مقالة منهجية

فحوصات لدراسة دور فيترونيكتين في التصاق البكتيريا ومقاومة المصل

7.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54653

⸱

أكتوبر 16, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Microbiology, Department of Translational Medicine, Lund University, 2Department of Molecular Biology, Umea University

في هذه المقالة

ملخص

ويصف هذا التقرير بروتوكولات لوصف التفاعلات بين البروتينات الغشاء الخارجي البكتيرية وفيترونيكتين منظم لتكملة البشرية. يمكن استخدام البروتوكولات لدراسة ردود فعل ملزم والوظيفة البيولوجية فيترونيكتين في أي من الأنواع البكتيرية.

الملخص

استخدام البكتيريا المنظمين تكملة كوسيلة للتهرب من الاستجابة المناعية المضيف. هنا، نحن وصف بروتوكولات لتقييم اكتساب دور فيترونيكتين في اللعب سطح الخلية البكتيرية في مقاومة المضيف الجهاز المناعي. التدفق الخلوي تجارب اعتبرت فيترونيكتين البلازما البشرية يجند للبروتين الغشاء الخارجي مستقبلات البكتيرية ح من النزلية من نوع f. كان يعمل مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم لتوصيف البروتين-بروتين التفاعلات بين البروتين المنقي المؤتلف ح وفيترونيكتين، وملزمة تقارب تم تقييم استخدام قياس التداخل بيو-طبقة. وأكد الأهمية البيولوجية لربط فيترونيكتين للبروتين ح على سطح الخلية البكتيرية في تهرب الاستجابة المناعية المضيف باستخدام مقايسة مقاومة مصل مع مصل الدم البشري الطبيعي والمنضب فيترونيكتين. وقد تم تحليل أهمية فيترونيكتين في التقيد البكتيرية باستخدام الشرائح الزجاجية مع أو بدون طلاء فيترونيكتين، متبوعاً بصبغة غرام. وأخيراً، كان التحقيق التصاق البكتيريا إلى مونولاييرس الخلايا الظهارية السنخية البشرية. البروتوكولات المذكورة هنا يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أي الأنواع البكتيرية من الفائدة.

المقدمة

فيترونيكتين (Vn) بروتين سكري بشرية هامة مشاركة في الحفاظ على التوازن عن طريق تنظيم النظام فيبرينوليتيك. Vn يعمل أيضا كمنظم تكملة عن طريق تثبيط في مسار تكملة المحطة الطرفية أثناء تكوين مجمع C5b6-7 والبلمره C9. أظهرت العديد من مسببات الأمراض البكتيرية لتجنيد Vn إلى سطح الخلية كوسيلة لتكملة مقاومة ترسب1،2،3. وبالإضافة إلى ذلك، يعمل Vn كجزيء "ساندويتش" بين البكتيريا والمضيف مستقبلات الخلايا الظهارية، وبالتالي تعزيز الالتزام واستيعاب العوامل الممرضة2،،من45. هو وساطة ملزمة Vn إلى سطح الخلية البكتيرية من البروتينات الأخرى مجهولة حاليا. توضيح دور وظيفي Vn-ملزمة في تهرب الاستجابة المناعية خرطوم الكامل سيتطلب تحديد البروتينات تجنيد Vn.

الخطوة الأولى في تحديد البروتينات Vn-ملزم اختبار ما إذا كان رض فائدة يمكن ربط المنقي Vn. التدفق الخلوي وسيلة مريحة وبسيطة لتحديد ما إذا كان Vn منضماً إلى خلايا الكائنات الممرضة. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم ربط Vn إلى مختلف النزلية من نوع f (منطقياً) يعزل السريرية6. الأسلوب الموصوفة هنا هو الكمية، ويمكن استخدامها للتمييز بين القدرة الملزمة لمجموعة متنوعة من السلالات البكتيرية. في دراسة سابقة، ونحن تتميز البروتين ح (PH) منطقياً ك بروتين ملزمة Vn7. ولذلك، في هذه الدراسة، كانت مقارنة إمكانات Vn-الربط البرية من نوع (WT) منطقياً و M10Δ سكانية طفراتlph استخدام البروتوكولات وصف.

