طريقة لقياس الحمض النووي الريبي N 6 -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

Chao-Yung Wang; Mei-Hsiu Lin; Hui-Ting Su

doi:10.3791/54672

مقالة منهجية

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي N 6 -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

DOI:

10.3791/54672

⸱

ديسمبر 5, 2016

Chao-Yung Wang¹ , Mei-Hsiu Lin¹ , Hui-Ting Su¹

¹Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف طريقة النشاف شمال المعدلة لقياس N ⁶ -methyladenosine (م ⁶ أ) التعديلات في الحمض النووي الريبي. الطريقة الحالية يمكن الكشف عن تعديلات في الرنا متنوعة والضوابط في إطار مختلف التصاميم التجريبية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N 6-Methyladenosine (m⁶A) تعديلات الحمض النووي الريبي متنوعة ومنتشرة في كل مكان بين حقيقيات النوى. تحدث في mRNA و rRNA و tRNA و microRNA. كشفت الدراسات الحديثة أن تعديلات الحمض النووي الريبي القابلة للانعكاس هذه تؤثر على تضفير الحمض النووي الريبي وترجمته وتدهوره وتوطينه. يتم أيضا التحكم في العمليات الفسيولوجية المتعددة ، مثل إيقاعات الساعة البيولوجية ، وتعدد القدرات في الخلايا الجذعية ، والتليف ، واستقلاب الدهون الثلاثية ، والسمنة عن طريق تعديلات m⁶A. يعد الترسيب المناعي / التسلسل ، وقياس الطيف الكتلي ، والنشاف الشمالي المعدل بعض الطرق المستخدمة بشكل شائع لقياس تعديلات m⁶A. هنا ، نقدم تقنية نشاف شمالية شرقية لقياس تعديلات m⁶A. يوفر البروتوكول الحالي فصلا جيدا للحمض النووي الريبي ، وتيسيرا أفضل وتوحيدا مناسبا لمختلف التصميمات التجريبية ، وتحديدا واضحا لتعديلات m⁶A في مصادر مختلفة من الحمض النووي الريبي. في حين أن تعديلات m⁶A معروفة بأن لها تأثيرا حاسما على فسيولوجيا الإنسان المتعلقة بإيقاعات الساعة البيولوجية والسمنة ، فإن أدوارها في الحالات الفسيولوجية (المرضية) الأخرى غير واضحة. لذلك ، فإن التحقيقات على تعديلات m⁶A لديها إمكانية هائلة لتوفير رؤى رئيسية في علم وظائف الأعضاء الجزيئي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب تعديلات الحمض النووي الريبي الديناميكية والقابلة للانعكاس أدوارا مهمة في توازن الحمض النووي الريبي. قبل أربعة عقود ، وجد أن تعديلات N 6-methyladenosine (m⁶A) وفيرة في النسخ حقيقية النواة¹. لديهم وظائف متنوعة في الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) ، والحمض النووي الريبي الريبوسومي (rRNA) ، والحمض النووي الريبي النووي الصغير ، ونقل الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي^{الميكروي 2}. تؤثر تعديلات m⁶A ل mRNA على التضفير³ ، والترجمة⁴ ، والتدهور⁵ ، والتوطين². علاوة على ذلك ، فإنها تؤثر على التكوين الحيوي للريبوسوم ووظيفة الحمض النووي الريبي^{الصغير 6}. لوحظ الحفظ التطوري ل m⁶A تعديلات الحمض النووي الريبي في البكتيريا أحادية الخلية إلى البشر متعدد الخلايا⁷. يخضع تحديد أدوار تعديلات m⁶A حاليا لاستكشاف مكثف. من المتوقع أن توفر الجهود رؤى جديدة حول التحكم في النسخ. تكشف الدراسات الحديثة أن التعديلات الكيميائية الأخرى ل mRNA⁸ تلعب أيضا أدوارا حاسمة في استقلاب الحمض النووي الريبي.

