مقالة منهجية

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

DOI:

10.3791/54692

⸱

نوفمبر 23, 2016

 ,  , 
1Plant Gene Expression Center, Agricultural Research Service, USDA, 2Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تم وصف بروتوكولات التحقيق في ديناميكيات البلاستيدات الخضراء ، وهي الأنابيب المملوءة بالسدى التي تمتد من سطح البلاستيدات الخضراء.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stromules ، أو "الأنابيب المملوءة بالسدى" ، هي امتدادات أنبوبية ضيقة من سطح البلاستيدات الخضراء يتم ملاحظتها عالميا في الخلايا النباتية ولكن وظائفها تظل غامضة. إلى جانب الاهتمام المتزايد بدور البلاستيدات الخضراء في تنسيق استجابات النبات للإجهاد ، زاد الاهتمام باللحوم وعلاقتها بديناميكيات إشارات البلاستيدات الخضراء في السنوات الأخيرة ، مدعوما بالتقدم في المجهر الفلوري والبروتين الفلوروفوري الذي يسمح بالتصور السريع والدقيق لديناميكيات الستروم. هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لفحص تردد اللحمة في البلاستيدات الخضراء للبشرة في Nicotiana benthamiana ، وهو نظام نموذجي ممتاز للتحقيق في بيولوجيا الستيروم الخضراء. نقدم أيضا طرقا لتصور البلاستيدات الخضراء في المختبر عن طريق استخراج البلاستيدات الخضراء من الأوراق. أخيرا ، نحدد استراتيجيات أخذ العينات والأساليب الإحصائية لتحليل الاختلافات في ترددات اللحمة استجابة للمنبهات ، مثل الإجهاد البيئي أو العلاجات الكيميائية أو إسكات الجينات. يمكن للباحثين استخدام هذه البروتوكولات كنقطة انطلاق لتطوير طرق جديدة للتجارب المبتكرة لاستكشاف كيف ولماذا تصنع البلاستيدات الخضراء اللحوم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلاستيدات الخضراء هي عضيات ديناميكية في الخلايا النباتية المسؤولة عن عملية التمثيل الضوئي ومجموعة من عمليات التمثيل الغذائي الأخرى. تمارس مسارات الإشارات من البلاستيدات الخضراء أيضا تأثيرا كبيرا على فسيولوجيا النبات وتطوره ، وتنسيق استجابات النبات للإجهاد البيئي ومسببات الأمراض وحتى شكلالأوراق 1-6. في الآونة الأخيرة ، اكتسب علماء الأحياء اهتماما بجانب غير مفهوم جيدا من بنية البلاستيدات الخضراء: اللحمات ، وهي أنابيب رقيقة جدا مملوءة بالسدى تمتد من سطح البلاستيدات الخضراء7.

تظل الوظائف البيولوجية للسدومات غير معروفة ، على الرغم من أنه من المعروف أن تردد اللحمة يختلف استجابة للمنبهات البيئية7-9 ، وقد تكون اللحمات قادرة على نقل جزيئات الإشارات بين العضيات6. جميع أنواع البلاستيدات (ليس فقط البلاستيدات الخضراء الضوئية ، ولكن أيضا البلاستيدات الخضراء الشفافة ، والأميلوبلاست المملوءة بالنشا ، والبلاستيدات المصطبغة ، على سبيل المثال لا الحصر من البلاستيدات) تصنع اللحمات ، وتوجد اللحمات في جميع أنواع النباتات البرية التي تم فحصها حتى الآن. يمكن أن تمتد اللحمات وتتراجع ديناميكيا ، وتظهر أو تختفي في غضون ثوان ، أو يمكن أن تظل ثابتة نسبيا لفترات طويلة. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية التي تواجه علماء الأحياء اللحمية في أن اللحمات غالبا ما تتم دراستها باستخدام طرق وأنسجة وأنواع مختلفة بشكل كبير ، مما يجعل المقارنات عبر أدبيات بيولوجيا اللحمة صعبة. من الآن فصاعدا ، ستكون الممارسات القياسية والأوصاف الشاملة للأنظمة التجريبية المستخدمة لدراسة الستروم الخضراء، حاسمة لاكتشاف وظيفة هذه السمات المنتشرة في كل مكان لمورفولوجيا البلاستيدات الخضراء.

