تصف هذه المخطوطة نموذجا جراحيا للفئران لالتهاب الحويضة والكلية باستخدام عدوى مباشرة داخل الكلى بواسطة الإشريكية القولونية في الحوض الكلوي. يمكن استخدام الإجراء التجريبي لدراسة التسبب في التهاب الحويضة والكلية وكذلك الالتهاب والتليف المرتبط به.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حقن إنترارينال من الإشريكية القولونية في نموذج الجرذ من التهاب الحويضة والكلية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التهاب الحويضة والكلية هو عدوى بكتيرية تصيب الكلى وغالبا ما تسببها الإشريكية القولونية. يمكن أن تسبب العدوى المتكررة التهابا كبيرا في الكلى وتليف يؤدي في النهاية إلى تدهور وظائف الكلى. قبل أن يتم إنشاء الإدارة السريرية المحسنة والوقاية من التهاب الحويضة والكلية ، يجب إنشاء نموذج حيواني موثوق به من أجل دراسة آليات التقدم والتكرار والفعالية العلاجية. يحاكي نموذج العدوى عبر الإحليل عن كثب التهاب الحويضة والكلية البشري ولكنه يظهر تباينا كبيرا بسبب اعتماده على ارتجاع مجرى البول لنقل البكتيريا إلى الكلى. هنا ، يتم توفير بروتوكول جراحي مفصل لإجراء الحقن البكتيرية في الحوض الكلوي للفئران وتأكيده من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي غير الجراحي (MRI). باستخدام هذا البروتوكول ، تتعرض بشكل مباشر للتركيز المطلوب من بكتيريا الإشريكية القولونية ويمكنها التعافي تماما من العملية الجراحية مع الرعاية الكافية بعد الجراحة. هذا يسهل تقييمات التصوير بالرنين المغناطيسي الطولية اللاحقة للنماذج الحيوانية التجريبية للمقارنة مع الضوابط المالحة (الوهمية). باستخدام نهج التوصيل المباشر هذا ، يمكن السيطرة على شدة العدوى وقابلة للتطبيق على الدراسات الميكانيكية للتقدم بالإضافة إلى تطوير استراتيجيات علاج جديدة.
المقدمة
وقد استخدمت نماذج القوارض لدراسة العديد من المظاهر المرض البشري، بما في ذلك التهاب الحويضة والكلية والتهابات المسالك البولية (وتي). عدوى المسالك البولية هي مشكلة صحية عالمية، ويمكن أن تؤثر على الأطفال والرجال والنساء من جميع الأعمار. 1 ، 2 ، 3 المظاهر الأولية من التهاب المسالك البولية تشمل التهاب المثانة، وإذا تصعد العدوى على طول الحالب، قد تلحق التهاب الكلى (التهاب الحويضة والكلية). وفي الوقت نفسه، فإن انتشار مرض السكري يقترب من 400 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. 4 ، 5 الأهم من ذلك، قد يكون معدل التهاب المسالك البولية أعلى إلى 4 مرات في المرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة أو لديهم نوع 2 من مرض السكري، مما أدى إلى زيادة خطر الإصابة المتكررة التهاب المسالك البولية (روتي)، الإنتان، والتليف الكلوي من التهاب الحويضة والكلية، وخلل المثانة. 6 ، 7 ، 8 القوارضنماذج مهمة في دراسة التهاب المسالك البولية، لأن العلاجات بالمضادات الحيوية الحالية تنتج استجابة مستدامة، وقائية فقط في مجموعة فرعية من مرضى التهاب المسالك البولية. لتحسين الرعاية المسالك البولية السريرية، والخطوات الرئيسية هي لفهم آلية روتي وعملياتها الفيزيولوجية المرضية من العدوى الحادة إلى التهاب في التليف، فضلا عن تأثير داء السكري من النوع 2.
والهدف من تحسين النماذج الحيوانية هو تطوير التقنيات التي تسمح بتقييم أكثر دقة لتطور المرض والتدخلات العلاجية. وقد استخدمت عدة نهج مختلفة للحث على التهاب الحويضة والكلية في الفئران و / أو الفئران لدراسة الفيزيولوجيا المرضية من تلف الكلى، وأثر العلاج بالمضادات الحيوية، وغيرها من جوانب المسار الطبيعي للعدوى البولية. وهناك نهج مشترك لإنشاء وتي الوراء هو قسطرة عبر الإحليل. 10 ، 11 ، 12 ، 13 </ سوب> هذا الأسلوب يدخل البكتيريا عبر مجرى البول في المثانة البولية من الحيوانات تخدير. في حين أن هذه التقنية تحاكي عن كثب التهاب الحويضة والكلية البشرية، فإن الإصابة الفعلية وحجم العدوى التهاب الحويضة والكلية يمكن أن تكون متغيرة للغاية بسبب عوامل متعددة بما في ذلك عدم وجود ارتجاع الحالب العفوي أو البولية يفرغ أثناء أو بعد التلقيح مباشرة. 11 ونتيجة لذلك، فإن التباين التجريبي في إحداث العدوى التهاب الحويضة والكلية تصاعدي يمكن أن تحد من فائدة هذا النموذج لدراسة التهابات الكلى فضلا عن الاستراتيجيات العلاجية.