إيقاعات الساعة البيولوجية⁹ ، تعدد القدرات للخلايا الجذعية¹⁰ ، استقلاب الدهون^{الثلاثية 4} ، التليف¹¹ ، السمنة¹² ، والاكتئاب الشديد¹³ هي أمثلة قليلة على العمليات التي من المعروف فيها أن تعديلات m⁶A تتحكم في النتائج. تحتوي العديد من نصوص جينات الساعة البيولوجية على م⁶مواقع^{A 14}. يؤدي تعديل م⁶أ ميثيلاز أو ديميثيلاز إلى تغييرات في الفترة اليومية¹⁵. Mettl3 ، وهو m⁶A transferase ، هو منظم لتعدد القدرات في الخلايا الجذعية. يؤدي نقص Mettl3 إلى الفتك الجنيني المبكر وتحضير النسب الشاذ في مرحلة ما بعد الزرع¹⁰. يؤثر نقص كتلة الدهون والسمنة المرتبطة (FTO) ، و m⁶A demethylase ، في الخلايا الشحمية على تعبئة الأحماض الدهنية ووزن الجسم من خلال تنظيم ما بعد النسخ ل Angptl4⁴. تكشف هذه الدراسات أن m⁶A لا يتحكم فقط في معالجة mRNA ، ولكنه يلعب أيضا أدوارا حاسمة في التطور الجنيني وعلم وظائف الأعضاء المرضية. وظيفة التعديلات^{m 6}A لها آثار على الاعتبارات العلاجية في المستقبل.

تتوفر عدة طرق لقياس m⁶A تعديلات الحمض النووي الريبي^16-18. تقليديا ، يتم استخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لدراسة توزيع m⁶A في العديد من الحمض النووي الريبي^19،20. قياس الطيف الكتلي هو أداة حساسة للكشف عن تعديلات m⁶A في الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يحتاج الحمض النووي الريبي إلى استئصال بواسطة RNase إلى أجزاء قصيرة قبل التحليل بواسطة قياس الطيف الكتلي²¹. ترسيب ومتسلسل مناعي ميثيل الحمض النووي الريبي (م⁶A-Seq) ²² يترسب مناعية الحمض النووي الريبي المجزأ مع الأجسام المضادة الخاصة^{ب m 6}A ويقوم بتسلسل الحمض النووي الريبي المتوازي. تولد هذه الطريقة مناظر طبيعية بعرض النسخ^{m 6}A. رسم خرائط عالية الدقة ل m⁶A الربط المتقاطع والترسيب المناعي بدقة النوكليوتيدات الفردية (miCLIP) يرسم خرائط إضافية ل m⁶A التعديلات بدقة نوكليوتيدات^{واحدة 23}. توفر كلتا الطريقتين تفاصيل تعديل m⁶A عبر النسخ بأكمله ، مع معلومات جينات محددة. ومع ذلك ، فإن التقديرات الكمية والتوحيد القياسي في كلتا الطريقتين يصعب إذا كانت التجارب تتطلب مقارنة شروط متعددة. علاوة على ذلك ، فإن تجزئة الحمض النووي الريبي ل m⁶A-Seq تغير بنية الحمض النووي الريبي الأصلية ، والتي قد تؤثر على مستويات m⁶A الأصلية. للكشف عن تعديلات m⁶A العالمية للحمض النووي الريبي وتغيراتها في ظل ظروف تجريبية مختلفة ، أبلغنا عن طريقة تستخدم بروتوكول نشاف شمالي معدل. تعمل هذه الطريقة على حل الحمض النووي الريبي عن طريق الوزن الجزيئي ، باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام¹⁸. يوفر هذا الإجراء توحيدا وتقديرات كمية أفضل للتجارب التي تتضمن شروطا أو عينات متعددة. كما يوفر معلومات تعديل m⁶A محددة للحمض النووي الريبي المختلفة ، سواء كانت rRNA أو mRNA أو microRNA.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: الحمض النووي الريبي مجموع م ويشمل ⁶ مستوى الريباسي، مرنا، وغيرها من الرنا الصغيرة. منذ الحمض النووي الريبي الريباسي لديها وفرة م ⁶ والتعديلات، وقياس متر ^و6 والمستويات في حاجة إلى النظر في هذا الواقع.