هنا نصف طرق تصور تكوين اللحمة في البلاستيدات الخضراء للبشرة لأوراق Nicotiana benthamiana. في الميزوفيل ، يتم تعبئة البلاستيدات الخضراء بكثافة في خلايا كبيرة ثلاثية الأبعاد ، مما يجعل من الصعب تصور اللحمات بدقة وسرعة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. على النقيض من ذلك ، تكون خلايا البشرة مسطحة نسبيا ، وتحتوي على عدد أقل من البلاستيدات الخضراء ، وتوجد على سطح الورقة ، مما يسمح بتصور سهل وسريع للسترومول. N. benthamiana هو نظام نموذجي مثالي لهذه التجارب لأنه ، على عكس العديد من الأنواع النباتية ، فإن جميع الخلايا الموجودة في بشرة N. benthamiana تصنع البلاستيدات الخضراء10. في بشرة معظم النباتات ، بما في ذلك نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا ، تحتوي خلايا واقية الفم فقط على بلاستيدات خضراء ، بينما تحتوي خلايا البشرة الأخرى على "بلاستيدات بيضاء" ، وبلاستيدات شفافة وغير متبلورة نسبيا وغير ضوئية9،11،12. وبالتالي ، في حين أن مجال رؤية واحد ل A. thaliana البشرة قد يظهر فقط حفنة من البلاستيدات الخضراء في زوج من الخلايا الحارسة ، فإن مجال رؤية N. benthamiana البشرة سيشمل العشرات أو حتى المئات من البلاستيدات الخضراء. ومع ذلك ، يمكن تعديل جميع الطرق الموضحة هنا للتحقيق في أسئلة أخرى في بيولوجيا stromule. على سبيل المثال ، استخدمنا نفس النهج لدراسة اللحوم leucoplast من A. thaliana9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، ونحن ركزت على معايرة التردد stromule في البشرة من N. يترك benthamiana. وقد تم إنشاء العديد من خطوط المعدلة وراثيا مستقرة والتي يمكن استخدامها لهذا الغرض، بما في ذلك 35S المحترفين: FNRtp: EGFP 13 و NRIP1: فندق Cerulean 6. كل من هذه الخطوط تظهر التعبير القوي من fluorophores في سدى بلاستيدات الخضراء من الأوراق نمت في ظل مجموعة واسعة من الظروف. بدلا من ذلك، fluorophores المستهدفة بلاستيدات الخضراء ويمكن التعبير عن عابر في N. benthamiana باستخدام الأجرعية التحولات 13. وهذا هو أقل مثالية من خطوط المعدلة وراثيا، منذ تسلل الأجرعية تحفز بعض الردود الدفاع القاعدية في N. benthamiana والتفاعل مع الأجرعية يمكن أن يغير تردد stromule في ورقة 14، ويحتمل أن تعقيد تفسير النتائج. وأخيرا، لتصور تشكيل stromule في المختبر،يمكن استخراجها البلاستيدات الخضراء من أي من الأنواع النباتية، وذلك باستخدام إما fluorophores المرمزة وراثيا أو صبغة الفلورسنت، كما هو موضح في المادة 5 أدناه. 9،15

ملاحظة: طرق تفصيلية لزراعة النباتات وقد وصفت سابقا 16 لفترة وجيزة، وتنمو N. النباتات benthamiana في 4 "قدور مليئة أي مزيج التربة المهنية التي توفر الصرف الجيد. تغطية الشتلات مع قبة من البلاستيك واضحة ل14/10 الأيام الأولى لتوفير بيئة رطبة للإنبات. إضافة أي مزيج الأسمدة القياسية التالية تعليمات الشركة الصانعة إلى 14- النباتات يوما من العمر. نباتات تنمو في ظل الضوء الأبيض، وذلك باستخدام ~ 100 مكرومول الفوتونات م -2 ثانية -1 شدة الضوء. محطات المياه بشكل منتظم.