بمجرد ما تقرر أن يربط ممرض Vn، والخطوة الثانية لتوصيف البروتين السطحي بغية تحديد المحتملة Vn-ملزم البروتينات. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من النهج لهذا الغرض8،9، ولكن لم يرد وصف هذه المنهجيات في هذا التقرير. هو الأسلوب الأكثر ملاءمة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين للتعبير عن البروتينات السطحية البكتيرية المحدد في كولاي ريكومبينانتلي وتنقية بالتقارب اللوني. هنا، نحن نستخدم درجة الحموضة وتفاعله الجزيئية مع Vn لتوضيح الأسلوب. التفاعلات بين المؤتلف الأس الهيدروجيني و Vn اتسمت باستخدام المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا)7 ووضعت مؤخرا خالية من تسمية تقنية تعرف باسم بيو-طبقة قياس التداخل (BLI)10،11. بينما يمكن استخدام الساس لتأكيد تفاعلات البروتين البروتين، BLI يوفر بيانات مفصلة فيما يتعلق بمعايير التفاعلات الحركية.

لدراسة دور وظيفي Vn في الانضمام البكتيرية، يمكن الاستفادة من فحوصات مختلفة اثنين. الفحص الأولى الموصوفة هنا هو القياس المباشر للبكتيريا التمسك الأسطح الزجاجية المغلفة Vn، حين المقايسة الثانية يدرس الانضمام إلى سطح الخلايا الظهارية. للفحص الأولى، كانت مغلفة بالشرائح الزجاجية مع Vn، وتم تقييم الربط WT أو متحولة منطقياً سلالات غرام-وصمة عار والفحص المجهري. ويميز هذا الأسلوب سهولة البكتيريا على أساس القدرة ربط Vn12. وقد تم تحليل التصاق البكتيريا لخلايا الثدييات ثم بإضافة البكتيريا المستزرعة على أحادي الطبقة من نوع الخلايا الظهارية السنخية الثاني؛ تم تقييم مرفق البكتيرية بإحصاء عدد تشكيل مستعمرة وحدات (كفوس). يمكن تمييزها في وجود أو عدم وجود4،Vn13البكتيريا المدخلة والتقيد بها.

تم تقييم دور اكتساب Vn في المقاومة البكتيرية المصل باستخدام مقايسة قتل مصل (أي، نشاط جراثيم المصل). لتقييم أهمية اكتساب Vn في المقاومة المصل، نشاط جراثيم المنضب Vn المصل (VDS) كان بالمقارنة بالمصل الإنسان العادي (NHS). الطريقة المستخدمة بسهولة يميز Vn-ملزم مقابل البكتيريا غير ملزمة استناداً إلى المقاومة المصل. لقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة دور Vn في المقاومة المصل لعدة مسببات الأمراض البكتيرية4،12.

وأبلغ أساليب عديدة لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض. وهنا يصف لنا مجموعة من البروتوكولات التي يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أي مسببات المرض بغية تقييم دور Vn في الآلية المرضية. وقمنا باختبار هذه البروتوكولات باستخدام مسببات الأمراض المختلفة، واختير منطقياً كمثال لهذا التقرير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-تحليل Vn كما يجند بروتين سطحي البكتيري