ويصف هذا التقرير نموذج الفئران التهاب الحويضة والكلية الجراحي حيث يتم حقن E. القولونية مباشرة في الكلى الفئران. على الرغم من هذا النموذج الفئران يجري الغازية، وكمية E. القولونية تسليمها إلى الكلى يمكن السيطرة عليها بشكل فعال مما يتيح التهاب الكلى قوية والالتهابات. 14 وفي هذا اإلجراء، نصف أيضاكيف يمكن رصد هذه الالتهابات الكلوية التي يسببها طوليا مع في الجسم الحي التصوير بالرنين المغناطيسي (مري).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا لبروتوكولات اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) في جامعة كيس ويسترن ريزيرف. مدة العملية الجراحية الموصوفة أدناه حوالي 45-60 دقيقة. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي نفسه حوالي 15 دقيقة لكل نقطة زمنية.
1. التخدير
- تخدير الفئران في غرفة إيسوفلوران تعيين في 2٪ إيسوفلوران مختلطة مع الأكسجين لتسهيل التعامل مع الحيوانات وضبط النفس قبل إعطاء التخدير عن طريق الحقن داخل البريتونيا.
- بعد 3-5 دقائق من التعرض ل إيسوفلوران، تحقق من أن الحيوان هو تخدير ويعرض أي رد على قرصة أخمص قدميه.
- مزيد من الفئران رزين مع حقن داخل البريتوني من مزيج من زيلازين والكيتامين: 75 ملغ / كغ من الكيتامين / 10 ملغ / كغ زيلازين. عند إجراء الحقن داخل البريتوني، ورسم الإبرة للتأكد من أن أجزاء من الأمعاء أو الأعضاء الحيوية الأخرى لم ثقب.
- أنانجكت 2 ملغ / كغ من بوبيفاكين تحت الجلد في موقع شق لتوفير تخفيف الألم الموضعية.
2. إعداد منطقة الجراحية
- تعقيم الأدوات الجراحية واللوازم قبل أن يتم استخدامها لعملية جراحية ووضع على لوحة الجراحية للعقم. يمكن تعقيم معظم الأدوات واللوازم وإعادة استخدامها.
- استخدام قفازات معقمة لجميع العمليات الجراحية.
- استخدام الحلاقة الكهربائية لحلق الفراء قبالة الجانب الأيمن للحيوان. يحلق الحيوان من الجزء السفلي من القفص الصدري إلى الجزء العلوي من الساق الخلفية توفير منطقة خالية من الشعر كبيرة للشق.
- وضع الحيوان على لوحة جراحية معقمة لعزل المنطقة المطهرة من المناطق المحيطة بها.
- فرك الجلد مع مطهر مثل اليود بوفيدون أو بيتادين. بدء الغسل في مركز الموقع الجراحي والانتقال إلى الخارج بطريقة دائرية. كرر ثلاث مرات على الأقل مع مسح جديد من اليود بوفيدون أو بيتادين.
- فرك الموقع الجراحي مع مسحات الكحول 70٪ حتى الجلد هو واضح، واليود قد تكون سامة إذا امتص.
3. الإجراء الجراحي
- الحفاظ على هذا الإجراء تحت ظروف معقمة.
- وضع الحيوان تخدير على سرير التدفئة الدافئة في موقف الأيسر الوحشي الأيسر مع الجناح الأيمن تواجه صعودا.
ملاحظة: يجب توخي الحذر للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية للحيوان في 35-37 درجة مئوية لمنع انخفاض حرارة الجسم. وينبغي أيضا تعقيم هذا السرير الاحترار حسب الحاجة للحفاظ على ظروف العقيم. - يشعر القفص الصدري، وجعل صغير 2-3 سم الحق الظهرية خلف الصفاق شق باستخدام حجم العقيمة 10 شفرة مشرط بدءا من الجزء السفلي من القفص الصدري.
- وضع الشاش العقيمة طوليا على طول جانبي شق.
- تشريح بعيدا الأنسجة تحت الجلد، والدهون، والعضلات من أجل تصور والوصول إلى تجويف البطن. استخدام مقص منحني مايو مقصوص للسماح اختراق أعمقحصص في الجرح وقطع الأنسجة السميكة.