1. عزل الحمض النووي الريبي

باستخدام حل ريبونوكلياز إزالة التلوث (رش على مناشف ورقية)، ومسح الماصات والسطوح مختبر مقاعد البدلاء. مناشف ورقية مبللة بالماء nuclease خالية ومسح أسفل الماصات والسطوح مختبر مقاعد البدلاء مرة أخرى.
استخراج الحمض النووي الريبي
1. مجموع العزلة RNA
  1. باستخدام النمام في سماء المنطقة، التجانس 50-100 ملغ من الأنسجة أو 5-10 × 10 ⁶ الخلايا في 1 مل من محلول الحمض النووي الريبي العزلة الحفاظ على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: عن الأنسجة (100-150 ملغ) قد تكون هناك حاجة لعينات الأنسجة الدهنية من الفئران بسبب انخفاض تركيز الحمض النووي الريبي فيه. عينات من مصادر من قلب فأر والكبد والعضلات والهيكل العظمي والرئة والدماغ، ولقد استخدمت الضامة قبل ^4.
  2. فيcubate على الخليط عينة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من 1-برومو-3-chloropropane (BCP) لكل 1 مل من عينة جناسة. تهز أنابيب بقوة لمدة 15 ثانية، والشروع في عزل الحمض النووي الريبي الإجمالي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ^24.
2. مذيل بعديد الأدينيلات مرنا تنقية من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة
  1. تنقية مرنا مذيل بعديد الأدينيلات باستخدام مجموعات أو البروتوكولات المتاحة.
    1. يهز جيدا لإعادة تعليق كل الحلول التالية: 2X حل ملزم، بنسبة ضئيلة (DT) الخرز البوليسترين، ومحلول الغسيل. ضمان بنسبة ضئيلة (DT) الخرز الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    2. نقل 120 ميكرولتر من محلول شطف للإعداد في أنبوب والحرارة إلى 70 درجة مئوية في كتلة التدفئة.
    3. ماصة يصل إلى 500 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع في أنبوب microcentrifuge. مع nuclease خالية من المياه، وضبط مستوى الصوت إلى 250 ميكرولتر.
    4. إضافة 250 ميكرولتر من حل ملزم 2X إلى الحمض النووي الريبي مجموع ذلكlution ودوامة لفترة وجيزة لخلط المحتويات.
    5. إضافة 15 ميكرولتر من بنسبة ضئيلة (DT) الخرز ودوامة جيدا لخلط.
    6. احتضان الخليط عند 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    7. إزالة عينة من كتلة التدفئة والسماح لها الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    8. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 2 دقيقة.
    9. إزالة بعناية طاف، تاركا وراءه ما يقرب من 50 ميكرولتر.
    10. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل لإعادة تعليق بيليه من قبل pipetting.
    11. ماصة تعليق في مجموعة أنبوب فلتر تدور / جمع.
    12. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة عمود من أنبوب جمع والتخلص من التدفق من خلال. العودة العمود إلى أنبوب جمع.
    13. ماصة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل على فلتر زيادة ونقصان.
    14. أجهزة الطرد المركزي في 15000 س ز لمدة 2 دقيقة.
    15. نقل مرشح تدور في أنبوب جمع جديدة.
    16. ماصة 50 ميكرولتر من محلول شطف ساخنةإلى 70 درجة مئوية على مركز للتصفية زيادة ونقصان.
    17. احتضان لمدة 2-5 دقائق عند 70 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة.
    18. ماصة على 50 ميكرولتر إضافية من حل شطف تسخينها إلى 70 درجة مئوية على مركز للتصفية زيادة ونقصان.
    19. كرر الخطوة 1.2.2.1.18.
  2. إضافة 100 ميكروغرام / مل الجليكوجين، 0.1 حجم 3 عازلة M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2)، و 2.5 مجلدات من الايثانول المطلق. يعجل بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 25 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
  4. غسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 75٪. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة بعناية الإيثانول.
  5. تجف في الهواء لمدة 3-5 دقيقة.
  6. إضافة 10 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه بحل بيليه.
  7. تخزين في -70 درجة مئوية.
RNA التأهيل النوعي والكمي
1. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، تحديد تركيز الحمض النووي الريبي NOTIنانوغرام الامتصاصية في 260 نانومتر و 280 نانومتر. وينبغي أن تكون نسبة _{_260/280} 1،8-2،2.
2. تحقق من جودة عينة الحمض النووي الريبي باستخدام 0.8٪ هلام الاغاروز الكهربائي ^25.
  ملاحظة: الحمض النووي الريبي مجموع حقيقية النواة سليمة يجب أن تظهر مكثفة العصابات 28S و 18S الريباسي. نسبة 28S مقابل 18S الريباسي كثافة الفرقة لإعداد RNA الجيد هو ~ 2.

