مقالة منهجية

الكشف عن المثقبية البروسية التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي

DOI:

10.3791/54715

⸱

أكتوبر 19, 2016

 ,  ,  , 
1Laboratory of Lymphocyte Biology, Rockefeller University, 2Department of Biology, Harvey Mudd College, 3Masters School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تخضع المثقبيات الأفريقية < p class = 'jove_content'> المثقبيات الأفريقية المزروعة في المختبر لتباين مستضد بمعدل منخفض ، بحيث تتكون السكان من طفيليات تعبر عن نوع البروتين السكري السطحي المتغير السائد (VSG) ومجموعة صغيرة من المتغيرات "المبدلة". يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة لاكتشاف هذه المجموعات وقياسها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المثقبية البروسية ، وهو طفيلي أولي يسبب كلا من داء المثقبيات الأفريقي البشري والحيواني (المعروف باسم مرض النوم والناجانا ، على التوالي) بين ناقل التسي تسي ومضيف الثدييات. يتهرب من الجهاز المناعي المضيف للثدييات عن طريق التبديل الدوري للبروتين السكري السطحي الكثيف المتغير (VSG) الذي يغطي سطحه. يمكن أن يكون اكتشاف التباين المستضد في المثقبية البروسي مرهقا وكثيف العمالة. هنا ، نقدم طريقة لقياس عدد الطفيليات التي "تحولت" للتعبير عن VSG جديد في مجموعة سكانية معينة. يتم تلطيخ الطفيليات أولا بجسم مضاد ضد VSG المبدئي ، ثم تلطيخها بجسم مضاد ثانوي متصل بحرزة مغناطيسية. ثم يتم فصل الطفيليات التي تعبر عن VSG البداية عن بقية السكان عن طريق تشغيل الطفيليات فوق عمود متصل بمغناطيس. يتم الاحتفاظ بالطفيليات التي تعبر عن VSG المهيمن على العمود ، بينما يحتوي التدفق على طفيليات تعبر عن VSG جديد بالإضافة إلى بعض الملوثات التي تعبر عن VSG الأولي. يتم تلطيخ هذه المجموعة المتدفقة مرة أخرى بجسم مضاد مصنف بالفلورسنت ضد VSG المبدئي لتسمية الملوثات ، ويوديد البروبيديوم (PI) ، الذي يصنف الخلايا الميتة. يضاف عدد معروف من حبات العد المطلقة التي يمكن رؤيتها عن طريق قياس التدفق الخلوي إلى مجموعة التدفق. يمكن بعد ذلك استخدام نسبة الخرزات إلى عدد الخلايا التي تم جمعها لاستقراء عدد الخلايا في العينة بأكملها. يستخدم قياس التدفق الخلوي لتحديد عدد المحولات عن طريق حساب عدد الخلايا السالبة PI التي لا تلطخ بشكل إيجابي لبدء VSG السائد. يمكن بعد ذلك حساب نسبة المحولات في السكان باستخدام بيانات قياس التدفق الخلوي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وطفيلي، المثقبيات البروسية، هو العامل المسبب للأمراض التي تصيب الإنسان (عبر المثقبية البروسية الغامبية والمثقبية البروسية الروديسية) والحيوانات (عبر المثقبية البروسية البروسية) في جميع أنحاء أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى. وينتقل المرض إلى المضيف الثدييات عن طريق اللعاب من ناقلات ذبابة التسي تسي. كل من الإنسان وداء المثقبيات الأفريقي الحيوانية تسبب عبئا اقتصاديا كبيرا في المناطق الموبوءة، وقليلة الأدوية المتاحة أو في مجال التنمية لعلاج إما المرض. فهم آليات التهرب المناعة أمر بالغ الأهمية لتطوير عقاقير لداء المثقبيات. تباين الأنتيجين للكثيفة، سطح البديل البروتين السكري (VSG) معطف الذي يغطي الطفيلي هو إحدى الوسائل الرئيسية التي T. البروسية يتهرب استجابة الأجسام المضادة الثدييات. وجود ما يقرب من 2000 أنواع من الجينات VSG في الجينوم المثقية، ولكن كتب واحد فقط في أي وقت من الأوقات من أحد ~ 15 مورينداتاهيتيانونيمواقع سيون. "التبديل" من VSG أعرب يمكن أن يحدث إما عن طريق نسخ الجين VSG في الموقع التعبير النشط، أو عن طريق تفعيل النسخي من موقع تعبير صامت سابقا (إعادة النظر في 1).