- مرة واحدة في الكبد واضحة للعيان ويمكن الوصول إليها، واستخدام ملقط حادة لسحب الكبد صعودا.
- باستخدام زوج آخر من ملقط حادة في ناحية أخرى، وفضح الكلى الحق لذلك يجلس خارج تجويف البطن مباشرة.
- استخدام إصبع المؤشر والإبهام من اليد اليسرى لعقد الكلى في الموقف. مع اليد اليمنى، ببطء وبشكل مطرد حقن 0.1 مل UTI89 E. القولونية الحل (تركيز بين 1 × 10 8 -1 × 10 9 ) من حقنة معقمة في الحوض الكلوي (الذي يظهر كما فقاعة بيضاء) 15 .
ملاحظة: إعداد عيار البكتيرية كما هو موضح في المرجع 15 . - وضع شريط من مرقئ قابل للامتصاص على إبرة لمنع تدفق اللقاح في الصفاق. سحب ببطء الإبرة من الحوض الكلوي.
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم بيرس أو إصابة الأنسجة المحيطة مما أدى إلى إنفكتي خارج الهدفو / أو المضاعفات. - استخدام حقنة أكبر لشطف شامل الكلى مع المياه المالحة العادية قبل وضعها مرة أخرى في تجويف البطن.
4. الغرز
ملاحظة: خياطة التي سيتم دفنها في الأنسجة يجب أن يكون 4-0 غير قابلة للامتصاص خيوط مضفر. يمكن استخدام خيوط امتصاصية أو أحادية الشعاع لأسطح الجسم.
- وضع الغرز بالتساوي وعلى مقربة من حافة الأنسجة ممكن لمنع انسداد تدفق الدم. وعادة ما لا يزيد عن 0.3 سم من الحافة أمر ضروري.
- فهم الجلد و إفرت قليلا باستخدام زوج من ملقط مسنن غرامة، وتدوير حامل الإبرة في موقف بروناتد في التحضير لثقب الجلد.
- دفع الإبرة من خلال سمك كامل من الجلد عن طريق سوبينغ المعصم لتدوير الإبرة وتمريره من خلال الجلد.
- كرر هذه العملية لحافة الجلد الأقرب إلى الفرد تنفيذ الإجراء.
- شدالغرز بما فيه الكفاية لمعارضة حواف الأنسجة. أي تشديد سوف تعوق إمدادات الدم، بطيئة التئام الجروح وقد يؤدي إلى التفكك.
- التعادل قبالة خياطة باستخدام عقدة مربع، كما لو كانت غرزة توقف بسيطة، إلا أنه يتم قطع فقط حبلا قصيرة، وترك حوالي ذيل 3-4 ملم.
- بعد ربط غرزة الأولى قبالة، وإعداد لوضع غرزة الثانية حوالي 3 ملم بعيدا عن الأول، ومواصلة خياطة تشغيل.
- مرة واحدة يتم التوصل إلى نهاية شق، لا سحب غرزة الماضي تماما من خلال. بدلا من ذلك، استخدام حلقة التي تعقد مع حامل الإبرة هنا كما حبلا قصيرة من أجل التعادل من نهاية البعيدة من إغلاق خياطة.
- باستخدام العلاقات أداة، التعادل قبالة خياطة باستخدام عقدة مربع. وهذا يؤدي إلى 3 فروع تلتصق من عقدة الانتهاء في نهاية البعيدة.
5. الحيوان الانتعاش
- حقن 2.1 ملغ / كغ يوهيمبين داخل البريتونيا بعد الجراحة لعكس التخدير. اومن المتوقع نيمالس للتعافي تماما من الإجراء الجراحي بعد 3-5 ساعة.
- الحفاظ على الحيوان على وسادة التدفئة (لتجنب انخفاض حرارة الجسم) والفراش لينة ماصة بعد الجراحة.
- توفير الإماهة مع السوائل عن طريق الفم أو الوريدية حتى يمكن العودة إلى التغذية الطبيعية (في غضون 24 ساعة). حقن حوالي 0.6 مل من محلول ملحي عادي البريتوني مباشرة بعد الجراحة للحد من آثار الجفاف.
- توفير تسكين كما هو موضح في إاكوك وافق رعاية الحيوان واستخدام بروتوكول. حقن 5 ملغ / كغ كاربروفين تحت الجلد لإدارة الألم.
- مراقبة الشقوق بانتظام للتورم، الافرازات، ألم، أو التفكك.
