مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

يتيح الفصل الفعال لمجموعة الخلايا المفضلة من الخلايا الأخرى إجراء دراسات للسكان قد لا تكون ممكنة بخلاف ذلك. فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) هو طريقة لإثراء مجموعة خلايا مثيرة للاهتمام بنقاوة عالية. ^1،2 عادة ما تعبر أنواع الخلايا المختلفة عن جزيئات فريدة ، أو مزيج فريد من عدة جزيئات ، على غشاء البلازما الذي يمكنه التمييز بين مجموعة خلايا واحدة وأخرى. عند ربط جزيئات سطح الخلية هذه بأجسام مضادة مترافقة محددة بالفلورة ، فإن آلة الكشف تسمى مقياس التدفق الخلوي / الفرز قادرة على إثارة واكتشاف الإشارات الضوئية للأصباغ الفلورية المختلفة التي تمثل علامات جزيئية مختلفة على الخلايا على مستوى الخلية الواحدة. تحدد المعلومات المجمعة التي تتكون إما من وجود إشارة ضوئية (تمثل تعبيرا إيجابيا عن جزيء السطح المقابل) أو عدم وجود إشارة ضوئية (تمثل تعبيرا سلبيا عن جزيء) النمط الظاهري للخلية. بعد المرور عبر الكاشف ، يتم تحويل الخلايا التي لها نفس النمط الظاهري ذي الأهمية نحو أنبوب تجميع مخصص يعتمد على الشحنة الكهربائية.

FACS على نطاق واسع في دراسات مختلفة طالما تم تصنيف السكان المراد إثرائهم بالفلورة. ^3-7 تم استخدامه لفصل البكتيريا المطلية بالغلوبولين المناعي (Ig) A عن البكتيريا غير المغلفة ب IgA في ميكروبات الأمعاء ⁸ وفرز مجموعات الخلايا المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت. ⁹ الأهم من ذلك ، أن لديها القدرة على فصل أكثر من مجموعة سكانية واحدة في وقت واحد ، مما لا يوفر الوقت والكواشف فحسب ، بل يسمح أيضا بتصميمات دراسة أكثر تعقيدا. ¹⁰ ومع ذلك، فإن نظام مراقبة الأصول الميدانية له أيضا حدوده. إذا كان عدد السكان محل الاهتمام نادرا جدا (أقل من 1٪) ، فقد تنخفض كفاءة الفرز ، مما يتسبب في فقدان كبير للخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي بعض ارتباط الأجسام المضادة إلى تنشيط نقل الإشارة داخل الخلايا الذي يؤدي إلى تغييرات وظيفية لمجموعة الخلايا المصنفة. ¹¹ لذلك ، يجب اختيار النمط الظاهري المستخدم للفرز بعناية.

توجد طرق أخرى إلى جانب FACS تعتمد أيضا على علامات سطح الخلية لإثراء مجموعات خلايا معينة ، مثل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MCS). ¹² على غرار FACS ، يمكن للأجسام المضادة المترافقة بالخرز المغناطيسي أن تستهدف جزيئات سطح خلية معينة. عند تفاعل الجسم المضاد والمستضد ، يمكن فصل الخلايا المطلية بالخرز المغناطيسي عن الخلايا غير المطلية بعد المرور عبر مجال مغناطيسي. ومع ذلك ، يمكن استهداف عدد محدود فقط من الجزيئات في MCS ، حيث أن الخرزات المغناطيسية ، على عكس ألوان الفلورسنت المختلفة في FACS ، لا يمكن تمييزها. وبالتالي يصعب على MCS تحديد نمط ظاهري للخلية بمزيج معقد من علامات السطح. ^13،14 بالإضافة إلى ذلك ، فإن MCS قادر أيضا على التسبب في تنشيط غير مقصود للخلايا المستهدفة.

في دراساتنا لنموذج فأر الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ، ¹⁵ كنا نعتزم تنقية الخلايا المتغصنة البلازمية (pDC) للتحقيق في تغيراتها الوظيفية مع تطور المرض. استخدمنا MCS لأول مرة لإثراء pDC من نخاع العظم عن طريق استهداف PDCA-1 ، وهو جزيء يتم التعبير عنه بشكل كبير وفريد على pDC الفئران في حالة مستقرة. ¹⁶ ومع ذلك ، كان نقاء الخلية منخفضا بشكل غير متوقع ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تنظيم PDCA-1 على مجموعات الخلايا الأخرى في بيئة التهابية مثل الذئبة الحمراء. ¹⁶ في النهاية ، استخدمنا FACS مع مزيج من أربع علامات سطحية (CD11c و CD11b و B220 و PDCA-1) لفصل pDC عالي النقاء مثل CD11c + CD11b-B220 + PDCA-1 +. الفئران pDC لديه علامة سطح محددة أخرى Siglec-H. قررنا عدم استخدام Siglec-H ، حيث أن ارتباط الجسم المضاد لهذا الجزيء يثبط وظيفة pDC لإنتاج IFNα. ¹¹

