مقالة منهجية

تحليل استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء المعزولة من النباتات وشدد

DOI:

10.3791/54717

⸱

نوفمبر 1, 2016

 , 
1Department of Plant Sciences, University of Oxford

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف طريقة جديدة لدراسة استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء المعزولة تحت الضغط. فإن هذه الطريقة سريعة ومباشرة، ويمكن تطبيقها على دراسة النتائج المترتبة على ظروف الإجهاد مختلفة لاستيراد البروتين بلاستيدات الخضراء، والآليات التنظيمية ذات الصلة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلاستيدات الخضراء هي عضيات مع العديد من الأدوار الحيوية في النباتات، والتي تشمل الضوئي فحسب، بل العديد من التمثيل الغذائي وغيرها من الوظائف الإشارة. وعلاوة على ذلك، البلاستيدات الخضراء هي الحاسمة للاستجابة النبات لمختلف الضغوط غير الحيوية، مثل الملوحة والضغط الاسموزي. قد يحتوي على بلاستيدات الخضراء تصل الى ~ 3000 البروتينات المختلفة، وبعضها المشفرة بواسطة الجينوم الخاص بها. ومع ذلك، يتم ترميز معظم البروتينات بلاستيدات الخضراء في النواة وتوليفها في العصارة الخلوية، وتحتاج إلى يمكن استيرادها إلى بلاستيدات الخضراء من خلال translocons في الأغشية المغلف بلاستيدات هذه البروتينات. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن استيراد البروتين بلاستيدات الخضراء يمكن تنظيم بنشاط عن الإجهاد. للتحقيق كيميائيا مثل هذا التنظيم الاستيراد البروتين تحت ظروف الإجهاد، قمنا بتطوير الطريقة الموصوفة هنا كإجراء سريع ومباشر التي يمكن أن يتحقق بسهولة في أي مختبر. في هذه الطريقة، وتزرع النباتات تحت تكييف عادينانوثانية ثم تتعرض لظروف عصيبة في ثقافة السائل. يتم جمع المواد النباتية، ومن ثم يتم الافراج البلاستيدات الخضراء من التجانس. يتم فصل جناسة الخام عن طريق الطرد المركزي التدرج الكثافة، مما عزل البلاستيدات الخضراء سليمة. ويتم تقييم العائد بلاستيدات الخضراء التي كتبها العد، ويتم فحص intactness بلاستيدات الخضراء تحت المجهر. لفحوصات استيراد البروتين، يتم تحضين البلاستيدات الخضراء النقاء مع 35 S رديولبلد في المختبر ترجمة البروتينات السلائف، وأجرت تجارب الوقت طبعا لتمكين مقارنات لأسعار الواردات بين التراكيب الوراثية تحت ظروف الإجهاد. نقدم البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطريقة التي تظهر أن معدل استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء من المسخ التنظيمي يتم تبديل وجه التحديد تحت ظروف الإجهاد التناضحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلاستيدات الخضراء هي عضيات وفيرة جدا أن توجد في الأنسجة الخضراء من النباتات. وهي معروفة لدورها الحاسم في عملية التمثيل الضوئي، وهي العملية التي تستخدم الطاقة الضوئية لتحويل ثاني أكسيد الكربون إلى سكر، وبالتالي دعم الحياة كلها تقريبا على وجه الأرض 1. وبالإضافة إلى ذلك، البلاستيدات الخضراء (والأسرة أوسع من العضيات المتعلقة تسمى البلاستيدات) تلعب العديد من الأدوار الحيوية الأخرى في النباتات، بما في ذلك التركيب الحيوي من الأحماض الأمينية، والدهون، والأصباغ، والاستشعار من إشارات البيئية مثل الجاذبية والتحدي الممرض. التمثيل الضوئي يولد أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) بوصفه من المنتجات، والتي لها أدوار مفيدة في ظل ظروف معينة، ولكن إذا يفرط يمكن أن يسبب آثارا ضارة أو حتى قاتلة. الإفراط في الإنتاج ريوس يتم الترويج بشكل خاص من الظروف البيئية الضارة، وبالتالي البلاستيدات الخضراء ترتبط ارتباطا وثيقا الردود على الضغوط غير الحيوية، مثل الملوحة والضغط الاسموزي 2.