على الرغم من الكثير من العمل وقد كرس لفهم الاختلاف الأنتيجين في T. البروسية، والعوامل التي تؤثر على تردد التبديل لا تزال غير مفهومة. تعرقلت الدراسات حتى الآن من حقيقة أنه في حين أن يحدث التحول عشوائيا في المختبر، ترددات التحول منخفضة جدا، بناء على أمر من 1 في حوالي 10 6 خلايا 2. وهذا يجعل من الصعب قياس ما إذا كان إعطاء زيادة عامل أو تنخفض وتيرة التحول، منذ التحول من الصعب كشف في المقام الأول. قبل عام 2009، كانت طرق لعزل المحولات في عدد معين من السكان طويلة وكثيفة العمالة. هذه الركض المثقبيات من خلال الفئران تحصين ضد VSG المهيمن ومن ثم حصاد الخلايا شملتفي اليوم التالي 3، أو عد مئات من الخلايا المناعي 4،5. وتعتمد استراتيجية أخرى في الاختيار لمقاومة المخدرات لعزل المحولات 6. لأن المثقبيات الأفريقي نمت في المختبر يتم عادة تتكون من عدد كبير من السكان معربا عن البديل رئيسي واحد، ويبلغ عدد سكانها أقل بكثير من المحولات التعبير عن المتغيرات بديلة، نشير إلى البديل الرئيسي في هذه الورقة باعتبارها المهيمنة، بدءا VSG. في القيام بذلك، ونحن في أي وسيلة ترغب في الإيحاء بأن هذا البديل الرئيسي لديه لياقة بدنية أكبر من المتغيرات الأخرى في عدد السكان.

نحن هنا تصف طريقة التي يمكن قياس موثوق عدد المثقبيات تعبر عن VSG غير المهيمن في عدد معين من السكان في 3-4 ساعة. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لعند واحد يريد التأكد ما إذا كان التلاعب الجيني معين أو العلاج من تعاطي المخدرات يزيد من عدد الخلايا تحولت في عدد السكان. بدلا من تخليص السكان من الخلايا معربا عن افعلminant، بدءا VSG من خلال العقاقير أو عن طريق المناعية، يتم التخلص من هذه الخلايا عن طريق طلاء لهم أولا مع حبات مغناطيسية بالإضافة إلى الأجسام المضادة ضد VSG المهيمن ومن ثم عزلهم على عمود المغناطيسي. السكان تحولت بعد ذلك جمع في التدفق من خلال وملطخة مرة أخرى مع fluorophore المسمى الأجسام المضادة لمكافحة VSG لتحديد الملوثات. ويتحقق الكمي من خلال إضافة عدد محدد من الخرز العد المطلقة على كل عينة بحيث نسبة من الخرز إلى خلايا يمكن تحديد وتستخدم لتحديد عدد من المحولات في عدد السكان 7.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: في جميع أنحاء الداخلي، فمن الضروري للحفاظ على الخلايا على الجليد. وينبغي أيضا أن تستخدم وسائل الإعلام في جميع أنحاء الباردة.

حصاد 1. عينة

  1. تنمو معلن 427 المثقبيات سلالة الدم إلى كثافة ،5-1٬000٬000 / مل. فمن الأفضل أن تبدأ الثقافات مع عدد قليل من الطفيليات. تدور باستمرار 50 × 10 6 خلايا / عينة لمدة 10 دقيقة في 1500 ز س. تأكد من ترك 1 × 10 6 خلايا في الثقافة في وقت لاحق استخدام عناصر التحكم كما الإيجابية والسلبية الأضداد.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها على المثقبيات معزولة من دم الحيوانات (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
  2. ماصة أو صب من أكثر من طاف (ترك حوالي 750 ميكرولتر). نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  3. تدور الخلايا في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج في microcentrifuge وإزالة طاف.

