مقالة منهجية

الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

14.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54703

⸱

ديسمبر 1, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Boston University, 2Biological Design Center, Boston University, 3Lattice Automation, 4Department of Electrical and Computer Engineering, Biological Design Center, Boston University

في هذه المقالة

ملخص

ويرد هنا، سير العمل الآلي لأداء وحدات الحمض النووي "الجهاز" الجمعية استخدام أسلوب الجمعية الحمض النووي وحدات استنساخ على الروبوتات مناولة السائل. يستخدم البروتوكول أداة برمجيات بديهية لتوليد قوائم معالج السائل لجهاز الحمض النووي اندماجي مكتبة الجيل، الذي نبدي باستخدام منصات مناولة السائل اثنين.

الملخص

ومكنت التقدم الذي أحرز مؤخرا في وحدات الحمض النووي الجمعية تقنيات البيولوجيا التركيبية لاختبار أكثر بكثير من ال يتوفر تصميم الفضاء "" يمثلها "الأجهزة" التي تم إنشاؤها كمجموعات من العناصر الوراثية الفردية. ومع ذلك، الجمعية اليدوي لهذه الإعداد الكبيرة من الأجهزة مرة كثيفة وعرضه للخطأ، ومكلفة. ويقتضي تزايد تعقيد ونطاق بحوث البيولوجيا التركيبية بطريقة تتسم بالكفاءة، واستنساخه لاستيعاب بناء الجهاز واسعة النطاق ومعقدة وعالية الإنتاجية.

هنا، هو الآلي بروتوكول الجمعية الحمض النووي باستخدام تقنية "الاستنساخ وحدات" (موكلو) endonuclease القيد على أساس نوع IIS على اثنين من منصات السائل-المناولة الروبوتية. الآلي السائل-التعامل مع الروبوتات تتطلب حذراً، وكثير من الأحيان مملة التحسين من المعلمات بيبيتينج للسوائل اللزوجة المختلفة (مثل الإنزيمات، الحمض النووي، والمياه، المخازن المؤقتة)، فضلا عن برمجة واضحة لضمان تطلع صحيحة والاستغناء عن أجزاء الحمض النووي والمواد الكاشفة. وهذا يجعل البرنامج النصي دليل الكتابة لجمعيات معقدة فقط إشكالية كدليل الحمض النووي الجمعية، ويتطلب أداة برمجيات التي يمكن أتمتة إنشاء البرنامج النصي. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير أداة لبرامج المستندة إلى الويب، http://mocloassembly.com، لتوليد اندماجي مكتبات جهاز الحمض النووي من أجزاء الحمض النووي الأساسية التي تم تحميلها كملفات بنك الجينات. نوفر إمكانية الوصول إلى الأداة، والأمثل ملف تصدير من برنامجنا معالج السائل الذي يشمل فئات السائل ومعلمات المختبرات الطبية وتخطيط سطح السفينة. تتوفر جميع أجزاء الحمض النووي المستخدمة عن طريق أدجيني، ويمكن الوصول إليها على الخرائط الرقمية عن طريق "التسجيل الجليد BDC جامعة بوسطن". وتوفر هذه العناصر معا، أساسا للمنظمات الأخرى لأتمتة وحدات تجارب الاستنساخ وبروتوكولات مماثلة.

الآلي الحمض النووي الجمعية سير العمل المقدمة هنا يتيح إنتاج الأجهزة الدنا قابلة للتكرار، والآلي، والفائق، ويقلل من خطر الأخطاء البشرية الناجمة عن بيبيتينج اليدوية المتكررة. تسلسل إظهار البيانات المؤتمتة الحمض النووي الجمعية ردود الفعل التي ولدت من سير العمل هذا ~ 95% الصحيح وتتطلب قليلاً 4% كالتدريب العملي على كثير من الوقت، بالمقارنة مع إعداد الرد اليدوي.

المقدمة

الأجهزة الوراثية البيولوجية الاصطناعية أقرب مثل تبديل رمز التبديل كولينز1 و ريبريسيلاتور الويتز2 أظهرت أن النظم البيولوجية يمكن أن يكون هندسيا إلى الأمام لمهام محددة، والقطعية. ومنذ ذلك الحين، تسعى البيولوجيا التركيبية مهندس نظم المعيشة القيام بوظائف أكثر تعقيداً تدريجيا في خدمة الحيوية3،5،بيوثيرابيوتيكس،من46، الوقود الحيوي 78من،، وبيوسينسينج تطبيقات9،،من1011. تحقيق هذه التطبيقات من خلال الجمع بين وحدات الحمض النووي "أجزاء" في "الأجهزة" مع وظائف معينة كان واحداً من الأهداف الرئيسية للبيولوجيا التركيبية. لهذه العملية للقياس، يجب أن يكون هناك تقنية تسمح بإنشاء الأجهزة المعقدة من المكتبات الكبيرة لأجزاء الوقت-كفاءة وفعالة من حيث التكلفة، والأهم من ذلك، طريقة استنساخه.

عملية توسعية الجمعية له ما يبرره لأنه يفتقر حاليا إلى المجال فهم كامل للقواعد التي يسترشد بها في تصميم النظام البيولوجي ناجحة وتكوين. ويتفاقم هذا القدر الكافي تتسم الحمض النووي أجزاء12، عدم التوافق وكومبوسابيليتي من الأجزاء13، والتفاعلات غير متوقع أو غير مرغوب فيه بين المكونات الوراثية داخل الأجهزة الاصطناعية14، 15-في غياب النماذج التنبؤية موثوقة، وصلت الأجهزة الوراثية التركيبية الوظيفية بالتجربة والخطأ، الذي يطالب بعشرات أو حتى مئات، من قوة إشارة المدخلات والمخرجات هي فحص متغيرات جهاز المقصود و "أفضل" يتم تحديد تكوين مع عناصر المصب16. بينما الحديث توحيد أساليب الجمعية الحمض النووي مثل البوابة الذهبية17، و "استنساخ نموذجي"18،،من1920 جعل هذه العملية أسهل، خبير تجريبية لا تزال هناك حاجة القيام بكل بروتوكول. الأجهزة الاصطناعية تنمو في الحجم والتعقيد، والمساحة الإجمالية التصميم المتوفرة سوف تصبح كبيرة جداً لتشييد واختبار يدوياً21، وفي العملية ستكون الحرفي جداً لأي تقدم ملحوظ وقابلة للتكرار في الميدان.