الفصلloroplasts لها بنية معقدة. ويحيط كل بلاستيدات الخضراء من قبل الطبقة الخارجية مزدوجة غشاء يسمى المغلف، والذي يتألف من الأغشية الداخلية والخارجية. داخليا، هناك نظام غشاء آخر يدعى ثايلاكويد، حيث ردود الفعل الخفيفة الضوئي تحدث. بين النظم غشاء اثنين وجود مكالمة مقصورة المائية سدى، التي تشارك في تثبيت الكربون. قد يحتوي على بلاستيدات الخضراء تصل الى ~ 3000 البروتينات المختلفة، ويتم تصنيعه الغالبية العظمى من هذه البروتينات في العصارة الخلوية في شكل السلائف وتحتاج إلى يمكن استيرادها إلى عضية من خلال translocons البروتين مكرسة في الأغشية المغلف 1. ومن المثير للاهتمام، وقد أشارت الأبحاث الحديثة أن بروتين بلاستيدات الخضراء استيراد وينظم بنشاط، وحتى لا يكون قادرا على ممارسة مستوى هام من السيطرة على بروتيوم بلاستيدات الخضراء. على سبيل المثال، أفيد في عام 2015 أن بروتين استيراد يمكن أن تستجيب للإجهاد اللاأحيائي من خلال التنظيم المباشر من وفرة من الالبريد translocon في الغشاء المغلف الخارجي من البلاستيدات الخضراء (TOC) من قبل النظام اليوبيكويتين-proteasome و3.

باستخدام البلاستيدات الخضراء النقاء وفي المختبر توليفها البروتينات السلائف، استيراد البروتين يمكن أن يعاد تشكيلها في المختبر 4،5. وهكذا، في المختبر أساليب يمكن استخدامها لتقييم معدلات الاستيراد في مختلف محطات متحولة 6، والتي كانت مقاربة نقدية لتحليل مكونات المفترضة لاستيراد الآلات والبروتين لاكتشاف الآليات الكامنة وراء استيراد البروتين ولائحته التنفيذية. وعلاوة على ذلك، البلاستيدات الخضراء يمكن معالجتها مع مزيد من تجزئة أو الهضم البروتيني، التالية في المختبر الاستيراد، والتي يمكن أن تسهل الدراسات على توطين شبه organellar وطوبولوجيا من البروتينات بلاستيدات الخضراء 7،8.

لدراسة تنظيم استيراد البروتين عن الإجهاد، قمنا بتعديل دينا الروتيني طريقة بلاستيدات الخضراء العزلة كما سنقوم بشرحهنا. الأهم من ذلك، تم عزل البلاستيدات الخضراء من النباتات التي قد نمت على معيار Murashige وسكوغ (MS) أجار متوسطة لمدة 8 أيام، ثم نقل إلى متوسطة MS السائل تستكمل مع الإجهاد، وتوفير ومعالجة الإجهاد قصيرة نسبيا تسيطر عليها. العائد والكفاءة من البلاستيدات الخضراء المعزولة من هذه النباتات المعالجة الإجهاد متوافقة مع المصب في البروتين المختبر استيراد فحص 3. بالإضافة إلى بروتوكول العزلة بلاستيدات الخضراء، نقدم طريقة روتينية لدينا في المختبر البروتين الاستيراد، الذي أثبت أن تكون قوية، ويستخدم على نطاق واسع 3،9-12.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. نمو النباتات نبات الأرابيدوبسيس ومعاملة الإجهاد

