Method Article

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

DOI:

10.3791/54692

⸱

November 23rd, 2016

 ,  , 
1Plant Gene Expression Center, Agricultural Research Service, USDA, 2Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تم وصف بروتوكولات التحقيق في ديناميكيات البلاستيدات الخضراء ، وهي الأنابيب المملوءة بالسدى التي تمتد من سطح البلاستيدات الخضراء.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stromules ، أو "الأنابيب المملوءة بالسدى" ، هي امتدادات أنبوبية ضيقة من سطح البلاستيدات الخضراء يتم ملاحظتها عالميا في الخلايا النباتية ولكن وظائفها تظل غامضة. إلى جانب الاهتمام المتزايد بدور البلاستيدات الخضراء في تنسيق استجابات النبات للإجهاد ، زاد الاهتمام باللحوم وعلاقتها بديناميكيات إشارات البلاستيدات الخضراء في السنوات الأخيرة ، مدعوما بالتقدم في المجهر الفلوري والبروتين الفلوروفوري الذي يسمح بالتصور السريع والدقيق لديناميكيات الستروم. هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لفحص تردد اللحمة في البلاستيدات الخضراء للبشرة في Nicotiana benthamiana ، وهو نظام نموذجي ممتاز للتحقيق في بيولوجيا الستيروم الخضراء. نقدم أيضا طرقا لتصور البلاستيدات الخضراء في المختبر عن طريق استخراج البلاستيدات الخضراء من الأوراق. أخيرا ، نحدد استراتيجيات أخذ العينات والأساليب الإحصائية لتحليل الاختلافات في ترددات اللحمة استجابة للمنبهات ، مثل الإجهاد البيئي أو العلاجات الكيميائية أو إسكات الجينات. يمكن للباحثين استخدام هذه البروتوكولات كنقطة انطلاق لتطوير طرق جديدة للتجارب المبتكرة لاستكشاف كيف ولماذا تصنع البلاستيدات الخضراء اللحوم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلاستيدات الخضراء هي عضيات ديناميكية في الخلايا النباتية المسؤولة عن عملية التمثيل الضوئي ومجموعة من عمليات التمثيل الغذائي الأخرى. تمارس مسارات الإشارات من البلاستيدات الخضراء أيضا تأثيرا كبيرا على فسيولوجيا النبات وتطوره ، وتنسيق استجابات النبات للإجهاد البيئي ومسببات الأمراض وحتى شكلالأوراق 1-6. في الآونة الأخيرة ، اكتسب علماء الأحياء اهتماما بجانب غير مفهوم جيدا من بنية البلاستيدات الخضراء: اللحمات ، وهي أنابيب رقيقة جدا مملوءة بالسدى تمتد من سطح البلاستيدات الخضراء7.

تظل الوظائف البيولوجية للسدومات غير معروفة ، على الرغم من أنه من المعروف أن تردد اللحمة يختلف استجابة للمنبهات البيئية7-9 ، وقد تك....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، ونحن ركزت على معايرة التردد stromule في البشرة من N. يترك benthamiana. وقد تم إنشاء العديد من خطوط المعدلة وراثيا مستقرة والتي يمكن استخدامها لهذا الغرض، بما في ذلك 35S المحترفين: FNRtp: EGFP 13 و NRIP1: فندق Cerulean 6. كل من هذه الخطوط تظهر التعبير القوي من fluorophores في سدى بلاستيدات الخضراء من الأوراق نمت في ظل مجموعة واسعة من الظروف. بدلا من ذلك، fluorophores المستهدفة بلاستيدات الخضراء ويمكن التعبير عن عابر في N. benthamiana باستخدام الأجرعية التحولات 13. وهذا هو أقل مثالية من خطوط المعدلة....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدم هذا البروتوكول لتصور تردد stromule في النهار والليل في النبتات من N. الشباب الشتلات benthamiana. تم دمج شرائح من كومة Z- في صورة واحدة (الشكل 1A). لأغراض البصرية، كانت تلك الصورة ثم غير المشبعة ومقلوب بحيث يظهر سدى الأسود (الشكل 1B). وصفت البلاستيدات الخضراء إما عدم وجود stromules (النجمة الخضراء) أو وجود stromule واحد على الأقل (أرجواني النجمة). من البلاستيدات الخضراء البشرة 8.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند التحقيق stromules، يجب النظر في ثلاثة عوامل هامة من خلال: (أ) التلاعب في الأنسجة النباتية يجب أن تبقى إلى أدنى حد ممكن، (ب) يجب أن يبقى النظام التجريبي متسقة، و (ج) استراتيجيات أخذ العينات يجب أن يتم التخطيط بعناية ل ضمان قوية، ويتم تحليل البيانات استنساخه.

Stromules دينامية ملحوظة: يمكن أن يمتد ويتقلص بسرعة أمام عينيه مراقب تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، تردد stromule يختلف اختلافا كبيرا في استجابة لمجموعة واسع.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.O.B. و A.M.R. تم دعمهما من خلال زمالات ما قبل الدكتوراه من المؤسسة الوطنية للعلوم.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
هيبسسيجما ألدريتشH3375
هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificS320-1
سوربيتولسيجما ألدريتشS1876
EDTAفيشر التكنولوجيا الحيويةBP121
MnCl2< / sub>سيجما ألدريتش221279
MgCl2< / sub>سيجما ألدريتشM0250
KClSigma-AldrichP3911
NaClSigma-AldrichS9625
مجهر متحد البؤر بالمسح الضوئي بالليزر   ؛Carl Zeiss Incنموذج: LSM710
ثنائي أسيتات الكربوكسي فلورسين (CFDA)سيجما ألدريتش21879   ؛
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) EMDMX1458-6
خلاط WaringWaring   ؛الموديل: 31BL92
فيجيfiji.scبرنامج مفتوح المصدر لتحليل الصور البيولوجية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
  2. Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stromule FrequencyFluorescence MicroscopyChloroplast IsolationConfocal MicroscopyStromule VisualizationNicotiana BenthamianaChloroplast StromulesStromule AnalysisStromule FormationStromule Dynamics

Related Articles