1. إعداد العينات ورقة عن التصور

تتأثر ديناميات Stromule التي كتبها جرح 8، لذلك ينبغي إجراء إعداد الأنسجة مباشرة قبل تصور stromule ملاحظة:الصورة بواسطة المجهر مضان متحد البؤر. من الناحية المثالية، ينبغي تصور عينة مع 15 دقيقة بعد إزالة من المصنع.

  1. قطع جزء صغير من ورقة باستخدام شفرة حلاقة حادة جدا. دائما استخدام نفس المنطقة من ورقة من أجل التناسق، وتكون على يقين من أن تصور نفس السطح (متجه نحو المحور أو مجافي المحور) في جميع التجارب.
  2. مباشرة بعد قطع الجزء رقة، وغمر قسم ورقة في 5 مل حقنة needleless مملوءة بالماء، وإزالة الهواء من الحقنة، وتطبيق الفراغ الذي يغطي فتحة المحاقن مع إصبع وسحب المكبس.
    1. الافراج عن الغطاس بلطف لتجنب إتلاف القسم ورقة. كرر هذا مرتين أو ثلاث مرات، أو حتى أكثر من الهواء تمت إزالة ورقة ويبدو أن الأخضر العميق.
      ملاحظة: هذه الخطوة يزيل الهواء في ورقة التي يمكن أن تتداخل مع التصور الدقيق لstromules.
  3. إضافة قطرة ماء إلى شريحة ووضع القسم ورقة على هذا الانخفاض. ثم، تضاف الدكتور آخرالمرجع من الماء إلى أعلى ورقة، ووضع زلة غطاء على ورقة. إذا كان هناك أي فقاعات الهواء، اضغط بلطف انزلاق الغطاء حتى تتم إزالتها. الشريحة الآن جاهزة للفحص المجهري، وينبغي تصور فورا.

2. تصور Stromules مع متحد البؤر مضان المجهر

  1. مع الضوء المرسل، والتركيز على مجال الرؤية بالقرب من مركز للقسم ورقة (بعيدا عن الخلايا التالفة بواسطة شفرة الحلاقة). استخدام هدفا 20X حتى أن العديد من البلاستيدات الخضراء يمكن تصور في وقت واحد. حفظ صورة مع الضوء المرسل بحيث أنواع الخلايا يمكن تمييزها في وقت لاحق، إذا لزم الأمر.
  2. التبديل مصدر إضاءة ليزر مع الإثارة وانبعاث المرشحات المناسبة لfluorophore المستخدمة. على سبيل المثال، تثير GFP مع ليزر 488 نانومتر، وجمع الانبعاثات بين 500 نانومتر و 525 نانومتر.
    1. باستخدام برنامج المجهر، حدد القناة GFP وانقر لضبط فتحة الثقب إلى 1 منظمة العفو الدوليةوحدة راي. حدد المسح الضوئي ليزر، لبدء تصور العينة، ومن ثم انقر فوق القناة GFP لضبط كثافة الليزر وكسب كاشف لتقليل قوة الليزر في حين لا تزال تصور بوضوح stromules. مرة واحدة وقد تم تحديد هذه الإعدادات، والاحتفاظ بها متسقة قدر الإمكان في جميع التجارب.
  3. إعداد التجربة -stack ض من شأنها أن جمع سلسلة من الصور من خلال البشرة ورقة في مجال الرؤية.
    1. لض -stack، وتشمل جميع البلاستيدات الخضراء البشرة في مجال الرؤية لتجنب التحيز (على سبيل المثال، إذا البلاستيدات الخضراء بالقرب من سطح الورقة لديها أكثر stromules في ظل ظروف اختبار).
    2. التقاط صور في أقصى فترة ممكنة من شأنها أن تشمل جميع stromules لكن تقليل الوقت اللازم لض -stack. على سبيل المثال، إذا 1 وحدة إيري ما يعادل قسم متحد البؤر في التركيز الذي هو 2 ميكرون عميقة، مع صورة كل 2 ميكرون من المرجح مثالية.
      ملاحظة: epidermi ورقةالصورة هو سطح غير مستو، وبالتالي فإن عمق إجمالي قدره ض -stack سوف تختلف تبعا للعينة. سيتطلب أكثر -stacks ض 10-20 الصور، ولكنها قد تشمل أكثر من ذلك.
    3. ضبط سرعة المسح الضوئي ودقة وضوح الصورة عند الضرورة للتأكد من أن ض -stack يتم جمعها بسرعة (عادة في غضون 5-10 دقيقة، إذا كان ذلك ممكنا). حفظ ض -stack لتحليلها لاحقا.