  1. إعداد 1 لتر من Murashige وسكوغ (MS) المتوسطة عن طريق إضافة 4.3 غرام من مرض التصلب العصبي المتعدد بصل ملح خليط، و 10 غرام السكروز، 0.5 غرام 2- (N-morpholino) الإيثان السلفونيك حمض (MES) على الماء منزوع الأيونات حتى 1 لتر، وضبط درجة الحموضة إلى 5.7 مع هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH). إضافة 6 غرام من phytoagar والأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة في 120 درجة مئوية.
    1. قبل التصلب، صب المتوسطة في لوحات بيتري مستديرة (قطر 9 سم، ارتفاع 1.5 سم، مع 20-25 مل MS المتوسطة في لوحة). السماح لوحات لتجف ل~ 1 ساعة في غطاء تدفق الصفحي قبل إغلاق الأغطية.
  2. وضع بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana في أنبوب اختبار 1.5 مل لتعقيم السطح عن طريق إضافة 1 مل من 70٪ (ت / ت) الايثانول التي تحتوي على 0.02٪ (ت / ت) تريتون X-100 وتهتز بشكل مستمر لمدة 5-10 دقائق. لكل الوراثي / حالة، وإعداد 10 لوحات بيتري يحمل كل ~ 100-150 شتلة.
  3. الانتظار لمدة 10 ثانية حتى تستقر بذور لالجزء السفلي من الأنبوب، ثم تجاهل طاف قبل pipetting. إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪، ويهز الأنبوب مرة أخرى لمدة 10 دقيقة.
  4. إعداد غطاء تدفق الصفحي في حين أن بذور وتعقيم. خذ قطعة واحدة من ورق الترشيح لكل عينة، وأضعاف ذلك في نصف لتسهيل البذر، ونقع في الإيثانول بنسبة 100٪ في غطاء محرك السيارة. انتظر حتى يجف تماما. ملاحظة يتم استخدام هذا الإيثانول بنسبة 100٪ لأنه يتبخر بسرعة أكثر من 70٪ من الإيثانول.
  5. نقل البذور على ورقة الترشيح من قبل pipetting باستخدام 1 مل ماصة قطع ~ 5 ملم من نهاية غرامة. تسمح لهم لتجف، والتي ينبغي أن يستغرق حوالي 10-15 دقيقة.
  6. زرع ~ 100-150 البذور المعقمة بالتساوي على كل لوحة MS المتوسطة بيتري، وختم كل لوحة مع الشريط الجراحية.
  7. تخزين لوحات رأسا على عقب في 4 درجة مئوية لمدة 2-4 د لتشجيع ومزامنة الإنبات. قد تحتاج البذور القديمة البقاء لفترة أطول (تصل إلى أسبوع) في 4 درجات مئوية.
  8. نقل لوحات لغرفة زراعة الأنسجة النباتية وترك لهم رأسا على عقب فوق.زراعة النباتات لمدة 8 د في ظل دورة يوم طويل (16 ساعة 100 مكرومول · م - 2 · ق - 1 ضوء، 8 ساعات الظلام) عند 20 درجة مئوية.
  9. لعلاج الإجهاد، وعندما النباتات هي 8 د القديمة، في غطاء تدفق، نقلها من وسيلة أجار، عن طريق كشط بلطف أجبرتها على الفرار باليد ارتداء القفازات المعقمة الإيثانول، في قارورة معقمة متوسطة MS السائل الذي يحتوي على الإجهاد (على سبيل المثال ، 200 ملي مانيتول). تجنب تحمل اكثر المتوسطة أجار. تغطية الفم قارورة برقائق تعقيمها والسماح للنباتات أن تنمو في ظل نفس الظروف كما في الخطوة 1.8 ل2 د إضافي على شاكر المداري مع اهتزاز لطيف (~ 100 دورة في الدقيقة).

2. صنع بروتين السلائف من النسخ في المختبر / الترجمة

ملاحظة: هذا البروتوكول يفترض استخدام نبات الأرابيدوبسيس الضوئي الأول فرعية D السلائف (pPsaD) كقالب / preprotein، ولكن الأسلوب هو متوافق مع الآخرين.