ملاحظة: MRL / MP-فاس ^لبر (MRL / لبر) كانت ولدت الفئران المعرضة للمرض الذئبة وصيانتها في منشأة معينة خالية من مسببات الأمراض التالية متطلبات رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC) في عدد فرجينيا للتكنولوجيا (الحيوان ضمان الرفاه: A3208-01). وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وأجريت التجارب على الحيوانات فقط تحت IACUC بروتوكول # 12-062.

1. خلية ثقافة متوسطة والفرز العازلة

1. إعداد كامل مستنبت الخلية (C10) باستخدام RPMI 1640 تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري، 1 ملم البيروفات الصوديوم، 1٪ 100 MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 10 ملي HEPES، 55 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، 2 مم L-الجلوتامين و 100 U / مل البنسلين ستربتومايسين.
2. إعداد عازلة الفرز (HBSS الكامل) باستخدام محلول ملح 1X هانك المتوازن (HBSS) تستكمل مع 10 ملي HEPES 2.5 ملغ / مل ألبومين المصل البقري،0.05 ملي MgCl ₂ و 0.2 U / مل الدناز أولا

2. ماوس تشريح

1. إعداد طبقين قطرها 6 سم، تحتوي على 4 مل C10. وضع الأطباق على الجليد.
2. الموت ببطء الماوس عن طريق CO ₂ الاستنشاق.
3. حصاد الطحال والحفاظ عليه في طبق مع C10 على الجليد.
   1. دبوس الماوس لأسفل مع بطن مواجهة على لوحة التشريح. تعقيم الجسم عن طريق رش 70٪ من الإيثانول.
   2. قطع الجلد وفصل الجلد عن جدار عضلة تحت على طول خط الوسط بطني من الارتفاق العانة في الرقبة.
   3. قطع الجلد على طول أطرافه الخلفية من شق الأول إلى الكاحل.
   4. دبوس الجلد مرة أخرى على الجانبين وقطع الجدار العضلي على طول الجانبين من مكان الشق الأول إلى الحجاب الحاجز.
   5. دبوس الجدار العضلي مرة أخرى على الجانب الأيمن من الرأس.
   6. حدد موقع الطحال على الجانب الأيمن من الماوس تحت الأمعاء الدقيقة وبجانب المعدة. التقاط واحدة من نهاية الالبريد الطحال وفصلها من المعدة.
4. قطع كل من أطرافه الخلفية بها، بما في ذلك عظم الفخذ والساق، وإزالة جميع العضلات قدر الإمكان.
   1. قطع العضلات على طول أطرافه الخلفية من الحوض مفصل الورك إلى الكاحل مع مقص حاد /، في محاولة لتجنب الأوعية الدموية.
   2. فصل أطرافهم هند بها قطع في الحوض / مفصل الورك ومفصل الكاحل / القدم دون التعرض لمحتويات نخاع العظام.
   3. العضلات المتبقية نظيفة على العظام بواسطة خدش بشفرة حلاقة مرارا وقطع العضلات في نقاط مشتركة.
5. إبقاء العظام في طبق 6 سم تحتوي على 4 مل C10 على الجليد. الشروع في تشريح الماوس المقبل.

3. خلية طحالية عزل

1. التجانس الطحال بلطف مع المكبس حقنة ضد مصفاة الخلية 70 ميكرومتر على رأس الطبق يحتوي على 4 مل C10 حتى لا قطعة حمراء واضحة.
2. إضافة إضافي C10 6 مل في طبق من خلال مصفاة لالثانية ثم نقل الكلي تعليق خلية 10 مل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
3. أجهزة الطرد المركزي أنبوب مخروطي الشكل في 800 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية.
4. بعد الطرد المركزي، ونضح طاف و resuspend بيليه خلية في 2 مل 1 × خلية الدم الحمراء (RBC) العازلة تحلل. في احتضان RT لمدة 5 دقائق.
5. بعد الحضانة، وأجهزة الطرد المركزي أنبوب مخروطي الشكل في 800 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية.
6. بعد الطرد المركزي، ونضح طاف و resuspend بيليه خلية في 1 مل C10. تجاهل أي كتل كبيرة (الخلايا الميتة) والحفاظ على أنبوب على الجليد في وقت لاحق.
   ملاحظة: إذا كان هناك العديد من كتل صغيرة، استخدم مصفاة الخلية 70 ميكرومتر لتصفية تعليق الخلية مرة واحدة.
7. حساب عدد الخلايا مع الأزرق التريبان باستخدام عداد الخلية الآلي.