2. وضع العلامات المغناطيسي

  1. Resuspend الخلايا في 150 مستنبت ميكرولتر (HMI-9 وايمصل عشر مثلا) + الأساسي الأجسام المضادة لمكافحة VSG في التخفيف المناسبة.
    ملاحظة: يرصد-VSG مكافحة الأجسام المضادة في المنزل واستخدامها في التخفيف من 01:50. من المهم أن استخدام الأجسام المضادة الأولية لمكافحة VSG التي لم يتم المسمى مع fluorophore.
  2. خلايا دوامة باستخدام دوامة محول-60 بسرعة 6-8 في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يغسل مع 800 - 1000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل.
  3. تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج ونضح طاف. تغسل مع 1 مل HMI-9 مع المصل وتدور على النحو الوارد أعلاه. نضح طاف. بيليه resuspend في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل.
  4. إضافة 110 ميكرولتر من خلية المغناطيسي تنشيط الفرز (MSC) ميكروبيدات. استخدام لمكافحة فأر، المضادة للأرنب، أو حبات مكافحة البيوتين بما يتناسب مع الأجسام المضادة لمكافحة VSG الأساسي. اخلط جيدا. خلايا دوامة في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. بينما الخلايا vortexing ل، مجموعة واحدة المغناطيسي تنشيط فصل العمود / عينة على المغناطيس الانفصال. يجب التأكد من أن إعادةceptacle (نستخدم أنبوب الطرد المركزي 15 مل) تحت العمود لجمع التدفق من خلال. إعداد جهاز في غرفة باردة.
  6. إضافة 2 مل من HMI-9 مع المصل إلى العمود الوزراء. بعد فتيلة مكان أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحت العمود لجمع التدفق من خلال من كل عينة.
  7. بعد حضانة 10 دقيقة في الخطوة 2.4، إضافة 800-1،000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. تغسل مع 1 مل من HMI-9 مع المصل وتكرار ترك 100 ميكرولتر من طاف.
  8. نفض الغبار أنبوب الطرد المركزي بقوة وفحص أنبوب للتأكد من أن بيليه هو معلق تماما. إضافة 1 مل من HMI-9 مع المصل وماصة صعودا وهبوطا للتأكد من أن الخلايا معلق أيضا.

3. الفصل المغناطيسي

  1. ضمان تستعد الأعمدة كما هو موضح أعلاه. تطبيق الخلايا إلى العمود. جمع التدفق من خلال بخلايا معربا عن VS غير المهيمنج 1 مل من المتوسط ​​+ المثقبيات وعادة ما يستغرق 6-7 دقيقة لتدفق من خلال العمود.
  2. غسل 2X مع 1 مل من HMI-9 مع المصل وجمع التدفق عن طريق الأنبوب نفسه كما في الخطوة 3.1.
  3. الفجوة التدفق من خلال (3 مل) في اثنين من 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
    ملاحظة: هذه يمكن أن تكون مجتمعة في وقت لاحق أو نصف يمكن استخدامها لعزل الحمض النووي الريبي، الخ
  4. إزالة عمود من المغناطيس. إضافة 3 مل من HMI-9 مع المصل إلى عمود وعمود يغرق في أنبوب 15 مل الطرد المركزي للحصول على خلايا التي تعبر عن الانطلاق، المهيمن VSG. إزالة 300 ميكرولتر من المواد مزال لتحليلها لاحقا. تبقى هذه الخلايا على الجليد.
  5. لاستخدامها بوصفها إيجابية ومراقبة سلبية، واتخاذ ما يقرب من 1 مليون خلية من ثقافة ابتداء من خلايا سيطرة متزايدة على 37 درجة مئوية (التي لا يتوقع أن التبديل في كثير من الأحيان) وماصة لهم في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    ملاحظة: سوف تكون ملطخة الخلايا السيطرة الإيجابية مع الأجسام المضادة المسمى fluorophore في الخطوة 4.1. سلبي الخلايا السيطرة ريمافي غير ملوثين خلال الفترة المتبقية من البروتوكول.
  6. عينات تدور التدفق من خلال وإيجابية العينة الضابطة الأجسام المضادة عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف.
    ملاحظة: آخر قسامة 300 ميكرولتر من خلايا مزال يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة إيجابية لمكافحة VSG تلطيخ.