2. جل الكهربائي ونقل

ملاحظة: يتم إعطاء بروتوكولات إعداد عازلة في الجدول 1.

إعداد جل الفورمالديهايد (1٪)
1. شطف جميع المعدات الكهربائي مع diethylpyrocarbonate (DEPC) المياه.
2. تذوب 2.5 غرام من الاغاروز في 215 مل من الماء DEPC تماما في فرن الميكروويف.
3. إضافة 12.5 مل من 10X 3- (N- morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف) العازلة و 22.5 مل من 37٪ الفورمالديهايد.
4. سكبه في الجهاز الكهربائي مع مشط سميكة 1.5 مم.
5. القضاء على فقاعات أو دفع رتنحنح إلى حواف من هلام مع مشط نظيف.
6. السماح للهلام ليصلب في درجة حرارة الغرفة.
إعداد عينة
1. مزيج 1-10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع و 11.3 ميكرولتر من عينة العازلة.
2. مزيج 2 ميكروغرام من علامة الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام / ميكرولتر) مع 11.3 ميكرولتر من عينة العازلة.
3. إضافة nuclease خالية من المياه إلى عينات من 2.2.1 و2.2.2 إلى الحجم الكلي لل16 ميكرولتر.
4. الحرارة عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم البرد على الجليد.
5. مزيج 16 ميكرولتر من عينة من 2.2.3 مع 4 ميكرولتر من تتبع الصبغ الذي يحتوي على 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر إيثيديوم بروميد على الجليد.
  تنبيه: بروميد إيثيديوم هو ماسخ والسامة وربما في حالة استنشاقه. قراءة إيثيديوم بروميد رقة بيانات السلامة.
الكهربائي
1. إضافة 200 مل من 10X اجتماعات الأطراف العازلة إلى 1800 مل من ده ₂ O لجعل العازلة تشغيل 1X اجتماعات الأطراف.
2. استخدام العازلة تشغيل 1X اجتماعات الأطراف لشطف الآبار من هلام.
3. ما قبل التشغيل رقال جل في 20 V لمدة 5 دقائق.
4. تحميل عينات الحمض النووي الريبي في الآبار من هلام.
5. يغطى بورق لتجنب التعرض للضوء. تشغيل في 35 V لمدة 17 ساعة (بين عشية وضحاها)
6. فحص وتصوير هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
تحويل
1. قطع هلام لإزالة الجزء غير المستخدم.
2. إعداد 500 مل من العازلة 10X SSC (250 مل من 20x وعازلة SSC و 250 مل من الماء DEPC).
3. غسل هلام مرتين مع 10x عازلة SSC لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز في 50 دورة في الدقيقة.
4. قطع ورقة ورقة 1 مرشح كبيرة بما فيه الكفاية لتكون بمثابة ورقة الفتيل، والتي تمتص عازلة نقل من علبة نقل (الشكل 1).
5. قطع 4 قطع من ورق الترشيح لنفس الحجم مثل هلام.
6. قطع 1 ورقة من غشاء النايلون المشحونة إيجابيا لنفس حجم هلام.
7. بمناسبة الشق على هلام والغشاء كعلامة لضمان التوجه السليم.
8. نقع غشاء العازلة في SSC 2X لمدة 15 دقيقة.
9. صب 500 مل سو 10X SSC العازلة في علبة نقل.
10. وضع ورقة ورقة فلتر كبيرة عبر لوحة من الزجاج والرطب ورقة الترشيح مع العازلة نقل.
11. طرح أي فقاعات مع ماصة.
12. نقع 2 قطعة من ورق الترشيح قبل قطع العازلة في نقل ووضعها في وسط ورقة الترشيح من الخطوة 2.4.5. إزالة أي فقاعات.
13. وضع الجل أعلى الجانب السلبي على ورقة الترشيح.
14. وضع غشاء على أعلى من هلام. محاذاة الشقوق من هلام والغشاء.
15. ضع 2 قطعة من ورق الترشيح قبل قطع على رأس الغشاء والرطب ورقة الترشيح مع العازلة نقل.
16. إزالة أي فقاعات بين الطبقات.
17. تطبيق غلاف بلاستيكي حول هلام لضمان أن المناشف استيعاب سوى عازلة مرورا جل والغشاء.
18. كومة من المناشف الورقية على رأس ورقة الترشيح.
19. وضع لوحة زجاجية كبيرة الحجم على رأس المناشف.
20. وضع الوزن على الجزء العلوي من كومة.
21. إبقاء بين عشية وضحاها للسماح الحمض النووي الريبي لنقل من الجل على الغشاء.