  1. كشف ملزم Vn في السطح البكتيرية باستخدام التدفق الخلوي
    ملاحظة: في التدفق الخلوي، كنا الجانب مبعثر ومبعثر الأمام بوابة الأحداث الإيجابية. يعزل منطقياً السريرية لدراسة التفاعلات مع Vn، (n = 10) وقد تم اختيار7 جنبا إلى جنب مع BL21 كولاي (DE3) كعنصر تحكم سلبية (الشكل 1أ).
    1. ثقافة سكانية السريرية يعزل في المخ-القلب ضخ (بهي) المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكروغرام/مل ند وهيمن على 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة. استخدام لوريا بيرتاني المتوسطة للثقافة كولاي14. حصاد منطقياً في سجل منتصف المرحلة (OD600 = 0.3)15، وريسوسبيند البكتيريا في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، الرقم الهيدروجيني 7.2، يحتوي على 1% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA) (حظر المخزن المؤقت؛ ببسبسا). ضبط التعليق إلى 109 زيمبابوي/مل.
    2. نقل مختبرين يحتوي على 5 × 106 زيمبابوي إلى 5 مل أنابيب مستديرة القاع البوليستيرين (12 × 75 مم2) وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لحظر. الطرد المركزي بتعليق في 3,500 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT)16 لمدة 5 دقائق بيليه البكتيريا، ثم نضح بعناية لإزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه.
    3. ريسوسبيند الكريات البكتيرية مع 50 ميكروليتر من حظر مخزن يحتوي على 250 نانومتر Vn واحتضان العينات ح 1 في RT دون المصافحة. وبعد الحضانة، بيليه البكتيريا بالطرد المركزي في س 3,500 ز لمدة 5 دقائق، ثم تغسل الكريات ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني والطرد المركزي خطوات مماثلة.
    4. لبيليه البكتيرية، إضافة 50 ميكروليتر من الأغنام الابتدائي الإنسان المضادة Vn [بولكلونل] أجسام (pAbs) في تمييع 1: 100 في برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة. احتضان التعليق ح 1 في الرايت، ثم يغسل البكتيريا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة غير منضم (كما هو موضح في الخطوة 1-1-3).
    5. بعد ذلك إضافة 50 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة الذي يتضمن fluorescein isothiocyanate (فيتك)-مترافق حمار الغنم المضادة pAbs (تخفيف 1: 100)، واحتضان في RT ح 1 في الظلام.
    6. إعداد عنصر تحكم فارغ بحضانة البكتيريا مع حجب المخزن المؤقت فقط و pAbs دون Vn.
    7. يغسل البكتيريا ثلاث مرات مع 1 مل من المخزن المؤقت لحظر وبيليه التعليق بالطرد المركزي، كما هو موضح في القسم 1.1.2. وأخيراً، ريسوسبيند بيليه البكتيرية مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وتحليلها بالتدفق الخلوي7.
  2. أليسا تحليل التفاعل بين درجة الحموضة المؤتلف و Vn
    ملاحظة: عناصر تحكم تحتاج إلى إدراجها باستبعاد ملزمة غير محدد. الإنسان عامل ح (FH) أو C4b ملزمة البروتين (C4BP) تستخدم كعناصر إيجابية وسلبية، على التوالي.
    1. تمييع كل من البروتينات البشرية (Vn و FH و C4BP) بشكل منفصل إلى 50 نانومتر في تريس-HCl، pH 9.0 (طلاء المخزن المؤقت). الاستغناء عن 100 ميليلتر من حل البروتين في كل من لوحة ميكروتيتير بوليسورب جيدا. إغلاق اللوحات مع الغطاء وتخزينها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (ح 16) لتسهيل التثبيت البروتين على الآبار لوحة ميكروتيتير.
    2. تجاهل الحل من لوحة ميكروتيتير عن إمالة رأسا على عقب عبر الحوض وغسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني/جيدا. كتلة الآبار المغلفة ح 1 في الرايت مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2.5% (w/v) جيش صرب البوسنة (برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة).
    3. بعد إزالة الحل حظر، غسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% (v/v) 20 توين (ببست) كل بئر. إضافة 100 ميليلتر من 50 نانومتر المؤتلف PH له معلم لكل عينة جيدا واحتضانها ح 1 في الرايت في مراقبة الآبار، إضافة فقط 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة.
      ملاحظة: الجين lph ترميز درجة الحموضة من منطقياً تضخيمه عن طريق PCR والمستنسخة في ناقل التعبير pET26b أن يضيف صاحب 6 ×-علامة في ج-محطة البروتين المعرب عنها. تم تحويل ناقلات المؤتلف كولاي BL21(DE3) للتعبير. وكان استخدام الراتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة لتنقية البروتين المؤتلف15.
    4. تجاهل حل البروتين وإزالة البروتينات غير منضم بغسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميليلتر من ببست كل بئر. إضافة 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة التي تحتوي على الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق pAbs المضادة صاحب (01:10، وتمييع 000) واحتضانها ح 1 في الرايت
    5. إعداد حل 20 مم أ بحل تيتراميثيلبينزيديني في حل ميثانول الأسيتون و 45% 5%. لإعداد حل ب، حل ز 19.2 حمض الستريك في 1,000 مل ح2س، ضبط درجة الحموضة إلى 4.25 بإضافة كوه، ثم أضف ميليلتر 230 من 30 ٪ ح2س2. تخزين كل الحلول في الظلام في الرايت قبل الاستخدام، يخلط 500 ميليلتر من حل ب 9.5 مل من محلول لتحضير الكاشف الكشف عن أليسا.
    6. غسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميليلتر من ببست كل بئر والكشف عن مركبات ضد مستضد بإضافة 100 ميليلتر من أليسا الكشف عن الكاشف لكل بئر.
    7. إضافة 50 ميليلتر من م 1 ح2حتى4/well لوقف رد الفعل. قياس الكثافة الضوئية للآبار في 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
  3. دراسة حركية التفاعل المؤتلف درجة الحموضة واستخدام BLI Vn
    1. شل Vn البشرية على أجهزة استشعار أمين المتفاعلة باستخدام أمين اقتران الأسلوب، طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة11.
    2. باستخدام برنامج تلفزيوني، متسلسل تمييع يجند (المؤتلف PH) من 0 إلى 4 ميكرومتر ونقل الحلول الناتجة إلى لوحة microtiter الأسود 96، حسنا، مسطحة القاع. تشغيل التجربة عند 30 درجة مئوية باستخدام أداة BLI17.
    3. تحميل مجلد البيانات في برنامج تحليل البيانات BLI. حدد الخيار 'أجهزة الاستشعار اختيار' . ثم، حدد 'مرجع جيدا' (استشعار المغلفة Vn في برنامج تلفزيوني) للطرح.
    4. حدد 'محاذاة المحور y لخط الأساس' وحدد 'إينتيرستيب التصحيح ومحاذاة لرابطة'. اضغط على الزر 'بيانات عملية' الذي سيتم تلقائياً فتح علامة التبويب التحليل.
    5. في علامة التبويب تحليل، حدد الخيار 'الرابطة وتفكك' تحت المنحنى المناسب. حدد النموذج 'ملزمة 1:1، وتركيب العالمية'. اضغط 'صالح منحنى' وتصدير البيانات17من المناسب.