6. التحقق من صحة عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي
- إجراء أنا فيفو تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي على حقل كبير الماسحات الضوئية التصوير بالرنين المغناطيسي الحيوانات الصغيرة.
- إزالة التخدير مع 3٪ الأيزوفلورين في الأكسجين ووضع الحيوان مع الكلى الحق في إزوسنتر في الماسح الضوئي والتصوير بالرنين المغناطيسيأكلت الترددات الراديوية لفائف. توفير الحيوانات مع 1-2٪ إيسوفلوران التخدير بشكل مستمر في جميع أنحاء إجراء التصوير عن طريق نوسكون.
ملاحظة: بالنسبة للصور التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي هو مبين في الشكل 1 ، تم استخدام لفائف حجم الفئران الحجم (القطر الداخلي = 72 ملم). - استخدام نظام مراقبة الحيوان ومراقبة للحفاظ على معدل التنفس كل حيوان (40-60 الأنفاس / دقيقة) ودرجة حرارة الجسم الأساسية (35 ± 1 درجة مئوية).
- استخدام متعددة شريحة، متعددة صدى تدور صدى الحصول على التصوير بالرنين المغناطيسي للحصول على دقة عالية، محوري T2 المرجحة الصور من كل من المصابة والسيطرة على الكلى. معلمات اكتساب التصوير بالرنين المغناطيسي النموذجية هي زمن التكرار = 5000 ميللي ثانية، وقت صدى = 40 ميللي ثانية، سمك شريحة = 2.0 ملم، في المكان القرار المكاني = 200 ميكرون، 3 متوسطات إشارة، ووقت اكتساب من 8 دقائق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقنيات التصوير الطبي توفر الفرصة لتقييم غير جراحية التهاب المسالك البولية والفعالية العلاجية. لذلك، تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي للتحقق من صحة تحريض العدوى الحادة بعد حقن 1-2 × 10 7 UTI89 E. القولونية ، وتصور التغيرات في الكلى قبل وبعد الجراحة. ويبين الشكل 1 أ-ب منطقة متزايدة تدريجيا من التهاب الكلى (الأسهم الصفراء). الصور التصوير بالرنين المغناطيسي التي تم الحصول عليها لكل حيوان في أيام 1 و 4 بعد العدو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن أن تنتج التهاب الحويضة والكلية الحاد في القوارض (أي الفئران والجرذان) عن طريق القسطرة عبر الإحليل. 16 ، 17 ، 18 هذا الأسلوب العدوى عبر الإحليل هو مفيد في أنه غير الغازية ويحاكي الفيزيولوجيا المرضية البشرية من العدوى الصاعدة. 17 ، 18 ، 19 ، 20 ومع ذ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ أي إفصاحات أخرى.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم لدعم المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK K12 DK100014 (Lan Lu) ، ومركز الحالة الشامل للسرطان (NIH / NCI P30 CA43703) ، والتعاون السريري وعلوم الترجمة في كليفلاند (NIH / NCATS UL1 TR000439).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وسادة امتصاص | فيشر | 14-127-47 | |
| وسادة شاش قطنية معقمة | فيشر | 22-415-469 | |
| قفازات جراحية من اللاتكس | هنري شاين لصحة | 21540 | |
| مقص المايونيز المنحني | فيشر | S17341 | |
| مستقيم حاد Foreceps | فيشر | 08-895 | |
| مقبض مشرط | فيشر | 08-913-5 | |
| شفرات مشرط معقمة | فيشر | 53220 | |
| 1 مل لوحبة | حقنة BD Biosciences | 309628 | للحقن البكتيرية |
| 20 مل حقنة لوير لوك | BD Biosciences | 301031 | للغسيل الملحي |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 جم 3/4 بوصة. إبرة | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 جم 1 بوصة. إبرة | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 حقنة الأنسولين Exel | International | 25846 | لحقن الأدوية |
| Isoflurane | Henry Schein Animal | Health 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | حقن الملكية الفكرية |
| Yohimbine (Atipamezole) | باترسون vetrinary | 07-867-7097 | حقن IP بعد الجراحة |
| بوبيفاكائين (ماركاين) | باترسون الvetrinary | 07-890-4584 | حقن SQ في موقع الشق ؛ |
| 4-0 خياطة الأمعاء الكرومية | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 مضفر فيكريل خياطة | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 مل حقنة SubQ | BD Biosciences | 309597 | |
| E. القولونية UTI89 أو CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Hemostat Ethicon | Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T التصوير بالرنين المغناطيسي | Bruker | 94/20 اتحاد الجمهوريات |
المراجع
- Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
- Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
- Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
- Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
- Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
- Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
- Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
- Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329(2007).
- Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
- Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
- Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
- Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
- Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
- Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
- Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
- Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
- Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
- Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
- Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
- Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