3. الكشف عن N ⁶ -methyladenosine

غشاء يشابك
1. الحفاظ على غشاء رطبة في المخزن 2X SSC.
2. وضع 2 ورقة من ورق الترشيح مغمورة مع 10x عازلة SSC إلى crosslinker للأشعة فوق البنفسجية.
3. وضع غشاء على رأس ورقة الترشيح، مع الجانب الحمض النووي الريبي كثف مواجهة.
4. حدد "وضع autocrosslink" (120،000 μJ) واضغط على زر "ابدأ" لبدء التشعيع.
5. فحص الغشاء وهلام مع الأشعة فوق البنفسجية الماسك صورة هلام لتأكيد نقل الحمض النووي الريبي من الجل على الغشاء.
Immunoblotting
1. منع الغشاء في 5٪ الحليب الخالي من الدسم في مخزنة المالحة تريس، مع توين 20 (TBST) عازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
2. يغسل ثلاث مرات مع العازلة TBST لمدة 15 دقيقة.
3. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها في م ⁶ ألف (<م> ن ⁶ -methyladenosine) حل الأجسام المضادة (1: 1000 في 5٪ الخالي من الدسم عازلة الحليب TBST) في 4 درجات مئوية.
4. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع العازلة TBST لمدة 15 دقيقة.
5. احتضان الغشاء في المضادة للأرنب حل حمار HRP-مترافق الأجسام المضادة (1: 2000 في الخالي من الدسم عازلة الحليب TBST 5٪) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
6. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع العازلة TBST لمدة 15 دقيقة.
7. تطبيق الركيزة chemiluminescent تعزيز (0.125 مل لكل سم ² من الغشاء).
8. القبض على التوهج مع الإعدادات المثلى للتصوير الرقمي، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ^26.
م ⁶ والكمي
1. قياس النسبية م ⁶ وكثافة chemiluminescent باستخدام برنامج ImageJ.
  1. ضمن القائمة البرمجيات يماغيج، حدد الخيار "ملف" لفتح ملف ذات الصلة.
  2. حدد "مستطيل" أداة من يماغيج ورسم إطار حولالإشارات.
  3. إذا RNA الريباسي ليس التركيز على التجارب، وتجنب 18S و 28S الريباسي الحمض النووي الريبي م ⁶ والعصابات في الحساب.
  4. انقر على "قيادة" و "1" لتأكيد الممر المحدد.
  5. اضغط على "قيادة" و "3" لإظهار مؤامرة المحدد.
  6. انقر فوق الأداة "مستقيم" ورسم خطوط لفصل منطقة مجزأة.
  7. انقر على "العصا" أداة لتسجيل القياسات.
  8. تصدير البيانات.
  9. تطبيع مستويات م ⁶ ومع 18S RNA الريباسي الفرقة من تلطيخ بروميد إيثيديوم.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد 14 يوما في المرحلة الساعة البيولوجية العادية ضوء الظلام، وضعت الفئران من النوع البري في الظلام مستمر. تم أخذ عينات من الرنا من الكبد في 4 فترات ساعة ودرس مع النشاف شمال تعديلها. تم الكشف عن مثيلة من rRNAs، من mRNAs، والرنا صغيرة بشكل واضح (الشكل 2). المقارنة بين أوقات الإيقاعية المختلفة (CT) يمكن أن تحسب بدقة مع المعيار 18S الريباسي. وكان هناك تذبذب الساعة البيولوجية قوية من م ⁶ والمستويات في الريباسي، مرنا، والرنا الصغيرة.