  1. استنساخ تسلسل الترميز (CDS) من pPsaD في موقع استنساخ متعددة (MCS) من ناقلات pBlueScript الثاني SK (أو أي ناقل آخر مماثل مع المروج T7 المنبع) 13. تنقية البلازميد (pBSK-pPsaD) باستخدام عدة عزل الحمض النووي والتحقق من تسلسل تسلسل الحمض النووي.
    ملاحظة: كل هذه الخطوات تستخدم تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية.
  2. تحديد pBSK-pPsaD تركيز الحمض النووي البلازميد باستخدام معمل المقرر أن قياس الامتصاصية في 260 نانومتر. تمييع البلازميد إلى تركيز النهائي من 10 نانوغرام / ميكرولتر.
  3. تشغيل 20 ميكرولتر PCR (لمدة 35 دورات) باستخدام البلازميد المخفف كقالب. إعداد رد فعل على النحو التالي: 2 ميكرولتر 10 العازلة × البلمرة، 2 ميكرولتر 2 مم dNTPs، 1 ميكرولتر 5 ملم M13 إلى الأمام التمهيدي (5'-TGT AAA ACG ACG دول مجلس التعاون الخليجي AGT-3)، 1 ميكرولتر 5 ملم M13 التمهيدي العكسي (5 "-CAG غا ACA GCT ATG ACC-3)، المخفف 1 ميكرولتر pBSK-pPsaD البلازميد، 1 يو طق البلمرة، والماء المقطر لجعل حجم رد الفعل الكلي يصل إلى20 ميكرولتر. استخدام برنامج PCR القياسية، على النحو التالي: 95 درجة مئوية، 5 دقائق. 35 دورات [95 درجة مئوية، 30 ثانية؛ 56 ° C، 30 ثانية؛ 72 ° C، 30 ثانية). و 72 درجة مئوية، 5 دقائق.
  4. تشغيل 5 ميكرولتر من الناتج PCR على 1٪ (ث / ت) هلام الاغاروز في المخزن تاي (تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6، 20 ملم حمض الخليك، 1 ملم EDTA) للتحقق من التضخيم الصحيح للكدنا]، وتحديد صلة الفرقة نسبة إلى المعايير لتأكيد التركيز. تخزين ما تبقى من المنتج عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمزيد من التطبيقات.
  5. إعداد رد فعل 50 ميكرولتر باستخدام مقرها النسخ / نظام الترجمة خالية من الخلايا أرنب الخلايا الشبكية المحللة متوافق مع PCR الحمض النووي، على النحو التالي: 40 ميكرولتر المحللة الخلايا الشبكية من نظام النسخ / الترجمة، 2.5 ميكرولتر رديولبلد [35 S] ميثيونين، 11 μCi / مل (نشاط معين:> 1000 تسى / ملمول)، الماء المقطر 2.5 ميكرولتر العقيمة، و 5 المنتج ميكرولتر pPsaD PCR (100-800 نانوغرام).
    الحذر: ارتداء القفازات والملابس المختبرات والزجاج سلامةإس إي إس عند التعامل مع المواد المشعة. رصد وتطهير سطح العمل والمعدات. تخلص من جميع النفايات المشعة في حاوية النفايات المعتمدة.
  6. احتضان رد فعل لمدة 90 دقيقة في 30 ° C حمام الماء. وقف رد فعل عن طريق وضع عينة على الجليد.
  7. إزالة 1 ميكرولتر من رد فعل كعينة اختبار (نفس الحجم يمكن أن تكون أيضا بمثابة مراقبة المدخلات للخطوة 5.7) للتحقق على معيار الصوديوم دوديسيل هلام كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE)، يليه تصوير الإشعاع الذاتي، تصوير تألقي أو التصوير الفوسفور. يشار إلى نتيجة جيدة من خلال مراقبة الفرقة متميزة وقوية الموافق الوزن الجزيئي للpPsaD (~ 23 دينار كويتي). تخزين ما تبقى من رد الفعل عند -80 درجة مئوية لمزيد من التطبيقات.

3. عزل بلاستيدات الخضراء

  1. إعداد الحلول الأوراق المالية التالية:
    1. إعداد عزل بلاستيدات الخضراء العازلة (CIB، 2X): 0.6 M السوربيتول، كلوريد المغنيسيوم 10 ملي(MgCl 2)، 10 ملي جلايكول الإثيلين Tetraacetic حمض (EGTA)، 10 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، 20 ملي بيكربونات الصوديوم (NaHCO 3)، 40 مم 4- (2-هيدروكسي) بيبيرازين-1-ethanesulfonic حمض (HEPES) . ضبط لدرجة الحموضة 8.0 مع KOH. إعداد 2 لتر من 2X البنك التجاري الدولي، وجعل قسامات والاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل، أو عند 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير. لجعل 1X البنك التجاري الدولي، يخفف من 2X البنك التجاري الدولي 1: 1 مع الماء المقطر. هذا يمكن الطازجة في اليوم من تجربة العزلة بلاستيدات الخضراء.
    2. إعداد HEPES-MgSO 4 -Sorbitol عازلة (اتش ام اس، 1X): 50 مم HEPES، 3 ملي كبريتات المغنيسيوم (MgSO 4)، 0.3 M السوربيتول. ضبط لدرجة الحموضة 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم). إعداد 400 مل من العازلة، وجعل قسامات والاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل، أو عند 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير.
  2. إجراء كافة الإجراءات التالية في غرفة باردة أو على الجليد. Precool كل الحلول والأجهزة والمعدات، والدوارات قبل الحاديarting.
  3. إعداد التدرج المستمر كثافة عن طريق خلط 13 مل Percoll، 13 مل 2X البنك التجاري الدولي العازلة، و 5 الجلوتاثيون ملغ في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، والطرد المركزي الخليط في 43000 × ز لمدة 30 دقيقة (الفرامل إيقاف) في 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، والتعامل مع أنبوب مع الحرص على تجنب إزعاج التدرج وابقائه على الجليد لاستخدامها لاحقا.
  4. نقل 100 مل من 1X البنك التجاري الدولي في التركيب الوراثي / حالة إلى دورق 1 لتر.
    1. إزالة الشتلات من الوسط السائل عن طريق البقشيش لهم في غربال، ونقلها إلى كوب آخر التي تحتوي على البنك التجاري الدولي. ثم، وشطف الأنسجة مع البنك التجاري الدولي لإزالة أي وسيط السائل المتبقي قبل استبدالها مع 100 مل من البنك التجاري الدولي CIB جديدة.
  5. لالتجانس، استخدم ما مجموعه 100 مل من 1X البنك التجاري الدولي في العينة في خمس جولات متتالية من التجانس، كل جولة باستخدام 20 مل من البنك التجاري الدولي الطازج الذي عقد في دورق سعة 50 مل.
    1. للجولة الأولى من التجانس، ونقل الأنسجة النباتية في دورق سعة 50 باليد، والسماح للعازلة عقد السابق لاستنزاف من خلال أصابعك. محاولة استخدام معظم الأنسجة في الجولة الأولى، ولكن تأكد من غمرها مع العازلة؛ إذا لم يكن ذلك ممكنا، ويعرض الأنسجة غير المستخدمة المتبقية في الجولة الثانية.
  6. وضع التحقيق في الخالط الأنسجة إلى الأنسجة والتجانس مع اثنين من البقول من 1 - 2 ثانية لكل منهما. تصفية جناسة من خلال طبقتين من القماش الترشيح في أنبوب الطرد المركزي مل 250 من الضغط لطيف. الإبقاء على الترشيح، ونقل الأنسجة إلى دورق سعة 50.
  7. ضع الثانية 20 مل البنك التجاري الدولي قسامة في دورق سعة 50، مشيرا الى أي نوع من الأنسجة المتبقية لم تستخدم في الجولة الأولى من التجانس، وتكرار التجانس والترشيح الخطوات. وبالتالي، كرر الخطوات من 3.5 و 3.6 حتى كل من تم استخدام 100 مل من البنك التجاري الدولي يصل (أي 5 aliquots من 20 مل)، والجمع بين الرواشح الناتجة عن ذلك.
  8. الطرد المركزي جناسة المجمعة في 1000 × ز لمدة 5 دقائق (الفرامل على) في 4 درجات مئوية، وتصب قبالةطاف مباشرة بعد الانتهاء من الطرد المركزي، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. Resuspend وبيليه في طاف المتبقية في أنبوب من خلال استثارة بلطف أنبوب على الجليد. لا و ​​resuspend بقوة من قبل pipetting أو vortexing ل.
  9. نقل بلطف جناسة على أعلى ج ابحث التدرج الكثافة المستمر، وذلك باستخدام ماصة باستور لتطبيقه من خلال جدار الأنبوب المتلقي. تجنب إزعاج التدرج. أجهزة الطرد المركزي في دوار يتأرجح دلو في 7800 × ز لمدة 10 دقيقة (الفرامل إيقاف) في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن رؤية اثنين من العصابات الخضراء في الانحدار بعد الطرد المركزي: الفرقة أقل تحتوي على البلاستيدات الخضراء سليمة، والشريط العلوي يحتوي على البلاستيدات الخضراء مكسورة.
  10. تجاهل الشريط العلوي من قبل pipetting، ومن ثم نقل الشريط السفلي مع ماصة باستير إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي العذبة، والإبقاء على حجم ما يصل إلى 8 مل في التدرج.
  11. إضافة ~ 25 مل من 1X HMS العازلة في أنبوب وعكس الأنبوب مرتين رس غسل Percoll من البلاستيدات الخضراء. وضع أنبوب مرة أخرى في الدوار يتأرجح دلو وأجهزة الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 5 دقائق (الفرامل على) في 4 درجات مئوية.
  12. تخلصي من طاف و resuspend بدقة بيليه بلاستيدات الخضراء في HMS المتبقية في أنبوب من خلال استثارة بلطف أنبوب على الجليد. إضافة إضافية 100-300 ميكرولتر من HMS إذا لزم الأمر (هذه البيانات تعتمد على حجم الكرية والعد والفرز في القسم 4)، ولكن ليس محاولة لتخفيف العينة كثيرا.
    1. الحفاظ على البلاستيدات الخضراء على الجليد. في كل مرة قبل أن يتم استخدام البلاستيدات الخضراء لتطبيقات المصب، يهز أنبوب ل resuspend لهم. دائما استخدام تلميح قطع ماصة (مع المسام الموسع) لنقل البلاستيدات الخضراء.