2-وصف دور Vn في الانضمام البكتيرية

  1. دراسة البكتيريا التمسك بالأسطح الزجاجية المغلفة Vn
    1. تعد حلاً 2 ميكروغرام/مل من Vn في برنامج تلفزيوني وبيبيت 10 ميليلتر لهذا الحل على مجهر زجاج الشريحة كقطرة واحدة. السماح بانخفاض الجافة على الشريحة لمدة 30 دقيقة في معطف الرايت شريحة مع ألبومين المصل البشري (HSA) كعنصر سلبي.
    2. يغسل الشرائح الزجاجية مغلفة بروتين ثلاث مرات بغمس الشرائح لمدة ثانيتين في كوب يحتوي على برنامج تلفزيوني لإزالة الزائدة من البروتين غير المصقول. إضافة 20 مل ثقافة سكانية جديدة (كما هو موضح في الخطوة 1.1.1) في طبق بتري بلاستيكية معقمة وتغرق Vn-/الشرائح المغلفة يمتلكهما الزجاج في الأجلين المتوسط والثقافة. احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية ح 1 مع الهز 20 لفة في الدقيقة.
      ملاحظة: M10 منطقياً و M10Δ سكانيةlph كانت تزرع في السائل بهي المتوسطة أو على ألواح الشوكولاته أجار. وقد استكمل المتوسطة للمسخ lph مع 10 ميكروغرام/مل كاناميسين15.
    3. بعد الحضانة، إزالة أي بكتيريا غير منضم بغمر الشرائح ثلاث مرات في كوب مليء ببرنامج تلفزيوني. تصور البكتيريا بصبغة غرام، كما هو موضح.
      1. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة من كل شريحة بإمالة عليه ولمس الحافة على المناديل الورقية. أيردري الشرائح لمدة 3-5 دقيقة في RT، وإصلاح البكتيريا التقيد بها بتمرير ثلاث مرات كل شريحة على لهب.
      2. أمسك الشريحة من الحواف مع اثنين من أصابعه على صينية المصبوغة، ثم إضافة 3-4 قطرات (200-300 ميليلتر) الحل البنفسجي كريستال 2.3%. انتظر 60 ثانية، ثم يغسل الشرائح ضمن تيار لطيف للاستفادة من المياه ل s 3 – 4.
      3. إضافة 3-4 قطرات محلول اليود 0.33% على الشرائح. انتظر 1 دقيقة، ثم شطف الشريحة ضمن تيار لطيف من ماء الصنبور. الجاف بعناية للشرائح بورق نشاف.
      4. إضافة 3-4 قطرات محلول ديكولوريزينج يحتوي على 75% كحول الأيزوبروبيل والاسيتون 25% على الشريحة. بعد 5 – 10 ق، تغسل الشريحة ضمن تيار لطيف من ماء الصنبور.
      5. إضافة 3-4 قطرات (200-300 ميليلتر) لحل كاربولفوتشسين الأساسية. انتظر 1 دقيقة، ثم شطف الشرائح ضمن تيار لطيف من ماء الصنبور. جاف الشرائح باستخدام ورق نشاف.
      6. تصور البكتيريا تحت مجهر خفيفة، اختيار عدسة هدف نفط-غمر في 100 × التكبير18. قارن بين التزام WT منطقياً والبكتيريا المسخ على الأسطح الزجاجية المغلفة Vn ومنتجاتها.
  2. دراسة الانضمام Vn-تعتمد على البكتيريا للخلايا الظهارية
    ملاحظة: استخدم هذا الفحص الالتزام الفعال في لدينا4،الدراسات السابقة7.
    1. الثقافة خلايا A549 (النوع الثاني السنخية الخلايا الظهارية) في قارورة زراعة الأنسجة 75 سم2 مع F12 المتوسطة وتستكمل مع 5 ميكروغرام/مل الجنتاميسين و 10% مصل العجل الجنين (المجلد/المجلد) (FCS) (متوسطة كاملا). احتضان قارورة في حاضنة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام حتى روافد 80% (يمكن تقدير كونفلوينسي بتصور التغطية السطحية من الخلايا باستخدام المجهر المقلوب). تصف الخطوات الأربعة التالية كيفية إعداد الخلايا الظهارية ل المقايسة19،20.
      1. أغسل المونولاير الخلية في قارورة مرتين مع 20 مل من برنامج تلفزيوني بدوامات لطيف. لفصل الخلايا من سطح قارورة، إضافة 2 مل من الخلية المفرزة الإنزيم الحل واحتضان قارورة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. استغلال قارورة بيدك لفصل كافة الخلايا من سطح البلاستيك. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً عدة مرات لتفريق كتل الخلية.