4. نخاع العظم عزل الخلايا

1. نقل العظام مع 4 مل C10 إلى بمدافع الهاون وإضافة 6 مل C10 إلى جعل حجم 10 مل C10 في المجموع.
2. كسر العظام برفق في هاون باستخدام ا ف بestle.
3. يحرك بلطف مع مدقة للافراج عن نخاع العظم إلى C10.
4. نقل مل C10 10 تحتوي على نخاع العظم في أنبوب مخروطي 50 مل على الجليد من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. إضافة C10 10 مل جديدة في هاون تزال تحتوي على العظام.
   ملاحظة: ماصة في محلول يحتوي على نخاع العظام صعودا وهبوطا عدة مرات قبل أن تمر عبر مصفاة إذا كتل حمراء واضحة.
5. كرر الخطوات من 4،2-4،4 مرتين. بعد غسل الماضي، يجب أن تظهر عظام بيضاء.
6. أجهزة الطرد المركزي ال 50 مل أنبوب مخروطي الشكل في 800 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية. وفي الوقت نفسه، وإعداد 5 مل جاهزة للاستخدام متوسطة الكثافة التدرج في 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية في RT.
7. بعد الطرد المركزي، ونضح وطاف resuspend الكرية خلية في 10 مل C10.
8. طبقة ببطء تعليق 10 مل خلية على رأس 5 مل التدرج الكثافة المتوسطة، والحفاظ على واجهة واضحة بين المرحلتين. ثم الطرد المركزي ال 15 مل أنبوب مخروطي الشكل في 1363 ز لمدة 30 دقيقة فيRT (20 ° C) مع مجموعة تسارع إلى 9 والتباطؤ النحو 0 (أو OFF الفرامل).
9. بعد الطرد المركزي، وإزالة كبار 8 مل من محلول بعناية وجمع معطف 2 مل الشهباء في واجهة (طبقة من الخلايا وحيدة النواة) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
10. إضافة C10 12 مل الجليد الباردة إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على خلايا وحيدة النواة نخاع العظام، وكأب وعكس عدة مرات لتخلط جيدا، ثم الطرد المركزي الأنبوب في 800 x ج لمدة 10 دقيقة، 4 درجات مئوية.