حتى ظهور البيولوجيا التركيبية ومستودعات جزء البيولوجية مثل الحكومي "أجزاء التسجيل" (http://partsregistry.org)، لم يتم تخزين "المخزون جبيي من عناصر قابلة"22، و23من سينبيوهوب، الأجزاء الوراثية في أي تنسيق الجمعية الموحدة. سوى حفنة صغيرة من الأجزاء اللازمة لاستنساخ كل مشروع، وهكذا، كان حجم استنساخ عمله الصغيرة، وأعمال جهاز المجتمعين كان يمكن تحقيقه وتافهة بالمقارنة مع أهداف البحث الفعلي. الاستنساخ الجزيئي المخصصة في كثير من الأحيان وإجراء استخدام الملخصات تقييد يستند إلى تقييد توافر الموقع واندونوكليسي بدلاً من بعد أي عملية موحدة. عدم وجود توحيد جعلت من غير العملي أتمتة أي بروتوكول الاستنساخ كما أنه من غير المرجح أن تحذو رد فعل الاستنساخ المقبل بروتوكولا متطابقة. وعلاوة على ذلك، أتمتة الجمعية الحمض النووي المطلوب استثمارات نقدية كبيرة في المعدات (سائل التعامل مع الروبوتات وبنيتها التحتية برمجيات ومعدات المختبرات المرتبطة بها) فضلا عن استثمار الوقت لجيل الإرشادات لوضع دقيق معلمات للتعامل مع الفئات المختلفة من السوائل التي يجري تجهيزها وسلسلة دقيقة من الإرشادات لتشغيل هذه البروتوكولات. نطاق صغير استنساخ الجهود لا تبرر هذه النفقات. مزيج التصاميم أكبر حجماً وأكثر تعقيداً من الجهاز الوراثية مقترنا مع الجمعية توحيد البروتوكولات24،25 يخلق بيئة حيث أتمتة هذه العمليات عملية جداً. وظهرت الروبوتات منخفضة التكلفة مثل واحد بعد التمديد أوبينترونس26 أيضا الذي يسمح لمختبرات الممولة حتى متواضعة الوصول إلى هذه التكنولوجيا. وبالإضافة إلى ذلك، "سحابة" مختبرات27 بما في ذلك ترانسكريبتيك ومختبر سحابة الزمرد، فضلا عن الأكاديمية "بيوفوندريس" مثل "أدنبرة الجينوم مسبك"، إيبيوفاب UIUC، و "مسبك" واسع معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، الروبوتات تسخير لتجميع مختلف مجموعات التصاميم لمجموعة متنوعة من العملاء بسرعة ومرارا وتكرارا أثناء صيانة مستودع مشترك للأوليات الحمض النووي الأساسية والتكنولوجيات الجمعية للطلبات المستقبلية.

واحدة من أكبر التحديات في أتمتة عملية تجميع الحمض النووي هو توليد الأوامر بيبيتينج لمعالج السائل. بينما واجهات برامج لهذه الأجهزة عادة سهلة الاستخدام، ومعقدة تتطلب تعليمات بيبيتينج مثل تلك اللازمة للجمعية الحمض النووي اندماجي الباحث تحديد كل أسبيراتي صراحة والاستغناء عن الأوامر يدوياً. هذا يخلق عقبة رئيسية في سير العمل، ويترك عرضه للأخطاء بيبيتينج نفس عملية تكوين البرنامج النصي كما لو نفذت الجمعية يدوياً. وهذا يتطلب أداة برمجيات التي يمكن أتمتة جميع أجزاء هذه العملية، من تصميم مكتبة الجهاز، إلى توليد التعليمات بيبيتينج، وتزويد الباحث بلوحة/كاشف الأجهزة المطلوبة لتجميع لهم. في هذا العمل، نحن نفوذ لدينا أداة البرمجيات لأتمتة تصميم مكتبة جهاز الحمض النووي اندماجي صغيرة، وكذلك خلط من الكواشف (المخزن المؤقت، والمياه، والأنزيمات) وأجزاء الحمض النووي (الشكل 1b) إلى 96 وعاء واحد وحدات الحمض النووي الجمعية ردود الفعل. استخدام الأداة لا يتطلب أي خبرة البرمجة السابقة، وهي قابلة للتطوير وعالية الإنتاجية، واندماجي بشكل افتراضي. نظهر أن استنساخ ردود الفعل أعد على منصات مختلفة من التعامل مع السائل الآلي اثنين استنساخ التحقق من التسلسل الصحيح العائد مع تردد مشابه لردود الفعل أعدت يدوياً (95%)، ومع أقل بكثير من الوقت العملي.

البروتوكول

1. تحديد الأجزاء التي ستستخدم في مكتبة الجهاز الحمض النووي وتوليد تعليمات معالج المستخدم/سائل [15 دقيقة]

  1. باستخدام أي مستعرض ويب، انتقل إلى mocloassembly.com وتحميل ملفات بنك الجينات لجميع أجزاء الحمض النووي التي سيتم تضمينها في تصميم جهاز الحمض النووي اندماجي.
  2. بمجرد تم تحميل كافة الملفات، حدد أجزاء الحمض النووي المطلوب ثم اسحبها إلى قماش فارغة، ووضع أنواع جزء بالترتيب النهائي المقصود من أجزاء الحمض النووي.
    ملاحظة: يمكن تحديد مجموعات من الأجزاء، فضلا عن الأجزاء الفردية، ووضعها على لوحة الرسم القماشية. ترتيب أجزاء الحمض النووي أيضا، مثل أن يتدلى 5 'و 3' لكل مباراة جزء.
  3. انقر فوق 'تجميع' في أسفل يمين الصفحة.
    ملاحظة: سوف الأداة فقط في إنشاء تجميعات أراض صالحة، واستنادا إلى يتدلى زوج قاعدي الأربعة أن الجناح كل جزء على الهضم مع الإنزيم بساي. الأداة في حالة وجود أية أراض أجهزة الحمض النووي استناداً إلى على الأجزاء تم تحميلها من قبل العلماء، سوف تشير إلى أنه تم العثور على لا تجميعات.
  4. انتقل إلى علامة التبويب 'خطط' وتحميل الملفات التي تم إنشاؤها بواسطة الأداة. وسوف تتضمن هذه الملفات:
    1. لوحة الإنسان للقراءة خرائط للعلماء لإعداد عينات من الحمض النووي، فضلا عن الكواشف اللازمة لردود الفعل
    2. قائمة 'اختيار' لمعالج السائل
    3. ملفات بنك الجينات المشروح كاملا لجميع الأجهزة الحمض النووي يتم تجميعها
      ملاحظة: يجب اختبار السائل التعامل مع المواقع الذراع عند الوصول إلى أي المختبرات الطبية الجديدة. راجع الدليل الخاص بالشركة المصنعة للحصول على إرشادات مفصلة حول كيفية ضبط الذراع بيبيتينج المواقع المحاور X، Y، و Z حسب الضرورة.

2-إعداد بلازميد الحمض النووي والمواد الكاشفة للجمعية [3 أيام]

  1. [يوم 1] استخدام حلقة تطعيم عقيمة وتعمل بالقرب من لهب المكشوف، أو في غطاء الاندفاق الصفحي، متواصلة بالأرصدة والغليسيرول البكتيرية على لوحات رطل-أجار تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة. القيام بذلك لجميع أجزاء الحمض النووي اللازمة، مع التأكد من تعقيم الحلقة بين كل عينة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: تجميد والغليسيرول البكتيرية ينبغي إبقاء المخزونات على الجليد بقدر الإمكان. دورات تجميد أذاب المتكررة أقل صلاحية للمخزون وينبغي تجنبها.
  2. [يوم 2] استخدام تلميح ماصة معقمة، مسواك، أو حلقة التطعيم، ويعمل القرب من لهب المكشوف، أو في غطاء الاندفاق الصفحي، تطعيم 3 مل مرق رطل (تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة) مع مستعمرة واحدة من لوحات رطل-أجار أعدت في 2.1. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية بينما تهز 300 لفة في الدقيقة.
  3. [يوم 3] تنقية الحمض النووي بلازميد من الثقافات البكتيرية باستخدام أي أدوات تنقية بلازميد الإعدادية المصغرة المتاحة تجارياً.
  4. باستخدام الملف MoClo_Setup.xlsx الذي تم توفيره، تضعف كل عينة من بلازميد الحمض النووي لتركيز 20 فمول/ميليلتر في الماء أو في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
  5. عقب الخريطة لوحة من ملف PDF التي تم إنشاؤها بواسطة أداة الجمعية العامة، وضع حجم كل جزء الحمض المخفف المشار إليه في البئر المناسبة على لوحة الفساتين الكاملة PCR 96-جيدا. تعقد هذه سيتوبلاتي على الجليد حتى الاحتياج، أو ختم بختم إحباط لاصقة وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  6. على الجليد، إعداد mastermix التفاعل مع المكونات التالية: لكل ميليلتر 20 من رد فعل إضافة 2 ميليلتر من 10 × ليجاسى المخزن المؤقت و 0.5 ميليلتر من ليجاسى الحمض النووي T4 (HC) 1 ميليلتر من الإنزيم بساي T4 الحمض النووي. يتم تضمين ورقة حاسبة في الملف MoClo_Setup.xlsx للمساعدة في ذلك.
    1. توزيع mastermix الإنزيم في المناسبة آبار جديدة الفساتين كامل 96-بئر بكر صفيحة، عقب الخريطة لوحة ريجينتبلاتي في ملف PDF الذي تم إنشاؤه. الاحتفاظ بهذا ريجينتبلاتي على الجليد أو على كتلة الباردة 96-جيدا.
      ملاحظة: فقط أن تكون مستعدة عندما تكون جاهزاً لتشغيل الجمعية على معالج السائل ريجينتبلاتي.

3-تنفيذ البرنامج النصي للجمعية على معالج السائل [متغير]

  1. وضع في SetupPlate(s)، ReagentPlate(s) (على الباردة 96-جيدا-كتلة)، والعدد اللازم من لوحات بكر 96-جيدا الفساتين كاملة فارغة على سطح السائل المعالج. وسيكون plate(s) فارغة OutputPlate(s) حيث يتم تجميع ردود الفعل.
  2. إعداد معالج السائل مراقبة البرامج بإنشاء مثيلات لكل لوحة عينة وكاشف على استعداد، مع التأكد من اسم لهم تماما كما تظهر على الخرائط لوحة المتولدة عن mocloassembly.com، بما في ذلك حوض من نظيفة، والمياه المسماة ' خزان '.
  3. باستخدام الأمر 'ووركليست' في برنامج السيطرة، تحميل الملف.gwl إنشاؤها بواسطة اداتنا البرمجيات، متبوعاً بأمر آخر 'ووركليست' التي سيتم تنفيذ الملف.gwl المحملة في الأمر الأول.
  4. تنفيذ البرنامج النصي باستخدام الأمر 'تشغيل' برنامج وحدة تحكم.
    ملاحظة: السماح دائماً لمعالج السائل الروبوتية لإكمال تنفيذ البرنامج النصي قبل محاولة الوصول إلى مساحة سطح السفينة.
  5. قم بإزالة كافة لوحات من سطح السائل معالج. قد يتم حفظ المتبقي الحمض النووي بختم SetupPlate(s) مع الفيلم ختم الألومنيوم وتخزينها في-20 درجة مئوية. ختم OutputPlate(s) مع الفيلم لاصقة ووضع في ثيرموسيكلير أو كتلة الحرارة وتشغيل مع المعلمات دورة التالية:
    37 درجة مئوية ح 2، 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، عقد في 4 درجات مئوية
    ملاحظة: بمجرد اكتمال ثيرموسيكلينج رد الفعل، OutputPlate(s) يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية حتى أنهم على استعداد لتحويل.