      2. إضافة مل 18 متوسطة كاملة F12 قارورة ونقل تعليق الخلية بأكملها إلى أنبوب فالكون 50 مل عقيمة. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 200 س ز على RT وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل متوسطة كاملة F12.
      3. إزالة 10 ميليلتر من تعليق خلية ووضعه في أنبوب ايبندورف، ثم أضف ميليلتر 90 من حل تريبان الأزرق. تحميل العينة في هيموسيتوميتير (عمق 0.1 ملم) بعد وضع ساترة.
      4. حساب كافة الخلايا قادرة على البقاء في المناطق أ، ب، ج ود (كل حقل يتكون من 16 المربعات، وكل مربع وتبلغ مساحتها 0.0025 مم2)، ثم حساب متوسط عدد الخلايا ([ألف + باء + جيم + دال]/4). حساب عدد الخلايا في المليلتر باستخدام المعادلة التالية:
        خلايا قابلة للحياة/مل = عد خلية متوسط × 10 ×4 إضعاف عامل20.
        ملاحظة: هنا، هو عامل تخفيف 10.
      5. تمييع تعليق خلية إلى 5.0 × 103 خلايا/مل استخدام الجنتاميسين 5 ميكروغرام/ملليلتر تحتوي على المتوسط كاملة. الاستغناء عن 500 ميكروليتر من تعليق خلية في كل من لوحة الثقافة خلية 24-جيدا جيدا. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 حتى يتم روافد 90% من الخلايا.
    2. قبل العدوى البكتيرية، وإزالة المتوسطة من الآبار وإضافة المتوسطة F12 (دون FCS)، ثم احتضانها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    3. أغسل أحادي الخلية في الطبقة ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في مكان الرايت لوحة على الجليد وإضافة 100 ميليلتر من المتوسطة F12 مبردة مسبقاً التي تتضمن 10 ميكروغرام/مل من لوحة Vn. إينكوباتي في 4 درجات مئوية عن ح 1. لمراقبة الآبار، إضافة فقط F12 المتوسطة.
    4. بعد الحضانة، تجاهل الحل بواسطة بيبيتينج ويغسل طبقة الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني في "الرايت ريسوسبيند" ثقافة نمت حديثا منطقياً M10 (الخطوة 1.1.1) في المتوسط F12 (2 × 108 زيمبابوي/mL). إضافة 100 ميليلتر من هذا التعليق البكتيرية لكل بئر واحتضان لوحة ح 2 في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: كل جيد يحتوي على حوالي 2 × 105 A549 الخلايا. للإصابة، 2 × 107 وأضيفت زيمبابوي البكتيرية، المقابلة لعدد وافر عدوى 100.
    5. إزالة المتوسطة عن طريق بيبيتينج وغسل الخلايا الظهارية A549 ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 50 ميليلتر/جيدا من الخلية المفرزة الحل واحتضان لوحة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    6. بعد ذلك إضافة 50 ميليلتر من F12 المتوسطة كاملة كل بئر لوقف رد الفعل الأنزيمي. نقل الخلايا الظهارية (إيتش وان زيرو زيرو ميكروليتر [أي، وحدة التخزين بالكامل]) من كل بئر لأنبوب زجاج 6 مل تحتوي على أربع حبات الزجاج. الخلايا في RT قبل فورتيكسينج لمدة 2 دقيقة.
    7. تمييع 10 ميليلتر من الخلية ليستي معززات بإضافة 10 ميليلتر من ليستي إلى 990 ميليلتر من المتوسطة F12. لوحة 10 ميليلتر من العينة المخففة على طبق أجار شوكولاتة.
    8. احتضان لوحة أجار الشوكولاته على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ثم عد المستعمرات. ويمثل كل مستعمرة واحدة من زيمبابوي.