لتجنب التدخل المعروضة من قبل الريباسي، الرنا مذيل بعديد الأدينيلات يمكن تنقيته، كما في الخطوة 1.2.2. بعد تنقيتها، والريباسي يمكن القضاء عليها إلى حد كبير للسماح التصور أفضل من الرنا الأخرى (الشكل 3).

figure-results-1
ز> الشكل 1: تجميع وحدة نقل وصمة عار. وأظهرت وحدة نقل الشعرية لالنشاف الحمض النووي الريبي لغشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: إيقاع الساعة البيولوجية للومستويات م ⁶ في C57BL / 6J الفئران. ويظهر هذا الرقم م ⁶ وصمة عار من الحمض النووي الريبي مجموع من كبد البرية من نوع الفئران التضحية في اليوم الأول من مرحلة مظلمة الظلام بعد 14 يوما من مرحلة ضوء الظلام العادية في 4 ساعات فترات. وقد تم القياس الكمي باستخدام م ⁶ فرق كثافة الصورة بين 18S و 28S الريباسي. تم تطبيع م ⁶ وفرة إلى الفرقة 18S الريباسي من هلام الفورمالديهايد في القاع.وآخرون = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الرقم 3: م ⁶ والبقع مع أو بدون الريباسي. تمثيلية م ترد ⁶ والبقع من الحمض النووي الريبي مجموع وRNA مذيل بعديد الأدينيلات من كبد البرية من نوع الفئران. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: المخازن المؤقتة والحلول.

1	عازلة 10X اجتماعات الأطراف (7.0 درجة الحموضة، وحماية من الضوء)
	اجتماعات الأطراف	41.85	ز	0.2 M
	أسيتات الصوديوم	4.1	ز	0.05 M
	EDTA، الصوديوم الملح	3.7	ز	0.01 M
	المياه DEPC
	مجموع	1	L
	يقلب في درجة حرارة الغرفة
2	20x وعازلة SSC (7.0 درجة الحموضة)
	كلوريد الصوديوم	175.3	ز	3 M
	سترات الصوديوم	88.3	ز	0.3 M
	المياه DEPC
	مجموع	1	L
	يقلب في درجة حرارة الغرفة، ثم الأوتوكلاف
3	صبغ تتبع
	عازلة 10X اجتماعات الأطراف	500	ميكرولتر	1X
	Ficoll 400	0.75	ز	15٪
	برموفينول الأزرق	0.01	ز	0.2٪
	سيانول زايلين	0.01	ز	0.2٪
	المياه DEPC
	مجموع	5	مل
	مخزن في -20 ° C
4	المياه DEPC
	تمييع النسبة 1: 1000 من DEPC في ده ₂ O
	يقلب بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، ثم الأوتوكلاف
5	عينة العازلة (حماية من الضوء)
	عازلة 10X اجتماعات الأطراف	200	ميكرولتر
	37٪ الفورمالديهايد	270	ميكرولتر
	الفورماميد	660	ميكرولتر
	مخزن في -20 ° C

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعديلات الحمض النووي الريبي لها أدوار مهمة في الوظيفة الخلوية وعلم وظائف الأعضاء. لا يزال الفهم الحالي لتنظيم هذه التعديلات ووظيفتها ووازنها قيد الاستكشاف والتوسع⁸. لذلك ، هناك حاجة إلى طريقة دقيقة وذهبية لتقييم تعديلات الحمض النووي الريبي. توفر طريقة النشاف الشمالي المعدلة تقديرا كميا دقيقا لتعديلات الحمض النووي الريبي وتحديدا واضحا للتعديلات في الحمض النووي الريبي المتنوع. على الرغم من أن الطريقة تتطلب 3 أيام على الأقل ، إلا أنه يمكن توحيدها ويمكن استخدامها في تصميمات تجريبية مختلفة. علاوة على ذلك ، مع الأجسام المضادة المختلفة ، يمكنه اكتشاف تعديلات مختلفة على الحمض النووي الريبي²⁷.

من المهم فصل الحمض النووي الريبي المختلفة عند تحليل تعديلات الحمض النووي الريبي. يشتمل الحمض النووي الريبي الريبوزومي على جزء كبير من الكمية الإجمالية لل RNA^28,29. ستمثل نتائج تحليل تعديلات الحمض النووي الريبي فقط في إجمالي الحمض النووي الريبي في الغالب تغيرات الحمض النووي الريباسي. يمكن أن تخفي المثيلة وغيرها من التعديلات المماثلة للحمض النووي الريبي التغييرات في الحمض النووي الريبي الأخرى. من خلال إجراء فصل الهلام ، يمكن تحليل تعديلات mRNA وغيرها من الحمض النووي الريبي الصغير بشكل أكثر دقة.

يوفر رسم الخرائط على مستوى النسخ باستخدام الترسيب المناعي والتسلسل m⁶A نظرة ثاقبة مفصلة لتعديل كل نوع من أنواع الحمض النووي الريبي²². يوفر معلومات عن الحمض النووي الريبي المحدد ودقة حوالي 80-120 نقطة أساس. على الرغم من أن m⁶A-Seq يمكنه مقارنة التعديلات بين الظروف التجريبية المختلفة ، إلا أن اختيار المعايير والضوابط المناسبة لمثل هذه التجارب أمر صعب¹⁸. يصعب إعادة إنتاج الترسيب المناعي ، وغالبا ما يعطي اختلافات كبيرة بين التكرارات. علاوة على ذلك ، يتطلب m⁶A-Seq تجزئة عينات الحمض النووي الريبي قبل الترسيب المناعي والتسلسل³⁰. من المحتمل أن تؤدي عملية التجزئة إلى تأثيرات لا داعي لها على تعديلات الحمض النووي الريبي الأصلية. إذا كانت التجربة لا تحتاج إلى معلومات الجين المحدد ولكنها تتطلب شروطا مختلفة للمقارنة ، فإن الطريقة الحالية توفر تصورا وتحكما أفضل للإعدادات التجريبية المتنوعة.

يعد تعديل الحمض النووي الريبي خطوة مهمة في تنظيم التحكم في النسخ³¹. ومع ذلك ، فإن التوازن والآليات التنظيمية لتعديلات الحمض النووي الريبي المختلفة في ظل عوالم فسيولوجية متنوعة لا تزال غير واضحة. باستخدام طريقة النشاف الشمالي المعدلة الحالية ، يمكن قياس تعديلات الحمض النووي الريبي المختلفة ومقارنتها. علاوة على ذلك ، يمكن التحقيق في التغييرات واللوائح الخاصة بتعديلات الحمض النووي الريبي بمزيد من التفصيل. في المستقبل ، قد يكون من الممكن أيضا الجمع بين البيانات التجريبية من كل من النشاف الشمالي الكلاسيكي وبروتوكولات النشاف الشمالي المعدلة ، مما يوفر رؤى أكبر في بيولوجيا الحمض النووي الريبي.