4-تحويل ردود الفعل [يوم واحد]

  1. ذوبان الجليد العدد اللازم من المختصة كولاي الخلية مختبرين الحاجة (10 ميليلتر في الرد) على الجليد.
    ملاحظة: للحفاظ على العقم، تنفيذ الخطوات التالية يجب أن يكون القرب من لهب المكشوف، أو داخل غطاء الاندفاق الصفحي.
    1. بينما يتم تذويب الخلايا، إعداد لوحات أجار رطل (التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة) قبل بيبيتينج ميليلتر 50 من 0.1 م إيبتج و 50 ميليلتر من 20 ملغ/مل س-غال إلى السطح. جعل مزيج رئيسي إذا كان الطلاء عددا كبيرا من ردود الفعل. معطف لوحات بالتساوي باستخدام قضيب زجاج عقيمة أو الزجاج الخرز والسماح باللوحات الراحة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل التصفيحات البكتيريا.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، إضافة إيبتج، والعاشر--غال لاجار السائل قبل أن يتم صب لوحات، في 2 مم إيبتج و 40 ميكروغرام/مل س-غال التركيز النهائي. تخزين هذه اللوحات خارج الضوء المباشر كما غال X حساسة للضوء.
  2. على الجليد، الكوة ميليلتر 10 من الخلايا المختصة لكل رد فعل إلى لوحة بكر 96-بئر جديدة. وسيكون هذا "التحول لوحة".
  3. إضافة ميليلتر 1-3 لكل رد فعل من OutputPlate(s) إلى المقابلة أيضا في "لوحة التحويل" واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
  4. إغلاق "لوحة التحويل" مع صدمة الفيلم والحرارة لاصقة في ثيرموسيكلير في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. ثم فورا وضع اللوحة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  5. إلى الآبار نفس لوحة التحويل، إضافة 150 ميليلتر لوسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب وختم بختم لاصقة ألومنيوم واحتضان في 37 درجة مئوية بينما تهتز عند 900 دورة في الدقيقة للموارد البشرية 1.
  6. لوحة المحتويات الكاملة لكل بئر من "لوحة التحويل" على لوحات رطل-أجار أعد 4.1.1 استخدام قضيب زجاج عقيمة أو الزجاج الخرز معطف بالتساوي على سطح اللوحة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

5-استنساخ التحقق [يومين]

  1. إعداد واحد أو عدة كتل الثقافة 96 بئر عميق مع 1.5 مل من مرق رطل (التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة).
    1. على غرار الخطوة 2.2، تطعيم block(s) الثقافة الآبار العميقة مع المستعمرات أبيض واحد من كل لوحة أجار رطل من ردود فعل تحول.
    2. ختم block(s) الثقافة مع ختم غاز نفاذية واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية بينما تهز 900 لفة في الدقيقة.
      ملاحظة: وحدات الاستنساخ تقنية تستخدم الكشف الأزرق والأبيض، حيث كفوس الإيجابية سوف تظهر بيضاء على لوحة رطل-أجار، بينما ستظهر ناقلات الوجهة فارغة الأزرق.
  2. عزل الحمض النووي بلازميد من الثقافات البكتيرية (كما هو الحال في 2.3) ويقدم سانغر التسلسل للتحقق من الحيوانات المستنسخة.

النتائج

هنا نظهر الجمعية وحدات الآلي من أجهزة الدنا 96 من مختلف أجزاء الحمض النووي الأساسية (الشكل 1b) استخدام منصات الآلي معالجة السائل الروبوتية اثنين. كل وحدة النسخي ترتيب خطي المروج وموقع ريبوسومال ملزمة، والجينات والمنهي النسخي، المستنسخة في ناقل وجهة محددة. طوس هي عنصر رئيسي في هرمية الدوائر الوراثية العديد من تصميمات28،29،30 ، وبالتالي فهي دليل طبيعية على مفهوم لهذا النهج. يمكن أن يتحقق التحقق من تسلسل الحيوانات المستنسخة في ~ 5 أيام من البداية إلى النهاية، ويقدم لمحة عامة عن سير العمل المعروضة في الشكل 1a.

باستخدام أداة وصف والبروتوكول، ألقينا القبض على عدة مقاييس مفيدة في تحديد النظام الأساسي الجمعية الأمثل نظراً لعدد محدد من ردود فعل الاستنساخ يمكن إنشاؤها بواسطة العلماء. ويوضح الشكل 2 ألف مقارنة بين رد فعل الجمعية مرات عبر جميع الطرائق الثلاث. وقت التنفيذ هو إجمالي الوقت إكمال كافة الخطوات بيبيتينج المطلوبة لتجميع ردود فعل 96، الذي يشمل الاستغناء عن جميع أجزاء الحمض النووي والمواد الكاشفة. وقت العملي يشير إلى مجموع الوقت إنسان متورط يدوياً في إعداد ردود فعل الاستنساخ، أو الإعداد لبرنامج تشغيل معالج السائل. ويقارن الشكل 2b التكلفة بين الأساليب المختلفة. التكاليف المقدمة لفعل واحد على استعداد بكل طريقة، وتشمل سعر الإنزيمات ونصائح ماصة المتاح، نظراً لحجم أدنى رد نموذجي (20 ميليلتر لمعالج السائل، 10 ميليلتر لدليل، 250 nL لموزع الصوتية). كانت متسلسلة استنساخ واحد من جميع ردود الفعل 96 لمجموعات إعداد معالج يدوي والسائل على حد سواء، مع مجموعة فرعية 12 متسلسلة لردود الفعل موزع الصوتية (الشكل 2 (ج)). تم الحصول على التسلسل الصحيح ل 95% مجموعات معالج يدوي والسائل 96. 83 في المائة من العينة موزع الصوتية مجموعة فرعية كانت صحيحة، ولكن ردود الفعل اثنين النهائية التي لم تؤد إلى أي مستعمرات بيضاء، احتمالاً بسبب خلط غير كافية من قطرات بعد الاستغناء عن الحمض النووي والمواد الكاشفة كاملة. ويوضح الشكل 2d كفاءات رد فعل الاستنساخ، مقاسا بنسبة المستعمرات بيضاء إلى العدد الإجمالي للمستعمرات، وقابلة للمقارنة بين يدوياً (94 ٪) والسائل المجمعة معالج (84 في المائة) ردود فعل. من المثير للاهتمام، عند تقليص حجم الرد النهائي مع موزع الصوتية، لاحظنا انخفاضا ملحوظا في كفاءة رد فعل عندما تم إعداد ردود الفعل في أحجام أصغر من 1 ميليلتر (تكميلية الشكل 1 & تكميلية الجدول 2). ومن المرجح بسبب التبخر أثناء رد فعل ثيرموسيكلينج، التي يمكن أن تسبب زيادة في تركيزات الملح في رد الفعل.