3-تحليل المقاومة Vn-تعتمد على نشاط جراثيم من مصل الدم البشري

  1. دائرة الصحة الوطنية الشراء من مصدر تجاري. إعداد VDS كما هو موضح سابقا12. تجديد VDS مع 180 نانومتر Vn يساوي Vn موجودة في دائرة الصحة الوطنية.
  2. إعداد مصل إبطال الحرارة (له) بتدفئة المستشفيات العامة في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من أجل إلغاء تنشيط البروتينات تكملة.
    ملاحظة: تم تحديد تركيز المصل الأمثل (5 في المائة) ووقت الحضانة (15 دقيقة) للتحليل هو موضح في الخطوات 3.3-3.7 تجريبيا منطقياً15؛ ويمكن أن تختلف هذه المعلمات لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى.
  3. الثقافة البكتيريا (في هذه الحالة، M10 منطقياً و المسخ M10Δ سكانيةlph) لسجل منتصف المرحلة (OD600 = 0.3). بيليه البكتيريا بالطرد المركزي في س 3,500 ز لمدة 10 دقائق.
  4. ريسوسبيند بيليه البكتيرية مع حجم 1 سكر العنب الجيلاتين فيرنال المخزن المؤقت (دجفب++؛ ودرجة الحموضة 7.3) تحتوي على 2.5% (w/v) الجلوكوز، 2 مم مجكل2، كاكل 0.15 مم2والجيلاتين 0.1% (wt/المجلد).
  5. إضافة 1.5 × 103 زيمبابوي بكتيريا إلى 100 ميليلتر من دجفب++ التي تحتوي على المصل 5% (دائرة الصحة الوطنية، وله، VDS, أو VDS + 180 نانومتر Vn). احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الهز 300 لفة في الدقيقة.
  6. إزالة من 10 ميليلتر الكوة من الخليط رد فعل في 0 دقيقة (0 ر عينة) ومدة 15 دقيقة (تيتي عينة) ولوحة على أجار الشوكولاته. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  7. بعد الحضانة، عد المستعمرات التي تظهر في اللوحة. حساب النسبة المئوية للبكتيريا قتلت12 باستخدام المعادلة التالية: (زيمبابوي في تيتي)/(زيمبابوي في ر0) × 100.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

Vn-ملزمة على سطح البكتيريا تحددها التدفق الخلوي. توظيف جميع منطقياً يعزل السريرية اختبارها في هذه الدراسة Vn إلى سطح الخلية. وقد لوحظ لا تفاعل Vn مع سطح الخلية لسلالة كولاي المراقبة السلبية (الشكل 1أ). كما هو مبين في الشكل 1ب، الأس الهيدروجيني بروتين ملزمة Vn رئيسية على سطح الخلايا منطقياً. ملزمة من Vn بالسلالة منطقياً WT M10 تسبب في حدوث تحول في السكان، بينما M10Δ سكانيةlph غير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعيين Vn إلى سطح الخلية مسببات الأمراض البكتيرية والاستفادة من هذا منظم مكملاً لمنع ترسب عوامل مكملة والانتهاء من غشاء معقدة هجوم2. Vn يعمل أيضا كجزيء جسر بين البروتينات السطحية البكتيرية ومستقبلات سطح الخلية المضيفة، مما مكن مسببات الأمراض التمسك بسطح الخلايا الظهارية والتوسط فيما بعد استيعاب. في هذه الدراسة، يمكننا وصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها لتقدير ط) ملزمة Vn على سطح الخلايا البكتيرية، وتفاعلات البروتين البروتين الثاني) وثوابت تقارب، وثالثاً) دور وظيفي من Vn في توفير مصل المقاومة وتعز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