العامل الأكثر أهمية الذي يحدد نجاح بروتوكول النشاف الشمالي المعدل هو سلامة عينة الحمض النووي الريبي. قد تؤدي الحمض النووي الريبي مع قدر من التدهور إلى نتائج نشاف شمالية كلاسيكية جيدة ، ولكن من المحتمل أن يكون لهذا تأثير كبير على نتائج النشاف الشمالي المعدلة. يمكن أن تختلف تعديلات الحمض النووي الريبي في الأنسجة أو خطوط الخلايا المختلفة بشكل كبير. من المهم اختبار أحمال عينة الحمض النووي الريبي المناسبة للأنسجة المختلفة قبل إجراء التجارب النهائية.

نظرا لأن إجراءات النشاف قد سميت تقليديا على اسم الدكتور الجنوبي والاتجاهات الجغرافية المختلفة ، فإننا نقترح اسم النشاف "الشمالي الشرقي" للتقنية الحالية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.W. تلقى الدعم من المعهد الوطني للبحوث الصحية (NHRI-EX101-9925SC) ، والمجلس الوطني للعلوم (101-2314-B-182-100-MY3 ، 101-2314-B-182A-009) ، ومستشفى تشانغ غونغ التذكاري (CMRPG3B1643 و CMRPG3D1002 و CMRPG3D0581 و CMRPG380091 و CMRPG3C1763).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حل RNaseZap	بروتوكول Ambion	AM9782	1.1
حل كاشف TRI	بروتوكول	AM9738	1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) بروتوكول	Sigma	B9673	1.2.1.3
بروتوكول الإيثانول	JTbaker	8006	1.2.1.3
الأيزوبروبانول	سيجما	I9516	1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	بروتوكول Sigma	MRN70	1.2.2.1
بروتوكول الجليكوجين	أمبيون	AM9510	1.2.2.2
أسيتات الصوديوم	فلوكا	71183	البروتوكول 1.2.2.2
المياه الخالية من النوكلياز	بروتوكول أمبيون	AM9930	1.2.2.6
بروتوكول DEPC	Sigma	D5758	2.1.1
Agarose	JT Baker	بروتوكول A426	2.1.2
MOPS	بروتوكول Sigma	M1254	2.1.3
محلول الفورمالديهايد 37٪	بروتوكول Sigma	F8775	2.1.3
EDTA ، ملح ثنائي الصوديوم	JT Baker	8993	البروتوكول 2.1.3 10x MOPS عازلة
فورماميد	Sigma	F7503	البروتوكول 2.2.1
RNA علامة الألفية	Ambion	AM7150	البروتوكول 2.2.2
بروتوكول الإيثيديوم بروميد	أمريسكو	X328	2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	البروتوكول 2.2.5 صبغة التتبع
بروموفينول الأزرق	سيجما	114391	البروتوكول 2.2.5 صبغة تتبع
الزيلين سيانول FF	سيجما	X4126	البروتوكول 2.2.5 صبغة التتبع
كلوريد الصوديوم ثنائي هيدرات	جي تي بيكر	3624	البروتوكول 2.4.2 20x SSC عازلة
ثلاثي الصوديوم	سيجما	S1804	بروتوكول 2.4.2 20x SSC عازلة
Hybond Blotting Paper	GE Healthcare	RPN6101M	Protocol 2.4.4
GE Hybond-N + غشاء	GE Healthcare	RPN303B	Protocol 2.4.6
ستراتالينكر الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker 2400	ستراتاجين	400075	بروتوكول 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT Technology	Gel Catcher 1500	Protocol 3.1.5
Anti-m^{6< / sup>A (N^{6< / sup>-methyladenosine)}}	أنظمة Synaptic	202003	Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG ، بروتوكول Ab	GE Healthcare	NA934	بالكامل 3.2.5
نظام ChemiDoc MP	بروتوكول 1708280 BIO-RAD		3.2.8

بروتوكول سترات المرتبط ب HRP

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127(2015).
Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438(2015).
Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27(2014).
Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445(2010).
Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874(2016).
Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).
Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

m6A

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي N 6 -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة