و 1: 100 التخفيفات من طاف الفيروسي إذابة باستخدام D10 في مجموعه 1 مل. تشمل أيضا التحكم خالية من الفيروسات.
  9. نضح ليديا من 3T3 الخلايا في قارورة فراغ واستبدالها مع 4 مل من D10.
  10. تراكب الخلايا 3T3 مع التخفيفات من طاف الفيروسي وإضافة polybrene إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل إلى كل طبق. احتضان لمدة 48 ساعة في نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  11. تحديد عيار الفيروسية النسبي التدفق الخلوي:
    1. لغسل الخلايا، ونضح وسائل الإعلام في قارورة فراغ وإضافة 5 مل برنامج تلفزيوني.
    2. نضح في برنامج تلفزيوني في قارورة فراغ. إضافة 1 مل 0.05٪ التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة لفصل الخلايا من الطبق.
    3. إضافة 3 مل D10 وماصة صعودا وهبوطا لفصل أي الخلايا المتبقية من لوحة. نقل الخلايا إلى أنبوب FACS وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
    4. صب طاف وغسل الخلايا مع 3 مل برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، وطاف صب. resuspend في 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
    5. خلايا تعمل على تدفق عداد الكريات 9. جمع بين 20،000 - 30،000 الأحداث داخل رعاش بوابة الخلية (التي يحددها FSC مقابل SSC) وحساب نسبة GFP + وGFP - الخلايا.
      ملاحظة: يعتبر عيار الفيروسية مقبول عند التخفيف 1:30 من عائدات طاف الفيروسية لا يقل عن 50٪ GFP + 3T3 الخلايا. إذا ثم يمكن الحصول على هذه النتائج التخفيف في أقل من 50٪ GFP + الخلايا النتائج التنبيغ دون المستوى الأمثل. تم تعديل الحساب لتحديد عيار الفيروسية من ليمون وآخرون. ، الدم (1997) 9.
    6. لتحديد عيار الفيروس النسبي، استخدم المعادلة: عيار الفيروس = الجسيمات تشكيل وحدات (PFU) / مل = [(عدد 3T3 الخلايا × التردد من GFP + الخلايا) / حجم (مل) طاف] × التخفيف عامل.