وكان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة أنا وبيرغر إدوين هيرتا لارس، O.E. ومؤسسة ادلا جوهانسون، "مجلس البحوث الطبية السويدية" (منح رقم K2015 57 س-03163-43-4، www.vr.se)، "مؤسسة مكافحة السرطان" في الجامعة مستشفى في مالمو الفيزيوغرافية المجتمع (فورسمان في المؤسسة)، ومجلس مقاطعة Skåne البحوث ومؤسسة التنمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل خلاط حراريEppendorf5355شاكر تسخين وتبريد بلوك جاف
5 مل أنبوب البوليسترين المستدير القاع   ؛BD Falcon60819-13812 & مرات 75 مم نمط
5٪ CO2< / sub> حاضنة الموردة ثرمو علمية BBD6220
6 مل أنبوب البوليسترين المستدير السفلي   ;VWR89000-47812 & مرات نمط 75 مم مع غطاء
24 بئر ألواحBD Falcon08-772-1Hدرجة ثقافة الخلايا
30٪ بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub>) محلولSigma-AldrichH1009-100MLالتحليل المختبري الصف
75 سم 2< / sup> قارورة زراعة الأنسجةBD FalconBD353136التهوية
96 لوحة قاع مسطحة سوداءجيدا Greiner Bio-One655090ثقافة الأنسجة المعالجة والجزئية ؛ لوحات سوداء واضحة
A549 خط الخلية البشريسيجما ألدريتش86012804-1VL
إنزيم انفصال الخلية (Accutase)  Sigma-AldrichA6964-500MLمستشعرات AR2G من فئة ثقافة الخلية
Pall Life Science18-5095Sensor to Imfixed Protein عن طريق الاقتران الأميني   ؛
AcetoneVWR97064-786
ألبومينات مصل الأبقار من الدرجة التحليلية (BSA)Sigma-AldrichA2058مناسبة لزراعة الخلايا
ورقة الكتاب المقدس   ؛VWR28511-007
مقياس تداخل الطبقة الحيويةPall Life ScienceFB-50258معدات قياس قياس التداخل ثنائي الطبقة
محلول كريستال بنفسجيSigma-AldrichHT90132-1L
C4BP (بروتين ملزم C4b) ComplementTechnology، Inc.تم شراء A109كشكل سائل مجمد
كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>)Sigma-AldrichC5670-500G
محلول Carbol-fuchsinSigma-AldrichHT8018-250ML
حامض الستريكSigma-Aldrich251275-500Gمن الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS)
Sigma-Aldrich75482-250ML-F
الإشريكية القولونية< / em> مضيف (E. القولوني< م > BL21)Novagen69450-3مضيف تعبير البروتين
F12 متوسطSigma-AldrichD6421الخلوي لثقافة
 BD Biosciences651154درجة تحليل الخلايا للتطبيقات البحثية  
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)سيجما ألدريتش12003Cمناسب لزراعة الخلايا
مصل بشري عادي (NHS)Complement Technology، Inc.NHSمصل بشري
FITC مترافق الحمار المضادة للأغنام  AbD SerotecSTAR88Fجنتاميسين متعدد النسيلة
سيجما-ألدريتشG1397درجة ثقافة
الخلية الجلوكوزسيجما-ألدريتشG8270-1KG
الجيلاتينسيجما-ألدريتشG9391مناسب لزراعة الخلايا
مقياس الدمMarienfeld640210
HRP مترافق الأجسام المضادة للعلامةAbcamab1269متعدد النسيلة
HComplement Technology، Inc.A137كشكل سائل مجمد
C4BPComplement Technology، Inc.A109محلول مجمد
مصل الألبومين البشريSigma-AldrichA1653-10Gمسحوق مجفف بالتجميد
عمود راتنج تقارب الهيستيدين (HisTrap HP) GEHealth Care Life Science17-5247-01أعمدة معبأة مسبقا مع Ni Sepharose
His الموسومة PHتم التعبير عنه وتنقيتها بشكل مؤتلف في مختبرنا
محلول اليودSigma-AldrichHT902-8FOZ
الميثانولVWRBDH1135-1LPدرجة التحليل
  مجهرأوليمبوسIX73مجهر مقلوب
شرائحSigma-AldrichS8902عادي ، مقاس 25 مم & مرات ؛ 75 مم & nbsp ؛
كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2< / sub>) يحتويSigma-AldrichM8266-1KG
Plasmid على محطة C 6x علامته على العمود الفقري (pET26 (b)) Novagen69862-3ناقلات الحمض النووي
Polysorb microtitre plates Sigma-AldrichM9410
لهيدروكسيد البوتاسيوم ELISA (KOH)Sigma-Aldrich6009الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS) درجة
الأغنام الأجسام المضادة ل Vn المضادة للإنسانAbD SerotecAHP396شاكر متعدد النسيلة
  ؛ستيوارت ساينتفيكSTR6منصة شاكر
قارورة زراعة الأنسجةBD Falcon317516775 سم2
  Thermomixer Sigma-AldrichT3317شاكر تسخين وتبريد البلوك الجاف
TetramethylbenzidineSigma-Aldrich860336-100MG
ELISA grade Vitronectin (Vn) من البلازما البشريةSigma-AldrichV8379-50UGدرجة ثقافة الخلايا
محلول إزالة اللون مقياس التدفق الخلية مجمع عامل بشري تم شراء

المراجع

  1. Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
  2. Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709(2016).
  3. Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
  4. Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
  5. Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
  6. Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
  7. Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
  8. Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615(2017).
  9. Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
  10. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  11. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
  12. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
  13. Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
  14. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  15. Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
  16. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  17. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  18. McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4(2005).
  19. Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
  20. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
  21. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
  22. Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
  23. Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
  24. Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ELISA H Haemophilus influenzae

مقالات ذات صلة