تجهيز 3. صورة

  1. تحديد تردد stromule باستخدام أي برنامج تحليل الصور. لهذا البروتوكول، ونحن نوصي باستخدام يماغيج، وهي متاحة للجمهور من المعاهد الوطنية للصحة (http://imagej.nih.gov/ij/)، أو الترقية شعبية من يماغيج، فيجي (http://fiji.sc / فيجي).
  2. دمج ض -stack في صورة واحدة باستخدام الحد الأقصى لإسقاط كثافة في البرنامج.
  3. تحديد ويدويا عد كل البلاستيدات الخضراء في الصورة.
  4. لكل بلاستيدات الخضراء، بصريا تحديد ما إذا كان واحد أو أكثر stromulesوينظر تمتد من بلاستيدات الخضراء في صورة ض المدمجة -stack. فعلى سبيل المثال، انظر الشكل 1.
    ملاحظة: منذ ليست معروفة على الوظائف البيولوجية من stromules، أي رقيقة، مليئة سدى، تمديد أنبوبي من بلاستيدات الخضراء يمكن اعتباره "stromule"، بغض النظر عن طول. كقاعدة عامة، على تمديد مليئة سدى من بلاستيدات الخضراء هو stromule إذا كان أقل من حوالي 1 ميكرون في القطر على طول أكثر من طوله 7. تأكد من أن شخص واحد يحلل جميع الصور للسيطرة على الاختلافات الموضوعية في تحديد ما إذا كان أو لم يكن لديها بلاستيدات الخضراء stromule. باحث الثاني يجب التحقق بشكل مستقل الترددات stromule لزيادة خفض التحيز الذاتية.

4. تصميم التجارب وأخذ العينات

ملاحظة: Stromule تردد متغير بدرجة كبيرة بين الأوراق، ولكن تشير العديد من التقارير أن هناك اختلاف بسيط في وتيرة stromule ضمن indiviالمزدوج ورقة 9،17.