3. تنبيغ المانحة خلايا نخاع العظم

  1. لإعداد الفئران المانحة لنخاع العظم (BM) الحصاد، أول تخدير الفئران عن طريق المرذاذ الأيزوفلورين مع معدل تدفق إضافي 5٪ جنبا إلى جنبالأكسجين في 1 لتر / دقيقة. قرصة القدم لتقييم الاستجابة.
    ملاحظة: الفئران المانحة (أقل من 8 أسابيع من العمر) يجب أن تكون مستعدة قبل 5 أيام الحصاد نخاع العظم (8 أيام قبل الزرع). وسيكون أحد الفئران المانحة توفير ما يكفي من الخلايا لا يقل عن 2 المتلقين.
  2. حقن 150 ملغ / كغ 5 فلورويوراسيل (5-FU) عن طريق الحقن الرجعية المدارية في الفئران تخدير باستخدام 27 G × ½ "إبرة.
    الحذر! 5-FU وكيل العلاج الكيميائي لمكافحة السرطان. التعامل دائما 5-FU داخل شهادة غطاء الدخان الكيميائية أو خزانة أنبوبي السلامة الأحيائية. التشاور مع لجنة سلامة المختبرات والحيوان المؤسسة لتحديد وضع العلامات المناسبة من الفئران التي عولجت مع 5-FU.
    1. ضع الماوس تخدير على جانبها وكبح جماح باستخدام كل من الإبهام والسبابة بحيث العين يبرز قليلا من الرأس.
    2. بدءا من جانبي الإبرة إلى الموق الإنسي ومع شطبة مواجهة، أدخل الإبرة في 45° زاوية في اتجاه وسطي، ووقف عند إدخال الإبرة في منتصف الطريق. ببطء حقن الخلايا وإزالة إزالة بعناية إبرة.
      ملاحظة: إذا تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح، يجب أن العين يتراجع قليلا، وينبغي أن يشعر أي مقاومة على إدخال الإبرة.
    3. دراسة الماوس عن أي دلائل على الإصابة مثل تورم أو نزيف.
  3. حصاد نخاع العظام 5 أيام بعد 5-FU العلاج (قبل 3 أيام الزرع).
    1. تخدير الفئران عن طريق المرذاذ الأيزوفلورين مع معدل التدفق من 5٪ أكسجين جنبا إلى جنب في 1 لتر / دقيقة. قرصة القدم لتقييم الاستجابة.
    2. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. تعقيم الماوس عن طريق الرش بسخاء مع 70٪ ETOH حتى يصبح الفراء الرطب.
    3. باستخدام مقص تشريح، إجراء شق في الجلد وتشريح اللفافة بعيدا عن عضلات الساق. بعد ذلك، تشريح الساق بعيدا عن الماوس عن طريق قطع عظم الفخذ في الورك والساق في الكاحل.
    4. ينحنيالمحطة في شكل "L" وفصل كل عظم الساق عن طريق قطع عند مفصل الركبة مع مقص تشريح.
    5. لإزالة الغضروف في نهايات البعيدة كل عظم الساق، واستخدام مقص تشريح لكشط بلطف العضلات نحو واحدة من نهاية عظم الساق حتى يتم فض الاشتباك الغضروف.
    6. استخدام المحاقن مع 27 G س ½ بوصة إبرة، دافق كل عظم الساق مع برنامج تلفزيوني تستكمل مع 2٪ FBS على غشاء النايلون 100 ميكرومتر في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. عظم دافق حتى العظم يتحول الأبيض لزيادة عدد الخلايا التي تحصد.
    7. استخدام المكبس من حقنة لهرس الخلايا من خلال غشاء النايلون في أنبوب مخروطي 50 مل للحصول على تعليق خلية واحدة. كرر مع الساق الماوس الأخرى.
  4. خلايا الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 400 x ج وتجاهل طاف. و resuspend BM في مل البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم (ACK) عازلة 5 إلى ليز خلايا الدم الحمراء. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  5. ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني لوقف تحلل الخلية. Centriخلايا fuge في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 400 x ج وتجاهل طاف. كرر الخطوة تحلل إذا كان بيليه BM لديه لون أحمر.
  6. resuspend في 5 مل برنامج تلفزيوني والعد الخلايا عن طريق الأزرق الاستبعاد التريبان باستخدام عدادة الكريات.
  7. Resuspend الخلايا في 2 × 10 6 خلايا للمتر مع 2X كوكتيل قبل STIM التي تحتوي على DMEM تستكمل مع 20٪ FBS، L-الجلوتامين، البنسلين / الستربتومايسين، IL-3 (14 نانوغرام / مل)، IL-6 (24 نانوغرام / مل)، وصندوق إنقاذ الطفولة (112 نانوغرام / مل). لوحة 2 مل لكل بئر في 6 لوحات جيدة.
  8. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  9. إضافة 2 مل من طاف الفيروسي لاحتواء جيدا كل الخلايا BM وإضافة polybrene (8 ميكروغرام / مل). لوحات تدور عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في 1500 x ج ثم يعود لوحة الحاضنة زراعة الأنسجة بين عشية وضحاها.
  10. ماصة تعليق خلية في أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 400 x ج، لا تجاهل لوحة. Resuspend الخلايا في 2 مل جديدة 2X كوكتيل قبل STIM لكل بئر والعودة إلى الآبار الأصلية.
  11. إجراء spinoculation 2 الثانية بتكرار الخطوات 3،7-3،9.

4. خلايا زرع المانحة في الفئران مستلم

  1. إعداد الفئران المتلقي مسانج للزرع مع جرعة قاتلة إجمالي إشعاع الجسم <قبل 24 ساعة إلى حقن الخلايا BM.
    ملاحظة: قاتلة تشعيع جرعة لBALB / ج الفئران عادة 800-900 CGY و1،000-1،200 CGY لC57B / 6 10. يتم تقسيم الجرعة عادة إلى جلستين من أشعة متباعدة على الأقل 3-4 ساعات بعيدا.
  2. استمر من الخطوة 3.11 الحصاد transduced الخلايا المانحة من 6 لوحات جيدا قبل pipetting بلطف طاف في أنابيب مخروطية. يغسل كل جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لجمع الخلايا المتبقية وإضافة إلى أنابيب مخروطية 50 مل.
  3. إضافة 0.5 مل من التربسين 0.05٪ إلى الآبار واحتضان عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 5 دقائق.
  4. إضافة 1 مل D10 إلى الآبار وفصل أي الخلايا المتبقية قبل pipetting لطيف. إضافة الخلايا إلى أنبوب منهاالصورة من الخطوة 4.2 و بيليه بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على 400 ز س.
  5. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على 400 ز س. resuspend في 5 مل برنامج تلفزيوني وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات التي كتبها استبعاد التريبان الأزرق.
    ملاحظة: إذا كان متجه لديها علامة GFP ثم تحديد النسبة المئوية للخلايا GFP إيجابية مع تدفق عداد الكريات.
  6. و resuspend 5 × 05-02 أكتوبر × 10 6 خلايا في 50-100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني للحقن في الفئران.
  7. حقن الخلايا عن طريق الحقن الرجعية المدارية في الفئران تخدير باستخدام معقم 27 G س ½ "إبرة.
    ملاحظة: تقنيات حقن أخرى تشمل الذيل الوريد، الطحال، أو الفخذ.
    1. تخدير الماوس باستخدام الأيزوفلورين وقرصة القدم لتقييم الاستجابة.
    2. ضع الماوس على جانبها وكبح جماح باستخدام كل من الإبهام والسبابة بحيث العين يبرز قليلا من الرأس.
    3. مع شطبة مواجها لها، تضاف نeedle الوحشي لحاظ وسطي بزاوية 45 درجة.
      ملاحظة: إذا تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح، يجب أن العين يتراجع قليلا، وينبغي أن يشعر أي مقاومة على إدخال الإبرة.
    4. دراسة الماوس عن أي دلائل على الإصابة مثل تورم أو نزيف.
      ملاحظة: التالي الفئران زرع يكون انخفاض تعداد الدم لعدة أسابيع وذلك عرضة للإصابة. الوقاية بالمضادات الحيوية أو استخدام المياه المحمضة يمكن استخدام.
  8. شهر واحد بعد زرع، وقياس GFP٪ في الدم المحيطي كمؤشر للخلايا المانحة المغروسة التدفق الخلوي.
    ملاحظة: GFP وحدها لا يمكن تحديد نجاح engraftment من الخلايا. قد فشلت تنبيغ الفيروسية بعد engraftment قد حدث. في هذه الحالة، سوف يتم الكشف عن أي GFP خلايا +، ولكن كان engraftment من الخلايا التي تم زرعها بنجاح.
    1. يستغرق 10 ميكرولتر من الدم الطرفية بذ ثقب الوريد الصافن الساق مع 21 G × 1 ½ "حقنة وإضافته إلى 100 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني لمنع تجلط الدم.
    2. إضافة 1 مل ACK إلى الدم وليز على الجليد لمدة 10 دقيقة. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
    3. نضح طاف في قارورة فراغ وإضافة 1 مل PBS تستكمل مع 2٪ FBS لوقف تحلل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
    4. نضح طاف في قارورة فراغ وبيليه resuspend في 100 ميكرولتر PBS تستكمل مع FBS 2٪.
    5. تشغيل العينات على تدفق عداد الكريات وجمع 300،000 ضمن فعاليات بوابة الخلية الحية (التي يحددها FSC مقابل SSC) وحساب نسبة GFP + وGFP - خلايا 9.
  9. بالإضافة إلى ذلك في 1 الشهر بعد الزرع، نفذ تعداد الدم الكامل (CBC) باستخدام الآلي البيطري أمراض الدم محلل 18 لمراقبة تطور المرض.
    ملاحظة: مواصلة رصد المرض٪GFP في الدم المحيطي وCBC شهريا.
  10. لإنهاء التجربة، تخدير الماوس باستخدام الأيزوفلورين وقرصة القدم لتقييم الاستجابة. تضحية الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم والطحال ونخاع العظام حصاد لأمراض الأنسجة.
    ملاحظة: طول التجربة الذاتية وينبغي تقييم تاريخ الإنهاء على أساس النمط الظاهري المرض المتوقع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نتائج تقنية التنبيغ الزرع في إعادة المكونة للدم من الفئران المتلقي مع الخلايا معربا عن الجينات في المصالح. ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن نموذج الفأر التنبيغ-زرع calreticulin تحور MPN. لفترة وجيزة، الارتجاعي معربا عن CALRwt أو CALRdel52 يستخدم لتصيب الخلايا BM من الماوس المانحة C57B / 6. يتم زرع خلايا Transduced في المشع C57B / 6 الماوس المتلقي والخلايا المانحة engraftment يحدث خلال الشهر الأول بعد زرع. أدلة على وجود النمط الظاهري يصبح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية إجراء عمليات زرع نخاع العظام في الفئران أن ألخص مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع التقدم إلى تليف النقي مع CALRdel52 طفرة باعتباره المحرك من المرض. زراعة ناجحة من الخلايا معربا عن النتائج CALRdel52 في زيادة الصفائح الدموية، وتوسيع الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. كما زرع نخاع العظام هي عملية متعددة الخطوات، من المهم أن نعترف الخطوات التي يمكن تجنبها خطأ فني لمنع engraftment الفقراء من الخلايا معربا عن الجينات في المصالح أو حتى الموت ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