5. خلية تلطيخ السطح لنظام مراقبة الأصول الميدانية

1. تلطيخ عينة
   1. إعداد لمكافحة فأر CD16 / 32 الضد الحل (1-100 التخفيف في HBSS الكامل، 5 ميكروغرام / مل تركيز النهائي).
   2. بعد الطرد المركزي في خطوة 4.10، نضح في وطاف resuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر مكافحة فأر CD16 / 32 حل الأجسام المضادة لمنع التيسير على مستقبلات الخلايا وحيدة النواة. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
   3. إعداد ومضان مترافق الأجسام المضادة خليط (النملط-ماوس CD11c و-PE 1:40 التخفيف، ومكافحة فأر CD11b-APC-CY7 1:80 التخفيف، ومكافحة فأر PDCA-1-FITC 1:40 تخفيف ومكافحة فأر B220-V500 01:40 التخفيف في HBSS- كامل على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة في 100 الحجم النهائي ميكرولتر لكل عينة).
      ملاحظة: من المهم أن يعاير الأجسام المضادة قبل الاستخدام.
   4. بعد مرور فترة الحضانة 10 دقيقة في الخطوة 5.1.2، إضافة 4 مل الجليد الباردة HBSS-كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية لإزالة غير منضم لمكافحة فأر CD16 / 32.
   5. بعد الطرد المركزي، ونضح طاف و resuspend بيليه الخلية في 100 ميكرولتر مضان مترافق الأجسام المضادة الخليط. احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة في الظلام.
   6. بعد 15 دقيقة الحضانة، إضافة 4 مل الجليد الباردة HBSS-كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية لإزالة الأجسام المضادة مضان مترافق غير منضم.
   7. يعد حل تحميل FACS (500 نانوغرام / مل دابي في HBSS-كاملة).
   8. بعد الطرد المركزي في خطوة 5.1.6، نضح في وطاف resuspend الكرية الخلية في 500 μ؛ ل FACS حل التحميل. نقل تعليق خلية إلى 12 × 75 ملم جولة أنبوب أسفل (FACS أنبوب) والحفاظ على أنبوب على الجليد في الظلام حتى الفرز داخل 1 ساعة.
2. تلطيخ للتعويض
   1. تسمية 6 FACS الأنابيب كما PE، APC-CY7، FITC، V500، دابي أو غير ملوثين. splenocytes قسامة في 1 × 10 ⁶ خلية / أنبوب في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية، وأغسلها مع 4 مل HBSS-كاملة في 800 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدام الحمض النووي ملزم صبغ مضان، دابي، لتمييز الخلايا الحية من الخلايا الميتة. دابي يمكن أن تمر عبر غشاء البلازما من الخلايا الميتة (ولكن ليس من الخلايا الحية) وربط الحمض النووي الصبغي.
   2. نضح طاف و resuspend بيليه الخلية في 100 ميكرولتر HBSS الكامل.
   3. في كل أنبوب FACS المقابلة، إضافة واحد من الأجسام المضادة التالية: مكافحة فأر CD19-PE 1:40 التخفيف، ومكافحة فأر CD11b-APC-CY7 1:80 التخفيف، ومكافحة فأر PDCA-1-FITC 1:40 تخفيف أو مكافحة فأر B220-V500 01:40 التخفيف على النحو الموصى به من قبل manufacturer. ترك ^{الموافق} 5 (دابي) و 6 ^عشر (غير ملوثين) FACS الأنابيب كما هي. تخلط جيدا عن طريق هز واحتضان جميع أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية على الجليد في الظلام لمدة 15 دقيقة.
   4. بعد الحضانة، إضافة 4 مل الجليد الباردة HBSS الكامل في كل أنبوب وأنابيب الطرد المركزي نظام مراقبة الأصول الميدانية في 800 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية.
   5. بعد الطرد المركزي، ونضح طاف و resuspend بيليه الخلية في 500 ميكرولتر الجليد الباردة HBSS الكامل باستثناء بيليه في الأنبوب المسمى دابي، الذي هو معلق في 500 ميكرولتر FACS حل التحميل. حفظ جميع أنابيب 6 على الجليد في الظلام حتى الفرز.

6. الفرز على فارز الخلية

وموحدة عملية الفرز الإجراء على الكريات والبرامج مع تعليمات مفصلة التي تقدمها الشركة: ملاحظة. لفترة وجيزة، ونحن نستخدم 100 فوهة ميكرون في 20 رطل، تعيين تركيز الخلية المستهدفة بين 5-10٬000٬000 لكل مل، وضبط كفاءة إلى 70٪ أو أعلى (أي أبقى الصراعات تحت 30٪).

1. إعداد مجموعة أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية مع 500 ميكرولتر FBS / أنبوب يحتوي على 100 وحدة / مل البنسلين ستربتومايسين.
2. ضبط المعلمات تعويض فارز الخلية باستخدام أنابيب تعويضات وصمة عار واحدة من الخطوة 5.2.
   1. تسجيل 10000 خلايا في أنبوب غير ملوثين لوضع بوابة السلبية لكل كثافة الفلورسنت.
   2. تسجيل 10000 الخلايا في أنابيب تعويضات للبقع واحدة أخرى لوضع بوابة إيجابية لكل كثافة الفلورسنت.
      ملاحظة: البرنامج بحساب المعلمات تعويض تلقائيا.
3. استخدام عينة واحدة من الخطوة 5.1 لتعيين أبواب السكان الخلية فرزها عن طريق تسجيل 3000 الخلايا. باستخدام كثافة الفلورسنت كمعلمات X و Y الرسم البياني المحور، سكان الخلية البوابة الهدف يدويا كمجموعة من النقاط تفصل ما يبدو من النقاط الأخرى.
   ملاحظة: هذه مجموعة النابضة مرنة وتعسفي بناء على متطلبات الباحثين. إذا توقع الباحثون العالي النقاء بناء على علامات واحدة أو أكثر، نقل البوابةأعلى على أساس كثافة الفلورسنت المقابلة.
4. تحميل أنبوب جمع والبدء في فرز السكان الخلية المستهدفة.
5. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد بعد الفرز حتى تتم جميع أنابيب العينات.
6. إضافة الجليد C10 البرد إلى أنبوب جمع ما يصل إلى 4 مل، وكأب وعكس إلى المزيج.
7. أجهزة الطرد المركزي أنبوب جمع في 800 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية، ثم نضح طاف، وترك حوالي 200 ميكرولتر مع بيليه الخلية يمسها.
8. إضافة 1 مل C10 الجليد الباردة إلى resuspend الكرية خلية ونقل عن تعليق الخلية في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي.
9. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1.5 مل في 800 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية، ونضح طاف، وترك 100 ميكرولتر مع بيليه الخلية يمسها.
10. تخزين السكان الخلية مرتبة على الجليد حتى الاستخدام.