  1. حساب التردد ورقة stromule من حقل واحد من عرض من ورقة واحدة. تجاهل ورقة، والنظر في هذه عينة مستقلة. لا تنظر في حقول منفصلة من وجهة نظر من ورقة واحدة كعينات مستقلة.
    ملاحظة: ليس هناك إجماع قوي حول أفضل الطرق لقياس التغيرات في النشاط stromule، وحتى يتم تعريف وظيفة من stromules أكثر وضوحا، يجب على الباحثين الاستمرار في الإبداع في قياس ديناميكية stromule. وعلى سبيل المقارنة عبر الأدب، ومع ذلك، معايير مشتركة للإبلاغ ينبغي أن تستخدم بالإضافة إلى أكثر الأساليب الإبداعية. كحد أدنى، ودائما يقدم وتيرة البلاستيدات الخضراء التي لديها واحد أو أكثر stromules.
  2. تحديد وتيرة البلاستيدات الخضراء التي لديها stromules في مجال الرؤية. استخدام يماغيج لتحديد جميع البلاستيدات الخضراء في مجال الرؤية. ثم، لكل بلاستيدات الخضراء، وتحديد ما إذا كان بلاستيدات الخضراء شكلت stromule واحد على الأقل. تقرير تردد stromule كما percentaجنرال الكتريك من البلاستيدات الخضراء مع stromule.
    ملاحظة: بعض الباحثين تحويل النسبة المئوية، على سبيل المثال مع تحول قوس جيب الزاوية، قبل إبلاغ الترددات stromule. في حين أن هذا هو خيار للتحليل الإحصائي، وقوس جيب الزاوية تردد stromule ليس قيمة بديهية، وليس من الضروري أن يكون ورد في النص الرئيسي أو شخصيات من الدراسة.
    1. كنهج بديل، نحصي عدد من stromules، ونقسمه على عدد من البلاستيدات الخضراء.
      ملاحظة: في معظم الحالات، وهذا سوف تسفر عن نتائج مماثلة لنهج 4.2. قد نبالغ في تقدير تردد stromule، ومع ذلك، إذا كان بلاستيدات الخضراء واحدة شكلت العديد stromules. في المثال الموضح تحت نتائج ممثل، على سبيل المثال، العديد من البلاستيدات الخضراء واثنين أو أكثر stromules، ليرتفع بذلك عدد stromules في بلاستيدات الخضراء إلى 40/87 (مقابل تردد stromule من 33/87).
    2. بدلا من ذلك، تحديد طول stromule بدلا من التردد stromule. ويمكن قياس طولفي ImageJ عن طريق تتبع stromule مع أداة سطر مرفوعة.
      ملاحظة: بما أن الدور البيولوجي للstromules لا يزال غير معروف، فإنه ليس من الواضح أن طول stromule يؤثر على وظيفتها. عن اختلافات كبيرة في طول stromule إذا لوحظ أنها، ولكن أيضا الإبلاغ عن الترددات stromule (كما هو موضح في 4.2).
      ملاحظة: تردد Stromule يمكن أن يكون متغير بدرجة كبيرة بين أوراق مختلفة تحت ظروف النمو نفسها. لذلك، على الرغم من تحديد تردد stromule يمكن أن يكون مضيعة للوقت، وينبغي تصميم التجارب بعناية لتشمل عينات كبيرة الحجم. استخدام قواعد البيانات من مختبرنا، توصلنا إلى أن حجم عينة من 16 شخصا على الأقل نباتات كل معاملة عادة ما يكون قويا بما فيه الكفاية لتحديد ما إذا كان هناك فروق ذات دلالة إحصائية تغيير 1.5 أضعاف على الأقل في وتيرة stromule بين شرطين (مع معيار α = 0.05 و β = 0.80).
  3. التحليل الإحصائي للنتائج.
    1. مقارنة ليعلى ترددات stromule من اثنين من العلاجات، واستخدام اختبار ر ولش (المعروف أيضا باسم heteroscedastic اختبار تي أو تي اختبار افتراض التباين عدم المساواة).
      ملاحظة: هذه التجربة ليست قوية مثل اختبار ر الطالب التقليدي، ولكن اختبار ر ولش هو مفيد لأنه لا نفترض أن التباين في توزيع الترددات stromule مشابه بين العلاجات.
      ملاحظة: بما تردد stromule هو "نسبة"، ومن المتوقع توزيع المعاينة لتكون ذات الحدين بدلا من وضعها الطبيعي، والتي يمكن أن التحليل الإحصائي الانحراف نظريا إذا أحجام عينة منخفضة جدا أو إذا كان تردد stromule منخفض جدا (قريبة من 0٪) أو جدا عالية (ما يقرب من 100٪). وقد استخدمت بعض التقارير التحولات قوس جيب الزاوية قبل التحليل الإحصائي، الذي يهدف إلى تحويل توزيع ذي الحدين إلى التوزيع الطبيعي، وبالتالي تلبية المتطلبات القياسية لاختبار ر الطالب أو ANOVA. في الممارسة العملية، ومع ذلك،التحولات rcsine يكون لها أثر يذكر أو لا على التحليل الإحصائي، وبالتالي فهي ليست الموصى بها. بدلا من ذلك، تكرار تجارب لزيادة حجم العينة، والتي سوف تزيد القدرة الإحصائية وتقليل الأخطاء في تفسير البيانات.
    2. وأيا كان النهج الإحصائية واستخدامها، ومما لا شك فيه أن يقدم بعناية استراتيجية أخذ العينات، وحجم العينة، واختبار إحصائي، وقيمة احتمالية لكل تجربة.
      ملاحظة: كما هو الحال مع مجالات أخرى من مجالات علم الأحياء، يمكن النظر في قيمة احتمالية أقل من 0.05 "ذات دلالة إحصائية"، على الرغم من أن الباحثين بالتأكيد بالإبلاغ عن قيمة ص الدقيقة التي حصل عليها. إذا ص هو أعلى قليلا من 0.05، وزيادة حجم العينة مع اثنين أو ثلاث تجارب قد تساعد في توضيح ما إذا كان أو لم يكن الفرق الذي لوحظ هو تكرار للوذات دلالة إحصائية.

