ويصف هذا التقرير بروتوكولات لوصف التفاعلات بين البروتينات الغشاء الخارجي البكتيرية وفيترونيكتين منظم لتكملة البشرية. يمكن استخدام البروتوكولات لدراسة ردود فعل ملزم والوظيفة البيولوجية فيترونيكتين في أي من الأنواع البكتيرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحوصات لدراسة دور فيترونيكتين في التصاق البكتيريا ومقاومة المصل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استخدام البكتيريا المنظمين تكملة كوسيلة للتهرب من الاستجابة المناعية المضيف. هنا، نحن وصف بروتوكولات لتقييم اكتساب دور فيترونيكتين في اللعب سطح الخلية البكتيرية في مقاومة المضيف الجهاز المناعي. التدفق الخلوي تجارب اعتبرت فيترونيكتين البلازما البشرية يجند للبروتين الغشاء الخارجي مستقبلات البكتيرية ح من النزلية من نوع f. كان يعمل مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم لتوصيف البروتين-بروتين التفاعلات بين البروتين المنقي المؤتلف ح وفيترونيكتين، وملزمة تقارب تم تقييم استخدام قياس التداخل بيو-طبقة. وأكد الأهمية البيولوجية لربط فيترونيكتين للبروتين ح على سطح الخلية البكتيرية في تهرب الاستجابة المناعية المضيف باستخدام مقايسة مقاومة مصل مع مصل الدم البشري الطبيعي والمنضب فيترونيكتين. وقد تم تحليل أهمية فيترونيكتين في التقيد البكتيرية باستخدام الشرائح الزجاجية مع أو بدون طلاء فيترونيكتين، متبوعاً بصبغة غرام. وأخيراً، كان التحقيق التصاق البكتيريا إلى مونولاييرس الخلايا الظهارية السنخية البشرية. البروتوكولات المذكورة هنا يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أي الأنواع البكتيرية من الفائدة.
المقدمة
فيترونيكتين (Vn) بروتين سكري بشرية هامة مشاركة في الحفاظ على التوازن عن طريق تنظيم النظام فيبرينوليتيك. Vn يعمل أيضا كمنظم تكملة عن طريق تثبيط في مسار تكملة المحطة الطرفية أثناء تكوين مجمع C5b6-7 والبلمره C9. أظهرت العديد من مسببات الأمراض البكتيرية لتجنيد Vn إلى سطح الخلية كوسيلة لتكملة مقاومة ترسب1،2،3. وبالإضافة إلى ذلك، يعمل Vn كجزيء "ساندويتش" بين البكتيريا والمضيف مستقبلات الخلايا الظهارية، وبالتالي تعزيز الالتزام واستيعاب العوامل الممرضة2،،من45. هو وساطة ملزمة Vn إلى سطح الخلي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-تحليل Vn كما يجند بروتين سطحي البكتيري
-
كشف ملزم Vn في السطح البكتيرية باستخدام التدفق الخلوي
ملاحظة: في التدفق الخلوي، كنا الجانب مبعثر ومبعثر الأمام بوابة الأحداث الإيجابية. يعزل منطقياً السريرية لدراسة التفاعلات مع Vn، (n = 10) وقد تم اختيار7 جنبا إلى جنب مع BL21 كولاي (DE3) كعنصر تحكم سلبية (الشكل 1أ).- ثقافة سكانية السريرية يعزل في المخ-القلب ضخ (بهي) المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكروغرام/مل ند وهيمن على 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة. استخدام لوريا بيرتاني المتوسطة للثقافة كولاي14. حصاد منطقياً في سجل منتصف ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
Vn-ملزمة على سطح البكتيريا تحددها التدفق الخلوي. توظيف جميع منطقياً يعزل السريرية اختبارها في هذه الدراسة Vn إلى سطح الخلية. وقد لوحظ لا تفاعل Vn مع سطح الخلية لسلالة كولاي المراقبة السلبية (الشكل 1أ). كما هو مبين في الشكل 1ب، الأس الهيدروجيني بروتين ملزمة Vn رئيسية على سطح الخلايا منطقياً. ملزمة من Vn بالسلالة منطقياً WT M10 تسبب في حدوث تحول في السكان، بينما M10Δ سكانيةlph غير.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعيين Vn إلى سطح الخلية مسببات الأمراض البكتيرية والاستفادة من هذا منظم مكملاً لمنع ترسب عوامل مكملة والانتهاء من غشاء معقدة هجوم2. Vn يعمل أيضا كجزيء جسر بين البروتينات السطحية البكتيرية ومستقبلات سطح الخلية المضيفة، مما مكن مسببات الأمراض التمسك بسطح الخلايا الظهارية والتوسط فيما بعد استيعاب. في هذه الدراسة، يمكننا وصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها لتقدير ط) ملزمة Vn على سطح الخلايا البكتيرية، وتفاعلات البروتين البروتين الثاني) وثوابت تقارب، وثالثاً) دور وظيفي من Vn في توفير مصل المقاومة وتعز.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
وكان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة أنا وبيرغر إدوين هيرتا لارس، O.E. ومؤسسة ادلا جوهانسون، "مجلس البحوث الطبية السويدية" (منح رقم K2015 57 س-03163-43-4، www.vr.se)، "مؤسسة مكافحة السرطان" في الجامعة مستشفى في مالمو الفيزيوغرافية المجتمع (فورسمان في المؤسسة)، ومجلس مقاطعة Skåne البحوث ومؤسسة التنمية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل خلاط حراري | Eppendorf | 5355 | شاكر تسخين وتبريد بلوك جاف |
| 5 مل أنبوب البوليسترين المستدير القاع ؛ | BD Falcon | 60819-138 | 12 & مرات 75 مم نمط |
| 5٪ CO2< / sub> حاضنة الموردة | ثرمو علمية | BBD6220 | |
| 6 مل أنبوب البوليسترين المستدير السفلي ; | VWR | 89000-478 | 12 & مرات نمط 75 مم مع غطاء |
| 24 بئر ألواح | BD Falcon | 08-772-1H | درجة ثقافة الخلايا |
| 30٪ بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub>) محلول | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | التحليل المختبري الصف |
| 75 سم 2< / sup> قارورة زراعة الأنسجة | BD Falcon | BD353136 | التهوية |
| 96 لوحة قاع مسطحة سوداء | جيدا Greiner Bio-One | 655090 | ثقافة الأنسجة المعالجة والجزئية ؛ لوحات سوداء واضحة |
| A549 خط الخلية البشري | سيجما ألدريتش | 86012804-1VL | |
| إنزيم انفصال الخلية (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | مستشعرات AR2G من فئة ثقافة الخلية |
| Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to Imfixed Protein عن طريق الاقتران الأميني ؛ | |
| Acetone | VWR | 97064-786 | |
| ألبومينات مصل الأبقار من الدرجة التحليلية (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | مناسبة لزراعة الخلايا |
| ورقة الكتاب المقدس ؛ | VWR | 28511-007 | |
| مقياس تداخل الطبقة الحيوية | Pall Life Science | FB-50258 | معدات قياس قياس التداخل ثنائي الطبقة |
| محلول كريستال بنفسجي | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (بروتين ملزم C4b) Complement | Technology، Inc. | تم شراء A109 | كشكل سائل مجمد |
| كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| محلول Carbol-fuchsin | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| حامض الستريك | Sigma-Aldrich | 251275-500G | من الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS) |
| Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | ||
| الإشريكية القولونية< / em> مضيف (E. القولوني< م > BL21) | Novagen | 69450-3 | مضيف تعبير البروتين |
| F12 متوسط | Sigma-Aldrich | D6421 | الخلوي لثقافة |
| BD Biosciences | 651154 | درجة تحليل الخلايا للتطبيقات البحثية | |
| مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) | سيجما ألدريتش | 12003C | مناسب لزراعة الخلايا |
| مصل بشري عادي (NHS) | Complement Technology، Inc. | NHS | مصل بشري |
| FITC مترافق الحمار المضادة للأغنام | AbD Serotec | STAR88F | جنتاميسين متعدد النسيلة |
| سيجما-ألدريتش | G1397 | درجة ثقافة | |
| الخلية الجلوكوز | سيجما-ألدريتش | G8270-1KG | |
| الجيلاتين | سيجما-ألدريتش | G9391 | مناسب لزراعة الخلايا |
| مقياس الدم | Marienfeld | 640210 | |
| HRP مترافق الأجسام المضادة للعلامة | Abcam | ab1269 | متعدد النسيلة |
| H | Complement Technology، Inc. | A137 | كشكل سائل مجمد |
| C4BP | Complement Technology، Inc. | A109 | محلول مجمد |
| مصل الألبومين البشري | Sigma-Aldrich | A1653-10G | مسحوق مجفف بالتجميد |
| عمود راتنج تقارب الهيستيدين (HisTrap HP) GE | Health Care Life Science | 17-5247-01 | أعمدة معبأة مسبقا مع Ni Sepharose |
| His الموسومة PH | تم التعبير عنه وتنقيتها بشكل مؤتلف في مختبرنا | ||
| محلول اليود | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| الميثانول | VWR | BDH1135-1LP | درجة التحليل |
| مجهر | أوليمبوس | IX73 | مجهر مقلوب |
| شرائح | Sigma-Aldrich | S8902 | عادي ، مقاس 25 مم & مرات ؛ 75 مم & nbsp ؛ |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2< / sub>) يحتوي | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid على محطة C 6x علامته على العمود الفقري (pET26 (b)) Novagen | 69862-3 | ناقلات الحمض النووي | |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | |
| لهيدروكسيد البوتاسيوم ELISA (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS) درجة |
| الأغنام الأجسام المضادة ل Vn المضادة للإنسان | AbD Serotec | AHP396 | شاكر متعدد النسيلة |
| ؛ | ستيوارت ساينتفيك | STR6 | منصة شاكر |
| قارورة زراعة الأنسجة | BD Falcon | 3175167 | 75 سم2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | شاكر تسخين وتبريد البلوك الجاف |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | |
| ELISA grade Vitronectin (Vn) من البلازما البشرية | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | درجة ثقافة الخلايا |
المراجع
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