4. تلطيخ في التعرف على الملوثات والتي تتيح أفضل طريقة

  1. عينات التدفق من خلال و resuspend والخلايا السيطرة الإيجابية في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل + الابتدائي، وصفت fluorophore، الأجسام المضادة لمكافحة VSG في التخفيف المناسبة.
    ملاحظة: يرصد المسمى مكافحة VSG الأجسام المضادة في المنزل واستخدامها في التخفيف من 1: 1000. وصفت fluorophore، ويمكن مكافحة VSG يكون من المصدر نفسه والأضداد توضيحها في الفصل بالاعمال step.There يجب أن يكون 3 مل من عينة التدفق من خلال في اثنين من أنابيب microcentrifuge التالية خطوة 3.5.
  2. لتحليل كل من التدفق من خلال التدفق الخلوي، والجمع بين الكريات في أنابيب microcentrifuge اثنين حين إعادة سوس-بانتظار العينات في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل + مكافحة VSG الأجسام المضادة. اخلط جيدا.
  3. خلايا دوامة في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إضافة 800 - 1000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. عينات تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف لإزالة الأجسام المضادة غير منضم.
  4. غسل الخلايا مع 1 مل من HMI-9 مع المصل. عينات تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف. خلال هذه تدور الماضي، وتدور أسفل-عينات مزال من الخطوة 3.4 وعينة السيطرة السلبية.
  5. و resuspend كل التدفق من خلال عينات مزال في: 148.5 ميكرولتر HMI-9 مع المصل، 25 ميكرولتر الخرز العد المطلق و 1.5 ميكرولتر التأيد Propidium تلطيخ حل (175 ميكرولتر المجموع). و resuspend العينات الإيجابية والسلبية مراقبة الأجسام المضادة في 175 ميكرولتر HMI-9 مع المصل. تأكد من تسجيل عدد من الخرز العد المطلقة / 25 ميكرولتر من أجل الكثير معين المستخدمة.
  6. تشغيل جميع العينات من خلال قياس التدفق الخلوي وجمع البيانات. الخلايا الميتة وصمة عار كما PI +. الملوثات وصمة عار كما PI - VSG +. المحولات وصمة عار كما PI - VSG - 8.
  7. حساب تبديل الترددات باستخدام التدفق الخلوي البيانات.
    ملاحظة: للحصول على إرشادات حول كيفية حساب الترددات التحول، يرجى الرجوع إلى ملف إضافي التدفق الخلوي Calculations.docx والجدول 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام أسلوب الموصوفة هنا لإثبات أن فواصل المزدوج حبلا داخل الموقع التعبير VSG زيادة عدد المحولات في عدد سكانها 8. هنا، وتبين لنا نتائج ممثل من سكان المثقبيات التي تم بفعل مماثل لتوليد مزدوج الجديلة في موقع التعبير. قارنا هذه المثقبيات إلى تلك التي لم يحملوا على توليد مزدوج الجديلة. ويبين الشكل 1 تدفق التمثيلي الخلوي المؤامرات من خلايا الامم المتحدة والتي يسببها والتي يسببها التي تم جمعها في التدفق من خلال المغناطيسي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفيما يتعلق تقنية تجريبية، وأهم عنصر من البروتوكول هو الحفاظ على جميع العينات البرد. المثقبيات استيعاب بسرعة كبيرة الأجسام المضادة بد أن سطحها 9، ولكن هذه العملية هو الحركة التي تعتمد، ولا تؤثر على فحص طالما يتم الاحتفاظ الخلايا في 4 درجات مئوية. وينبغي دائما أن تبقى جميع العينات على الجليد، وينبغي أن يتم pipetting لبسرعة للحد من التعرض إلى 25 ° C بيئة المختبر. يجب أن تكون باردة HMI-9 مع المصل متوفر في بداية التجربة ويجب أن تبقى على الجليد طوال الوقت. ويجب أن يتم بمعزل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نعترف جورج الصليب للحصول على المشورة العامة في الأحياء المثقبيات. وأيد هذا العمل أيضا من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس الحملة العالمية للتعليم منحة لDS، وجبهة الخلاص الوطني العليا زمالة أبحاث (DGE-1325261) لMRM والمعاهد الوطنية للصحة / NIAID (منحة # AI085973) إلى FNP. نشكر Galadriel الكوخ، مينر للاستخدام من سلالة يحتوي على موقع الجين والاعتراف I-SCEI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

الجسم التدفق

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المضاد غير المسمى المضاد ل VSGn / an / aيتكون الجسم المضاد VSG في المنزل
الفلوروفور المسمى الجسم المضاد المضاد ل VSGn / an / aالجسم المضاد VSG مصنوع في المنزل
HMI-9 median / an / aHMI-9 مصنوع في المنزل
Propidium IodideBD Pharmingen556463
CountBright حبات العدالمطلق Thermofisher أعمدة ScientificC36950
LDMiltenyi Biotech130-042-901
مغناطيس MACSMiltenyi Biotech130-042-303
MACS فاصل مغناطيسيMiltenyi Biotech130-042-302
محول دوامة -60ThermoFisher مقياسالخلوي AM10014
العلمي Coultern / a
برنامج تحليل مقياس التدفقالخلوي FloJon / a

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
  2. Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
  3. Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).
  4. Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).
  5. Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).
  6. Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).
  7. Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).
  8. Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).
  9. Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
  10. Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة