تقدم هذه المخطوطة وصفا للمنهجية المستخدمة لإنشاء نماذج فأر التحويل والزرع. يتم تقديم وصف مفصل للأخطاء الفنية التي يجب تجنبها عند إجراء عمليات زرع نخاع العظم. يجب اكتساب فهم واضح لأهمية ارتفاع عيار الفيروس ، والتعدي / التنبيغ ، والتشعيع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
زرع التنبيغ هو طريقة سريعة وفعالة لنمذجة الأورام الخبيثة الدموية البشرية في الفئران. ينتج عن هذه التقنية التعبير عن الجين المهم في الخلايا المكونة للدم ويمكن استخدامها لدراسة دور الجين في تكون الدم الطبيعي و / أو الخبيث. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا حول كيفية إجراء عملية نقل التنبيغ باستخدام طفرات الكالريتيكولين (CALR) التي تم تحديدها مؤخرا في الورم التكاثري النقوي (MPN) كمثال. في هذا البروتوكول ، يتم نقل خلايا نخاع العظم الكامل من الفئران المانحة المعالجة 5-flurouracil (5-FU) بفيروس قهقري يشفر CALR الطافرة وزرعها في مضيفين متجانسين معرضين للإشعاع المميت. يتم تمييز الخلايا المانحة التي تعبر عن CALR المتحور ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). تطور الفئران المزروعة نمطا ظاهريا ل MPN بما في ذلك الصفائح الدموية المرتفعة في الدم المحيطي ، وتوسع الخلايا الضخمة في نخاع العظام ، وتليف نخاع العظم. نحن نقدم وصفا خطوة بخطوة لكيفية توليد الفيروسات القهقرية ، وحساب العيار الفيروسي ، وتحويل خلايا نخاع العظم الكاملة ، وزرعها في الفئران المتلقية المشععة.
المقدمة
تنبيغ الزرع هو طريقة مفيدة لنموذج الأورام الخبيثة الدموية في الفئران. وكانت هذه التقنية قيمة خاصة لدراسة الأورام الخبيثة النخاعي التي يعود تاريخها إلى اول دليل على ان التعبير خارج الرحم من BCR-ABL1 يمكن أن ألخص بأمانة ابيضاض الدم النقوي المزمن في الفئران 1. وقد سهلت هذه التقنية فيما بعد دراسة مستفيضة من JAK2 V617F وMPL W515K / L تحور مرض تكاثر نقوي (MPN).
مبن مجموعة من الأورام الخبيثة الدموية التي تتميز الافراط في خلايا الدم النخاعي ناضجة وتليف نخاع العظام. تنشأ هذه الأمراض عموما من توسع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على هذه الدراسة وتنفيذها وفقا لتوصيات لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كاليفورنيا في ايرفين. تم تنفيذ كافة الإجراءات تحت التخدير الأيزوفلورين وبذلت كل الجهود للحد من المعاناة.
1. توليد Ecotropic الارتجاعي
- إعداد البلازميدات ذات جودة عالية مع تركيز لا يقل عن 1 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام مجموعة ماكسي الإعدادية التجارية أو تنقية كلوريد السيزيوم.
ملاحظة: وتشمل ناقلات MSCV العمود الفقري ترميز الجينات في المصالح (في هذه الحالة CALR 7،8)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نتائج تقنية التنبيغ الزرع في إعادة المكونة للدم من الفئران المتلقي مع الخلايا معربا عن الجينات في المصالح. ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن نموذج الفأر التنبيغ-زرع calreticulin تحور MPN. لفترة وجيزة، الارتجاعي معربا عن CALRwt أو CALRdel52 يستخدم لتصيب الخلايا BM من الماوس المانحة C57B / 6. يتم زرع خلايا Transduced في المشع C57B / 6 الماوس المتلقي والخلايا المانحة engraftment يحدث خلال الشهر الأول بعد زرع. أدلة على وجود النمط الظاهري يصبح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية إجراء عمليات زرع نخاع العظام في الفئران أن ألخص مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع التقدم إلى تليف النقي مع CALRdel52 طفرة باعتباره المحرك من المرض. زراعة ناجحة من الخلايا معربا عن النتائج CALRdel52 في زيادة الصفائح الدموية، وتوسيع الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. كما زرع نخاع العظام هي عملية متعددة الخطوات، من المهم أن نعترف الخطوات التي يمكن تجنبها خطأ فني لمنع engraftment الفقراء من الخلايا معربا عن الجينات في المصالح أو حتى الموت .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
هذا العمل مدعوم من قبل V Foundation Scholar (AGF) ومؤسسة أبحاث MPN (AGF).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <خطوط خلايا > قوية < / قوية > | |||
| DMEM | كورنينج | MT-10-013-CV | |
| 293T خلايا | ATCC | CRL-11268 | |
| خلايا 3T3 | ATCC | CRL-1658 | |
| < قوية > البلازميدات < / قوية > | |||
| EcoPak ، والمعروفة أيضا باسم pCL-Eco | Addgene | 12371 | يمكن استخدام خطوط خلايا التعبئة والتغليف الفيروسية القهقرية ، مثل EcoPack 2-293 ، بدلا من بلازميد EcoPak وخلايا 293T القياسية. تتوفر بلازميدات تغليف وتغليف إضافية من "جاما؛-الفيروسات القهقرية من Addgene وغيرها. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | بلازميدات نقل الفيروسات القهقرية الإضافية من Addgene وغيرها. |
| <مستهلكات قوية> مستهلكات< / قوية> | |||
| 27 جم × 1/2 بوصة إبر | BD | 305620 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Corning | MT-35-010-CV | |
| البنسلين / الستربتومايسين / L-الجلوتامين | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05٪) | Corning | MT-25-052-CI | يمكن أن يكون PBS محلي الصنع |
| أطباق Corning | MT-21-031-CV | ||
| 10 سم | فيشر | 172931 | |
| 15 مل أنابيب مخروطية | فيشر | 12565268 | |
| أطباق 60 مم | فيشر | 150288 | |
| بوليبرين | فيشر NC9840454 | ||
| 5-FU | فيشر | A13456-06 | |
| 100 & # 181; مصافي الخلية m | فيشر | 22363549 | |
| 50 مل أنابيب مخروطية | فيشر | 12565270 | |
| 6 آبار | فيشر | 130184 | |
| أنابيب FACS | فيشر | 14-959-5 | |
| 0.45 & مرشحات المحقنة m | فيشر | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | يمكن أن يكون الفأر المؤتلف محلي الصنع |
| IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| الفأر المؤتلف IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| الفأر المؤتلف SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | كاشف النعداء |
| 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1615-5500 | |
| <قوي>المعدات< / قوي> | |||
| BD أككوري C6 | |||
| الأشعة |
المراجع
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