5. استخراج البلاستيدات الخضراء سليمة لتصور Stromule حيوية

ملاحظة: عدة طرقوقد استخدمت لعزل البلاستيدات الخضراء من الأوراق، بما في ذلك بروتوكول مختلف قليلا في دراسة حديثة حول تشكيل stromule في المختبر 15. بروتوكول المفصلة أدناه يستخدم طريقة بسيطة نسبيا والتي لا تسفر عينات بلاستيدات الخضراء النقية كيميائيا، ولكنه بدلا من ذلك عزل كمية كبيرة من سليمة، البلاستيدات الخضراء صحية 9،18.

  1. إعداد البارد استخراج العازلة: 50 ملي HEPES هيدروكسيد الصوديوم، 330 ملي السوربيتول، 2 ملي EDTA، 1.0 ملي MgCl 2، و 1.0 ملي MnCl 2. ضبط درجة الحموضة إلى 6.9 مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك، وبردت قبل الاستخدام.
    ملاحظة: على الرغم من أن ليس من الضروري، وذلك باستخدام مخازن التبريد وحفظ العينات على الجليد عندما يكون ذلك ممكنا سيحقق نسبة أعلى من البلاستيدات الخضراء سليمة.
  2. إعداد عازلة العزلة: 50 ملي HEPES هيدروكسيد الصوديوم، 330 ملي السوربيتول، 2 ملي EDTA، 1.0 ملي MnCl 2، 1.0 ملي MgCl 2 و 10 ملي بوكل، و 1.0 ملي مول كلوريد الصوديوم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.6 مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك وبردت قبل الاستخدام.
  3. إذا كانت الأوراق ليستمعربا عن fluorophore انسجة المشفرة وراثيا، وإعداد ثنائي الأسيتات carboxyfluorescein (CFDA) الحل: 50 ملي CFDA حل الأسهم في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) (CFDA 2.3 ملغ لكل 1.0 مل DMSO).
    ملاحظة: إن التركيز المضبوط ليست حرجة. الحفاظ على المخزون CFDA في الظلام في كل الأوقات. تخزين قسامات صغيرة من 50 ملي CFDA في -20 درجة مئوية.
  4. لعزل البلاستيدات الخضراء، وإزالة ~ 5-10 أوراق ز من عدة مصانع وشطف لفترة وجيزة في الماء البارد. ونقل على الفور إلى 50 مل العازلة استخراج الباردة. أوراق طحن باستخدام الخلاط مع العديد من نبضات قصيرة. من خلال تصفية اثنين أو ثلاث طبقات من القماش القطني لإزالة الأنقاض ورقة، وتقسيم البلاستيدات الخضراء استخراج الى قسمين 50 مل أنابيب الطرد المركزي، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة على 750 ز س.
  5. تجاهل طاف و resuspend البلاستيدات الخضراء الخضراء في المخزن عزل 10 مل. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 1 دقيقة في 750 x ج، ونبذ طاف، والبلاستيدات الخضراء resuspend في عازلة العزلة لجلب الحجم النهائي إلى 5 مل.
  6. نقل 201؛ لتر من البلاستيدات الخضراء إلى شريحة، وتغطي مع ساترة، ويبدأ الفحص المجهري.
    ملاحظة: البلاستيدات الخضراء من النباتات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية المستهدفة صانعة جاهزة الآن لتصور بواسطة المجهر مضان متحد البؤر.
  7. وصمة عار البلاستيدات الخضراء من النباتات التي لا يتم التعبير عن البروتينات الفلورية المستهدفة صانعة لتصور stromules.
    1. إضافة 5 ميكرولتر من 50 ملي الأسهم CFDA إلى 5 مل البلاستيدات الخضراء مع وقف التنفيذ في المخزن العزلة. جلب التركيز النهائي إلى 50 ميكرومتر.
    2. السماح البلاستيدات الخضراء لاحتضان لمدة 5 دقائق، ثم نقل قسامة صغيرة (~ 50 ميكرولتر) إلى شريحة، وتغطي مع ساترة، ويبدأ الفحص المجهري.
    3. استخدام مجموعة فلتر FITC أو GFP. استخدام هدفا 20X إلى تصور العديد من البلاستيدات الخضراء في وقت واحد، أو الهدف الأسمى لتصور بلاستيدات الخضراء المعزولة واحدة.
      ملاحظة: سوف CFDA يتألق داخل سدى من البلاستيدات الخضراء سليمة.
    4. إذا كان هناك مضان خلفية قوية، وغسل chloroplasts مرة أخرى في 10 مل العازلة العزلة بعد الحضانة مدة 5 دقائق مع CFDA، الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 750 x ج، تجاهل طاف، و resuspend العازلة في عزلة 5 مل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدم هذا البروتوكول لتصور تردد stromule في النهار والليل في النبتات من N. الشباب الشتلات benthamiana. تم دمج شرائح من كومة Z- في صورة واحدة (الشكل 1A). لأغراض البصرية، كانت تلك الصورة ثم غير المشبعة ومقلوب بحيث يظهر سدى الأسود (الشكل 1B). وصفت البلاستيدات الخضراء إما عدم وجود stromules (النجمة الخضراء) أو وجود stromule واحد على الأقل (أرجواني النجمة). من البلاستيدات الخضراء البشرة 8...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند التحقيق stromules، يجب النظر في ثلاثة عوامل هامة من خلال: (أ) التلاعب في الأنسجة النباتية يجب أن تبقى إلى أدنى حد ممكن، (ب) يجب أن يبقى النظام التجريبي متسقة، و (ج) استراتيجيات أخذ العينات يجب أن يتم التخطيط بعناية ل ضمان قوية، ويتم تحليل البيانات استنساخه.