figure-results-1
الشكل 1. الحمض النووي الجهاز مكتبة الجمعية سير عمل تلقائياً.
(أ) نظرة عامة سير العمل التجريبي قدم في هذا العمل. (1) الباحثين أولاً تحميل ملفات بنك الجينات لجميع أجزاء الحمض النووي وناقلات الوجهة التي ترغب في استخدامها. (2) وبعد ذلك، يتم تحديد أجزاء الحمض النووي التي ستدرج في الجمعية العامة. (3) أداة سوف ثم إنشاء قائمة اختيار لمعالج سائل الآلي، فضلا عن خرائط لوحة لمساعدة السكان اليدوي مع أجزاء الحمض النووي والانزيم mastermix. (4) استخدام الحمض النووي ولوحات الكواشف، فضلا عن قائمة الخيارات التي تم إنشاؤها، الباحثين تنفيذ الجمعية العامة لردود فعل الاستنساخ على معالج السائل. (5) بمجرد اكتمال، ردود الفعل التي حولت ومطلي لتحليل المتلقين للمعلومات. (ب) "قائمة من الحمض النووي" الأجزاء المستخدمة في هذا العمل. مجموعة مروجين الثلاثة، ثلاثة ريبوسومال ملزم مواقع أربعة الترميز تسلسل، واستخدمت واحد فاصل النسخي إنشاء مكتبة اندماجي طوس 96. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
الرقم 2. إجراء مقارنات عبر ثلاث طرائق الجمعية ردود فعل مختلفة.
(أ) رد فعل وقت الإعداد ل 96 ردود الفعل تجميعها يدوياً، عن طريق معالج سائل، وموزع صوتية. أحاطت الجمعية العامة دليل 2 دقيقة 10 ح، كل منها كان الوقت العملي. معالج السائل أخذت كمية مماثلة من الوقت (2 ساعة و 6 دقيقة) لتنفيذ الأوامر بيبيتينج، ومع ذلك كان التدريب العملي على جزء فقط من ذلك الوقت (5 دقائق). موزع الصوتية أقل بكثير من الوقت لتنفيذ تحويلات السائل (5 دقائق) وتولى التدريب العملي على الحد الأدنى من الوقت (5 دقائق). (ب) سعر كل واحد رد فعل الاستنساخ لكل أسلوب الجمعية. ويشمل هذا السعر تكلفة الإنزيمات المستخدمة، فضلا عن نصائح ماصة. (ج) ترتيب النتائج من مستعمرات واحدة من 96 جميع المجتمعين طوس. النسبة المئوية لاستنساخ الصحيح كان قابلة للمقارنة عبر كل أساليب الجمعية. لاحظ أن فقط مجموعة فرعية (12) جمعيات 96 كاملة تحولت من موزع الصوتية إعداد العينات. لم تسفر أي مستعمرات بيضاء، يرجح أن سبب الخلط غير كاف من قطرات mastermix الحمض النووي والأنزيمات في أووتبوتبلاتي اثنين من ردود الفعل. (د) مقارنة بين الاستنساخ لأغراض الكفاءة رد الفعل بين ردود الفعل معالج إعداد دليل والسائل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الإضافي رقم 1. يقلل فعالية رد فعل مع خفض حجم رد الفعل.
الكفاءة رد فعل انخفاض ملحوظ عند تقليص حجم رد فعل أدناه 1 ميليلتر. ويعتبر هذا الاتجاه مع اثنين مختلفة من تركيزات الحمض النووي النهائي؛ ومع ذلك، قد يختار العلماء لاستخدام وحدات أصغر لإنقاذ على تكاليف الكاشف إذا كان يمكن التغاضي عنه انخفاض الكفاءة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

1 الجدول الإضافي.
جدول معلمات الفئة سائل الحمض النووي والأنزيمات لمختلف وحدات التخزين بيبيتينج. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

2 الجدول الإضافي.
رد فعل كفاءة العمليات الحسابية. الخام زيمبابوي الأرقام تعطي ل 12 من ردود الفعل محولة 96 أعدت يدوياً وعن طريق معالج السائل. كما تتوفر أرقام زيمبابوي لإجراء اختبار لأصغر حجم الرد النهائي على موزع الصوتية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

وفي الختام، التشغيل الآلي للحمض النووي جهاز إنشاء العملية الكاملة، من تصميم في السيليكون للتعامل مع السائل، هدف قابلة للبقاء مع القائمة حاليا التكنولوجيا. البرمجيات والروبوتات الحديثة تسمح بإنشاء مهام سير العمل التي تكون فعالة من حيث التكلفة والوقت فعالة، وقابلة للتطوير، بينما تنتج نتائج استنساخه باستمرار أكثر من الأساليب اليدوية أيضا. أثناء التشغيل الآلي قد لا يكون دائماً هو الخيار الأكثر فعالية من حيث التكلفة لتنفيذ بروتوكول، وهو تحسين إمكانية تكرار نتائج تجريبية وتحرر الباحث قيمة الوقت. ومع ذلك، اعتماداً على الأجهزة المستخدمة، استخدام أتمتة يمكن أحياناً محرك تكلفة ووقت تنفيذ أقل ما يمكن تحقيقه من خلال الأساليب اليدوية التقليدية. وعلاوة على ذلك، أتمتة يلتقط البروتوكولات صراحة في طريقة رسمية منع مخصصة، الحرفيين، والقصصية أفضل الممارسات القائمة على التجريب. هنا يتضح أن الجمعية الآلي لوحدات الحمض النووي الأجهزة، والبروتوكول، والملفات الإلكترونية، والموارد المادية من الحمض النووي اللازمة للقارئ لأداء هذه، وما شابه، يتم توفير تجارب على الخاصة بهم. أننا نأمل في توافر لدينا أداة، ونشر هذا البروتوكول سوف تكون بمثابة مورد ونقل الحقل نحو مستقبل أكثر شفافية والمجتمعية في مجال عمليات الجمعية الحمض النووي والسائل التعامل مع الروبوتات.

فائدة أجهزة التشغيل الآلي يعتمد إلى حد كبير على التكوين وقدرات هذه الأجهزة. على سبيل المثال، لدينا معالج السائل يستخدم نظام السوائل التشرد لتحفيز أسبيراتي والاستغناء عن الأوامر. الحقن بيستونز أن محرك أقراص النظام السائل 1 مل كبيرة نسبيا، بينما مفيدة لمجموعة من وحدات التخزين، يفرض حد أدنى 2 ميليلتر للاستغناء عن دقيقة من الكواشف. نتيجة لذلك، علينا الارتقاء بالحجم الإجمالي لاستنساخ ردود الفعل إعداد معالج السائل إلى 20 ميليلتر، منذ ذلك الحين كل الاستغناء عن الأوامر اللازمة لتكون إيه تو ميليلتر. هذا تضاعف فعالية التكلفة لكل رد فعل للسائل هيأهم معالج ردود الفعل، بيد أن التدريب العملي على الوقت المطلوب لتنفيذ تلك ردود فعل انخفضت انخفاضا كبيرا. في محاولة لمعالجة هذه المسألة، كررنا في إعداد رد فعل لجميع ردود الفعل 96 في عبوة سائل صوتية. هذا الجهاز يستخدم الطاقة السليمة للاستغناء عن السوائل مباشرة من لوح واحد إلى آخر، ويمكن أن يحقق الاستغناء عن كميات أقل بكثير (2.5 nL) ما هو ممكن مع التشرد الهواء القياسية على أساس الممصات اليدوية. باستخدام هذا الجهاز، تمكنا من خفض إجمالي حجم ردود الفعل لدينا 250 nL، تخفيض محاطاً بالمقارنة مع ردود الفعل معدّة يدوياً من 10 ميليلتر. بسبب أحجام صغيرة الاستغناء عن، وعدم وجود تغييرات تلميح بين الخطوات بيبيتينج، موزع الصوتية كانت قادرة على توليد نفس ردود الفعل 96 في جزء من الوقت (< 5 دقائق). حفظ أصغر حجم رد فعل أيضا على الكواشف مهدرة، حيث عادة ما نحول فقط 1-3 ميليلتر من رد فعل. أن يقال، استخدام أجهزة التشغيل الآلي للمكاتب، بالاقتران مع برامج بديهية، يمكن إتاحة توليد عدد كبير من ردود الفعل الجمعية الحمض النووي لجمهور أكاديمية أوسع.

هنا، علينا أن نظهر فائدة أداة البرمجيات لدينا، ولكن هناك عددا من الميزات التي ستساعد على توسيع فائدته. أولاً، في كل مرة يتم استخدام الأداة لإنشاء تجميع اندماجي، اللوحات جزء الحمض النووي الجديدة يجب إنشاء، تتطلب العلماء لتعبئة هذه اللوحات يدوياً للجمعية كل تشغيل. أنه من المفيد، بدلاً من ذلك، إذا كان الباحث يمكن تحديد موقع أجزاء في صفيحة الحمض النووي لاستخدامها في الجمعية العامة. وهذا ستسمح باستخدام بلازميد الفائق مجموعات تنقية الحمض النووي منذ الباحثين يمكن تطعيم الثقافات من أدوات مثل المكتبة موكلو السدر، وتنقية جميع العينات معا مع الحفاظ على الموقع جيدا لكل جزء محدد في المجموعة. وثانيا، الأداة حاليا يعتمد فقط استخدام لوحات 96-جيدا. قد يتجاوز عدد الحمض النووي، والكاشف، ولوحات الوجهة للمشاريع الأكبر فيها عدة مئات من أجهزة الحمض النووي بحاجة إلى أن يبني قدرة سطح معالج السائل. هذا يمكن، جزئيا على الأقل، التخفيف من حدة المشكلة بتقديم الدعم لتنسيقات لوحة الكثافة أعلى (384 أو 1536-جيدا). وأخيراً، الأداة حاليا يدعم فقط نوع واحد من معالج السائل واستراتيجية الجمعية الحمض النووي. وفي حين أنه من السهل نسبيا لتحويل تعليمات معالج السائل تنتج أداة لتنسيق موزع صوتية استخدام برامج جداول البيانات، ونأمل أن توسيع دعم أصلي للعديد من معالجات سائلة المختلفة التي كثيرا أن توسع نطاق تطبيقه، كما التوافق مع التقنيات الأخرى المشتركة في الجمعية الحمض النووي أن جيبسون الجمعية31.

جزء حاسم من هذا النظام الإيكولوجي الجمعية الآلي هو مجموعة من أدوات البرمجيات التي تترجم خطط الجمعية الرفيع المستوى إلى بروتوكولات الأتمتة ودية صراحة المجدولة لتشغيل على السائل التعامل مع الروبوتات. على الرغم من وجود عدد من أدوات البرمجيات التي تسمح للباحثين لتصميم التجميعات في السيليكون بما في ذلك بينتشلينج، ومخطط موكلو والغراب32، قليلة لديها القدرة على ترجمة تلك النماذج إلى إرشادات القابل للتنفيذ لتشغيل على سائل معالج. إلى أن ينتهي، وعمل مثل التشغيل الآلي للعلاقات العامة--العلاقات العامة والعرائس33،،من3435 قد بدأت لجعل هذه الأدوات متوفرة. وبالإضافة إلى ذلك، تبحث في سبل لإدخال "سحابة" المعامل التي توفر خدمات تجريبية لمجموعات كبيرة من المستخدمين النهائيين عن طريق التشغيل الآلي الكيانات التجارية العاملة في هذا المجال. يمكن أن يكون البروتوكول الواردة في هذه الورقة كما تقدم قطعة من أي من هذه الجهود وهي معروضة كخدمة.

أن الجمعية الآلي للحمض النووي من الأجهزة ذات قيمة مباشرة ووضوحاً للبيولوجيا التركيبية، فلدينا بروتوكول مفيد للمجتمع الأوسع من علماء البيولوجيا الجزيئية، وكذلك. أتمتة الجمعية الحمض النووي يسمح أعدادا كبيرة من المعروفة، ولكن أجهزة مماثلة، والوراثية المراد إنشاؤها في نفس الوقت ويمكن تمكين التوليف السريع من مكتبات التعبير للفحص والاختبار الأغراض في دراسات التنمية المخدرات. ونأمل أن لدينا أداة البرمجيات بذل جهود الجمعية أكبر الحمض النووي القائم على اندماجي أكثر يسرا، وموردا مفيداً لكلا البيولوجيا التركيبية، فضلا عن الأوساط الأكاديمية أكبر.

الإفصاحات

دينسموري هو الرئيس والمؤسس المشارك لشعرية التشغيل الآلي للمكاتب، وشركة تيمونس ومكارثي الموظفين شعرية. شعرية يجعل من البرمجيات والخدمات لأتمتة العديد من العملية المذكورة.

شكر وتقدير

ونحن نشكر سعود باتيا، أليخاندرو بيلايز، وجونسون لام للعمل على المشروع العرائس، فضلا عن صهيب كار وراشيل سميث، وتوماس كوستا للحصول على مساعدة مع هذه المخطوطة. ومولت هذا العمل الوظيفي NSF جائزة #1253856. كما يمول "الحملات جبهة الخلاص الوطني" في الحوسبة جائزة #1522074.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>الأجهزة / البرامج< / قوي> Freedom
EVO 150 روبوت مناولة السوائلTecanسائل مخصص مزود بذراع ماصة 8 قنوات
http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo
Freedom EVOware Standard (الإصدار 2.4 Service Pack 2)Tecanالبرنامج المستخدم للتحكم في معالج السوائل Freedom EVO 150
http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware
Echo 550LabcyteAcoustic Liquid Dispenser
http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler
Sorvall Legend RTSorvallجهاز طرد كبير متأرجح
دلو MasterCycler ProEppendorf950040015Thermocycler مع كتلة حرارية 96 بئر
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html
ECHOTHERM تبريد / تدفئة حمام جافتوري باينز كتلةالتدفئة / التبريد العلمي ل EVO 150 سطح السفينة
https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr
جهاز طرد مركزي دقيق منضدية 5418Eppendorf5418000017Stardard 18 بئر أجهزة الطرد المركزي الدقيقة
https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html
Name< / strong>Company< / strong> Catalog NumberComments
< أداة الويب القوية > الموارد < / قوية >
mocloassembly.comأتمتةلتجميع الحمض النووي الاندماجي
mocloassembly.com
مجموعة أجزاء CIDAR MoClo1000000059من مخزونات الجلسرين البكتيرية لجميع أجزاء الحمض النووي المستخدمة في هذه الدراسة
https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/
CIDAR ICE RegistryCIDAR Labسجل خرائط الحمض النووي البلازميد
https://ice.cidarlab.org/folders/8
https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current
nameCompanyCatalog NumberComments
Labware
50 مو ؛ L نصائح موصلةTecan30 057 818معقمة 50 & mu ؛ L نصائح موصلة لمعالج سائل Tecan
http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips
2 مل ألواح ثقافة عميقة 96 بئر الولاياتالمتحدة الأمريكية Scinetific5678-0285ألواح الثقافة البكتيرية المستخدمة لزراعة أعداد كبيرة من العينات
http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html
1.5 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة أنابيبالولايات المتحدة الأمريكية Scinetific1615-5599أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي يمكن التخلص منها
http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx
التنفس غشاء ختم أسهلSigma-AldrichZ763624-100EAغشاء مانع للتسرب قابل للتنفس لألواح الثقافة البكتيرية
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US
تنورة كاملة ، منخفضة المظهر الجانبي ، 96 بئر لوحات PCRلوحات GeneMateT-3183-2PCR المستخدمة في جميع الخطوات
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R
رقائق ختم الألومنيوم لألواح PCRأختام الألومنيوم GeneMateT-2451-1لتخزين لوحة PCR
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1
ختم البولي أوليفين لألواح PCRGeneMateT-2450-1أختام بلاستيكية لألواح PCR أثناء ركوب الدراجات
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1
مبرد PCREppendorf22510525باردة 96 بئر
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html
name < / strong > Company < / قوي><قوي>رقم الكتالوج<قوي>تعليقات
<قوي>كواشف
GenCatch البلازميد الحمض النووي مصغرة مجموعة الإعداديةحقبة علوم الحياة2160250طقم تنقية الحمض النووي البلازميد
http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx
T4 DNA Ligase (HC)PromegaM1794تركيز عال T4 DNA Ligase
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794
BbsI إنزيم تقييدنيو إنجلاند بيولابزR0539LBbsI عند 10,000 وحدة / مل
https://www.neb.com/products/r0539-bbsi
إنزيم تقييد BsaIنيو إنجلاند بيولوجيلابR0535Lإنزيم BsaI عند 10,000 وحدة / مل
https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf
T4 DNA Ligase Buffer PackPromegaC126310x T4 DNA ligase buffer
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/
Isopropyl-ß ؛ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) ZymoResearchI1001-250.5M IPTG Solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL)Zymo ResearchX1001-2520 مجم / مل محلول X-GAL
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal
كبريتات كاناميسينزيموA1003-2535 مجم / مل محلول كاناميسين
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate
كاربينسيلين (ملح ثنائي الصوديوم)فيشرBP264811 جم كاربينيسيلين (أمبيسلين تناظري)
https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin
SOC مرق وسائل الإعلامTeknovaS0225وسائط المسحوق المستخدمة في صنع مرق SOC
http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm
LB Broth (Lennox) MediaSigma-AldrichL3022-1KGوسائط مسحوق تستخدم لصنع مرق LB
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US
LB Broth مع أجار (Lennox) MediaSigma-AldrichL2897-1KGLB مع مزيج أجار يستخدم لصنع ألواح الوسائط الصلبة
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US
Alpha-Select Gold كفاءة الخلايا المختصةBiolineBIO-85027عالية الكفاءة كفاءة كيميائيا بكتريا قولونية الخلايا
> http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html name< / strong>الشركة< / قوي><قوي>رقم الكتالوجتعليقات
Primers
Primer VF5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3'
بادئات تستخدم لتسلسل Sanger ومستعمرة PCRs
Primer VR5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3'
بادئات تستخدم لتسلسل Sanger و مستعمرة PCRs
معالج الشبكة مجموعة فيلم كتلة أبحاث

المراجع

  1. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403 (6767), 339-342 (2000).
  2. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403 (6767), 335-338 (2000).
  3. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
  4. Anderson, J. C., Clarke, E. J., Arkin, A. P., Voigt, C. A. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J Mol Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  5. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  6. Ro, D. K., et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440 (7086), 940-943 (2006).
  7. Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
  8. Savage, D. F., Way, J., Silver, P. A. Defossiling fuel: how synthetic biology can transform biofuel production. ACS Chem Biol. 3 (1), 13-16 (2008).
  9. Fussenegger, M., et al. Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells. Nat Biotechnol. 18 (11), 1203-1208 (2000).
  10. Boorsma, M., et al. A temperature-regulated replicon-based DNA expression system. Nat Biotechnol. 18 (4), 429-432 (2000).
  11. Malphettes, L., et al. A novel mammalian expression system derived from components coordinating nicotine degradation in arthrobacter nicotinovorans pAO1. Nucleic Acids Res. 33 (12), e107(2005).
  12. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  13. Lou, C., Stanton, B., Chen, Y. J., Munsky, B., Voigt, C. A. Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol. , (2012).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology--identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnol J. 7 (7), 856-866 (2012).
  15. Carr, S. B., Beal, J., Densmore, D. M. Reducing DNA context dependence in bacterial promoters. PLoS One. 12 (4), e0176013(2017).
  16. Yeung, E., Ng, A., Kim, J., Sun, Z. Z., Murray, R. M. Decision and Control (CDC), 2014 IEEE 53rd Annual Conference on. , 5405-5412 (2014).
  17. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553(2009).
  18. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765(2011).
  19. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo Assembly Standard and New E. coli Part Library Enable Rapid Combinatorial Design for Synthetic and Traditional Biology. ACS Synth Biol. 5 (1), 99-103 (2016).
  20. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  21. Bhatia, S. P., Smanski, M., Voigt, C. A., Densmore, D. M. Genetic design via combinatorial constraint specification. ACS Synth Biol. , (2017).
  22. Ham, T. S., et al. Design, implementation and practice of JBEI-ICE: an open source biological part registry platform and tools. Nucleic Acids Res. 40 (18), e141(2012).
  23. Madsen, C., et al. The SBOL Stack: A Platform for Storing, Publishing, and Sharing Synthetic Biology Designs. ACS Synth Biol. 5 (6), 487-497 (2016).
  24. Knight, T. Draft standard for BioBrick biological parts. , (2007).
  25. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. Ma, A. C., et al. FusX: A Rapid One-Step Transcription Activator-Like Effector Assembly System for Genome Science. Hum Gene Ther. 27 (6), 451-463 (2016).
  27. Check Hayden, E. The automated lab. Nature. 516 (7529), 131-132 (2014).
  28. Nielsen, A. A., et al. Genetic circuit design automation. Science. 352 (6281), aac7341(2016).
  29. Woodruff, L. B. A., et al. Registry in a tube: multiplexed pools of retrievable parts for genetic design space exploration. Nucleic Acids Res. 45 (3), 1553-1565 (2017).
  30. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  31. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  32. Appleton, E., Tao, J., Haddock, T., Densmore, D. Interactive assembly algorithms for molecular cloning. Nat Methods. 11 (6), 657-662 (2014).
  33. Vasilev, V., Liu, C., Haddock, T., Bhatia, S., Adler, A., Yaman, F., Beal, J., Babb, J., Weiss, R., Densmore, D. A Software Stack for Specification and Robotic Execution of Protocols for Synthetic Biological Engineering. SynBERC Fall Retreat, Harvard University. , (2011).
  34. Beal, J., et al. An end-to-end workflow for engineering of biological networks from high-level specifications. ACS Synth Biol. 1 (8), 317-331 (2012).
  35. Bhatia, S., Densmore, D. Pigeon: a design visualizer for synthetic biology. ACS Synth Biol. 2 (6), 348-350 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الاستنساخ التركيبيمناولة السوائل الآليةبروتوكول تجميع الحمض النووي DNAمناول السوائل الروبوتيبرنامج MoCloAssemblyتجميع الحمض النووي DNA عالي الإنتاجيةإنزيم القطع من النوع IISمكتبات الحمض النووي DNA التوليفيةتحسين مناول السوائلبناء أجهزة الحمض النووي DNA
الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.