نحن تهدف إلى إثراء نخاع العظام PDC مع نقاء عالية، ودون تأثير من أنواع الخلايا الأخرى، من MRL / لبر الفئران المعرضة للمرض الذئبة كل من عمر الصغار والكبار لدراسة التغييرات الوظيفية من الحزب الديمقراطي المسيحي بشأن قدرتها على إنتاج IFNα. كانت استراتيجية تنقية الأولى التي استخدمت MCS، الذي قاد، كما يظهر الشكل 1 إلى فقط 7.75٪ النقاء بعد التخصيب. مقارنة MCS، مما أثرى FACS PDC مع نقاء عالية مثل 96.4٪. لضمان نقاء عالية، تم تنفيذ استراتيجية النابضة خطوة بخطوة. كما هو مبين في الشكل 2، وبوابات الخلايا وحيدات النوى وفصل من الحطام مبعثر إلى الأمام (FSC) والمعلمات مبعثر الجانب (SSC). باستخدام FSC العرض (FSC-W) مقابل FSC الارتفاع (FSC-H) وSSC-W مقابل SSC-H، وبوابات الخلايا وحيدة لتجنب الإشارات الإيجابية الكاذبة التي تنتجها الركام. ثم تم بوابات الخلايا واحدة حية مثل دابي - السكان (خلايا دابي + لقوا حتفهم أو أفكارك).من الخلايا وحيدة حية، CD11c و+ CD11b - السكان وبوابات، من الذي B220 + PDCA-1 + السكان وبوابات أخرى مثل الحزب الديمقراطي المسيحي. وكان الحزب الديمقراطي المسيحي فرز ليس فقط من نقاء عالية ولكن أيضا وضعها الطبيعي وظيفيا. كان لديهم القدرة على إنتاج IFNα في المختبر على التحفيز الدليل السياسي الشامل كما هو مبين في الشكل (3) (إعادة طباعة بإذن من نشر رسائلنا السابقة (17).

الشكل 1. الطهارة من PDC التصنيف إما عن طريق الإشراف والطريقة FACS تدفق الممثل الخلوي الأرقام التي تبين النسبة المئوية من الحزب الديمقراطي المسيحي (CD11c و+ CD11b - B220 + PDCA-1 +). في الخلايا التي تم فرزها من قبل MCS (أعلى) ونظام مراقبة الأصول الميدانية (القاع)، على التوالي. تم بوابات السكان من مجموع الخلايا الحية (يسار)، ثم PDC كما B220 + PDCA-1 - في CD11c و+ CD11b تم بوابات خلايا + داخل CD11c و+ CD11b - السكان (يمين) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. استراتيجية المحاصرة لPDC التخصيب بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية استراتيجية النابضة خطوة بخطوة في الترتيب التالي: خلايا وحيدة النواة إلى الخلايا وحيدة FSC، إلى الخلايا وحيدة SSC، إلى دابي - الخلايا الحية، لCD11c و+ CD11b -، وإلى B220 + PDCA-1 + كما PDC الحية. PDC في مجموع الخلايا واحدة هي 2.95 ± 1.42٪. فرز عدد PDC هو 0.88 ± 0.28 × 10 5 في الفأر مع معدل استرداد نحو 50٪. (ن = 12 MRL / لبر الفئران، وأظهرت البيانات كما يعني ± SD في 95٪ CI من الوسط). 641fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وعولج الشكل 3. IFNα الإنتاج من قبل الحزب الديمقراطي المسيحي فرز FACS العظام الترتيب نخاع PDC مع فئة A الدليل السياسي الشامل. (ODN1585 و 5 ميكرومتر) لمدة 6 ساعة في المختبر. في الشكل، "ص" لتقف على الأصغر سنا، فئران عمرها 6 أسابيع. "س" لتقف على والفئران الأكبر سنا من العمر 16 أسابيع. MRL لتقف على الفئران MRL السيطرة على الفئران كما صحية؛ لبر لتقف على الفئران MRL / لبر كما الفئران المعرضة للمرض الذئبة. وقد تم قياس تركيز IFNα في ثقافة طاف مع إليسا. * P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001، في اتجاه واحد أنوفا. وأظهرت البيانات يعني كما ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(ن = 3 الفئران في كل مجموعة). ويرد هذا الرقم من نشر لدينا في مجلة علم المناعة بإذن 17pload / 54641 / 54641fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.