هذا العمل مدعوم من قبل V Foundation Scholar (AGF) ومؤسسة أبحاث MPN (AGF).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<خطوط خلايا > قوية < / قوية >
DMEMكورنينجMT-10-013-CV
293T خلاياATCCCRL-11268
خلايا 3T3ATCCCRL-1658
< قوية > البلازميدات < / قوية >
EcoPak ، والمعروفة أيضا باسم pCL-EcoAddgene12371يمكن استخدام خطوط خلايا التعبئة والتغليف الفيروسية القهقرية ، مثل EcoPack 2-293 ، بدلا من بلازميد EcoPak وخلايا 293T القياسية. تتوفر بلازميدات تغليف وتغليف إضافية من "جاما؛-الفيروسات القهقرية من Addgene وغيرها.
MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene20672بلازميدات نقل الفيروسات القهقرية الإضافية من Addgene وغيرها.
<مستهلكات قوية> مستهلكات< / قوية>
27 جم × 1/2 بوصة إبرBD305620
مصل الأبقار الجنينيCorningMT-35-010-CV
البنسلين / الستربتومايسين / L-الجلوتامينCorningMT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0.05٪)CorningMT-25-052-CIيمكن أن يكون PBS محلي الصنع
أطباق CorningMT-21-031-CV
10 سمفيشر172931
15 مل أنابيب مخروطيةفيشر12565268
أطباق 60 ممفيشر150288
بوليبرينفيشر NC9840454
5-FUفيشرA13456-06
100 & # 181; مصافي الخلية mفيشر22363549
50 مل أنابيب مخروطيةفيشر12565270
6 آبارفيشر130184
أنابيب FACSفيشر14-959-5
0.45 & مرشحات المحقنة mفيشر0974061B
Opti-MEMGibco31985-070
ACK bufferLonza10-548Eيمكن أن يكون الفأر المؤتلف محلي الصنع
IL-3Peprotech213-13
الفأر المؤتلف IL-6Peprotech216-16
الفأر المؤتلف SCFPeprotech250-03
X-tremeGENE 9Roche6365809001كاشف النعداء
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1615-5500
<قوي>المعدات< / قوي>
BD أككوري C6
الأشعة
تتوفر السينية

المراجع

  1. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
  2. Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
  3. Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
  4. Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18(2006).
  5. Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
  6. Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
  7. Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  8. Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
  9. Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
  10. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
  11. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  12. Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
  13. Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
  14. Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
  15. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  16. Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
  17. Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. Myeloproliferative neoplasm animal models. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).
  18. Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

GFP 5 FU
تنبيغ-زرع نموذج الفأر من مرض تكاثر نقوي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.