Stromules دينامية ملحوظة: يمكن أن يمتد ويتقلص بسرعة أمام عينيه مراقب تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، تردد stromule يختلف اختلافا كبيرا في استجابة لمجموعة واسع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.O.B. و A.M.R. تم دعمهما من خلال زمالات ما قبل الدكتوراه من المؤسسة الوطنية للعلوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هيبسسيجما ألدريتشH3375
هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificS320-1
سوربيتولسيجما ألدريتشS1876
EDTAفيشر التكنولوجيا الحيويةBP121
MnCl2< / sub>سيجما ألدريتش221279
MgCl2< / sub>سيجما ألدريتشM0250
KClSigma-AldrichP3911
NaClSigma-AldrichS9625
مجهر متحد البؤر بالمسح الضوئي بالليزر   ؛Carl Zeiss Incنموذج: LSM710
ثنائي أسيتات الكربوكسي فلورسين (CFDA)سيجما ألدريتش21879   ؛
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) EMDMX1458-6
خلاط WaringWaring   ؛الموديل: 31BL92
فيجيfiji.scبرنامج مفتوح المصدر لتحليل الصور البيولوجية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
  2. Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).
  3. Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata. Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).
  4. Nomura, H., et al. Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis. Nat. Commun. 3, 926(2012).
  5. Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).
  6. Caplan, J. L., et al. Chloroplast stromules runction during innate immunity. Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).
  7. Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function. Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).
  8. Gray, J. C., et al. Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid. Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).
  9. Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).
  10. Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants. Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).
  11. Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis. Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).
  12. Chiang, Y. -H., et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis. Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).
  13. Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics. Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).
  14. Erickson, J. L., et al. Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays. BMC Plant Biol. 14 (1), 127(2014).
  15. Ho, J., Theg, S. M. The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana. PLoS One. 11 (2), e0146489(2016).
  16. Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).
  17. Schattat, M. H., Klösgen, R. B. Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11, 115(2011).
  18. Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).
  19. Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell. Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Nicotiana benthamiana

مقالات ذات صلة