4. تحليل العائد وIntactness من البلاستيدات الخضراء

  1. إضافة 5 ميكرولتر من البلاستيدات الخضراء المعزولة إلى 495 ميكرولتر من العازلة 1X HMS في أنبوب 1.5 مل، وبعد ذلك المزيج بلطف عكس أنبوب للحصول على التخفيف 1: 100.
  2. جيش التحرير الشعبى الصينىCE غطاء زجاجي على أعلى من غرفة عد عداد خلايا الدم. ببطء ماصة ~ 40 - 60 ميكرولتر من تعليق بلاستيدات الخضراء المخفف في الفجوة بين الغطاء الزجاجي وغرفة الفرز. باستخدام المجهر على النقيض من المرحلة مع الهدف 10X أو 20X، البلاستيدات الخضراء سليمة تبدو مستديرة ومشرقة وتحيط بها هالة من الضوء.
    ملاحظة: تحت المجهر، وهناك منطقة العد 1 مم 2 مع 25 الساحات الكبيرة، تحتوي كل منها على 16 مربعات صغيرة في وسط الغرفة العد.
  3. حساب عدد من البلاستيدات الخضراء في 10 الساحات الكبيرة. يجب أن متوسط ​​عدد البلاستيدات الخضراء في ساحة واسعة بين 10 و 30. إذا قليلة جدا أو كثيرة جدا البلاستيدات الخضراء موجودة، وضبط عامل التخفيف (الخطوة 4.1 أعلاه) وفقا لذلك، وتكرار هذه العملية.
  4. حساب عدد من البلاستيدات الخضراء لكل مليلتر (التركيز) على النحو التالي: ن (متوسط ​​عدد البلاستيدات الخضراء في ساحة كبيرة تحسب في الخطوة 4.3) × 25 (عدد المربعات كبيرة) × 100 (عامل تمييع) × 10 4 (عامل التحجيم للتعبير عن البيانات لكل 1 مل، لأن حجم فوق 25 الساحات هو 0.1 ملم 3).
  5. حساب العائد الفعلي من البلاستيدات الخضراء بضرب التركيز على حجم تعليق بلاستيدات الخضراء التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.12. عادة، يمكن الحصول على أكثر من 50 × 10 6 البلاستيدات الخضراء.

5. استيراد البروتين الجبيلة اليخضور

  1. إعداد الحلول الأوراق المالية التالية:
    1. إعداد 10X HMS عازلة: 500 ملي HEPES 30 ملي MgSO 4 و 3.0 M السوربيتول. ضبط لدرجة الحموضة 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم. تجهيز 50 مل من هذا المخزن المؤقت، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل وعند 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير.
    2. إعداد استيراد توقف المخزن المؤقت: 50 ملي EDTA الذائبة في المخزن 1X HMS. تجهيز 50 مل من هذا المخزن المؤقت، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    3. إعداد 2X العازلة البروتين التحميل: 60 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 10٪ (ت / ت) الجلسرين، 2٪ (ث/ V) SDS، 0.005٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق. جعل 50 مل، وتخزينها في 4 درجات مئوية. فقط قبل الاستخدام، إضافة 100 ميكرولتر من 1 M 1،4-dithiothreitol (DTT) إلى 900 ميكرولتر من العازلة.
  2. لتشغيل الوقت طبعا مع 3 نقاط الوقت، وإعداد 3 أنابيب تحتوي كل منها على قسامة 130 ميكرولتر من العازلة وقف الاستيراد، وترك لهم على الجليد. إعداد رد فعل استيراد 450 ميكرولتر في أنبوب مل 2 (في التركيب الوراثي / حالة). ذوبان الجليد كل المكونات فقط قبل استخدامها.
    1. رد فعل استيراد واحد، وعادة ما تستخدم 10 × 10 6 البلاستيدات الخضراء في وحدة تخزين ميكرولتر. على سبيل المثال، إذا كان تركيز بلاستيدات الخضراء هو 2.5 × 10 8 / مل، واستخدام 40 ميكرولتر تعليق بلاستيدات الخضراء. سوف تحتاج ثلاث نقاط الساعة 3 × ميكرولتر (أي 120 ميكرولتر في مثالنا).
    2. خلط المكونات ردود الفعل على الجليد في الترتيب التالي: الماء المقطر (لجعل إجمالي حجم 600 ميكرولتر)، B ميكرولتر 10X HMS عازلة (حيث ب = [600-3 × A] / 10، أي 48 في مثالنا)، 12 ميكرولتر1 M الغلوكونيك حمض (ملح البوتاسيوم)، 6 ميكرولتر 1 M NaHCO 3، 6 ميكرولتر 20٪ (ث / ت) BSA، 30 ميكرولتر 100 ملم أدينوسين ثلاثي الفوسفات 5'-ملح المغنيسيوم (MgATP)، 24 ميكرولتر 250 ملم ميثيونين (لا رديولبلد )، و 30 ميكرولتر السلائف البروتين. مباشرة قبل البدء في رد فعل على الواردات، إضافة 3 × ميكرولتر من البلاستيدات الخضراء ومزيج من خلال استغلال بلطف الأنبوب.
  3. احتضان الأنبوب رد فعل عند 25 درجة مئوية في حمام مائي تحت 100 مكرومول · م - 2 · ق - 1 الضوء. في بعض الأحيان نفض الغبار الأنابيب ل resuspend البلاستيدات الخضراء.
  4. لإجراء الوقت طبعا، سحب 130 مكل من ردود فعل في الوقت نقاط المطلوبة ضمن مجموعة خطية من الواردات، والتي لpPsaD متروك ~ 12 دقيقة (4-، 8- و12-مين نقاط زمنية مناسبة في هذه الحالة). الفترة مجموعة خطية يمكن أن تختلف عن البروتينات المختلفة 14. وبالتالي، يقترح لاختبار كل preprotein الفرد أمام لتحسين رانه نقطة زمنية.
  5. فور الانسحاب، ونقل كل قسامة 130 ميكرولتر إلى أنبوب الاستيراد عازلة توقف الجليد الباردة، مزيج من خلال استغلال بلطف الأنبوب، والإبقاء على جميع الأنابيب على الجليد حتى يتم الانتهاء من مراحل الزمن.
  6. الطرد المركزي جميع العينات لمدة 30 ثانية في 12000 × ز في microfuge، تجاهل supernatants من قبل pipetting، والكريات resuspend في 15 ميكرولتر من 2X العازلة البروتين تحميل من قبل vortexing.
  7. تحليل جميع العينات بالإضافة إلى مراقبة المدخلات pPsaD (التي تحتوي على pPsaD أي ما يعادل 10٪ من المبلغ يضاف إلى كل رد فعل الاستيراد، من الخطوة 2.7) من قبل ستاندرد SDS-PAGE وتصوير الإشعاع الذاتي، تصوير تألقي أو التصوير الفوسفور 15. استخدام صورة برامج التحليل لتحديد وتحليل النتائج. لتوفير مؤشرا على كفاءة الاستيراد وكمية البروتين المستوردة في المورثات مختلفة / الشروط يمكن تقييم من خلال قياس النشاط الإشعاعي المرتبطة بكل الفرقة ناضجة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد مثال البروتين بلاستيدات الخضراء تجربة الاستيراد مع 3 نقاط الوقت في الشكل 1. PsaD هو عنصر ~ 18 دينار كويتي في النظام الضوئي الأول يتعرض للسدى، مع شكل مقدمة من ~ 23 دينار كويتي 16. وقد تم اختيار PsaD هنا لفي المختبر البروتين فحص الواردات بسبب ارتفاع مستويات ثابتة للدولة في متحولة SP1، نسبة إلى WT، تحت ظروف الإجهاد، مما يشير إلى تغيير في كفاءة وارداتها في متحولة 3. متحولة SP1 يحمل خلل في منظم مهم من بلاستيدات الخضراء آلية البروتين استيراد - البروتين SP1 3. لالبلاستيدات الخضراء المعزولة من النباتات التي تزرع تحت الظروف العادية، لم يكن هناك اختلاف واضح في مجال الاستيراد PsaD بين SP1 و WT (لا تظهر البيانات) 3. ومع ذلك، باستخدام الأساليب المذكورة هنا لتقييم PsaD استيراد في البلاستيدات الخضراء المعزولة من osmoticallyالنباتات وشدد، تم الكشف عن فرق واضح. في حين لاحظنا تراكم شكل البروتين ناضجة بطريقة تعتمد على الوقت مع كل من المورثات، كان معدل الاستيراد أقل بكثير عن البلاستيدات الخضراء WT من لالبلاستيدات الخضراء SP1 (الشكل 1)، وهو ما يتسق مع النتائج السابقة لدينا 3، ويكشف دورا هاما للبروتين SP1 في تنظيم استيراد بلاستيدات الخضراء من PsaD تحت ظروف الإجهاد.

figure-results-1
الشكل 1. البروتين استيراد الفحص التي أجريت باستخدام البلاستيدات الخضراء المعزولة من النباتات التي تزرع تحت ظروف الإجهاد تنافذي. تم عزل البلاستيدات الخضراء من WT البالغ من العمر 10 يوما (كو-0) والنباتات نبات الأرابيدوبسيس SP1 متحولة نمت تحت ظروف الإجهاد (200 ملي مانيتول) لمدة 2 د. وقد أجريت استيراد (أ) البروتين باستخدام [35 S] -metpPsaD وسمح له بالاستمرار لمدة 4 و 8 و 12 دقيقة قبل تحليل بواسطة SDS-PAGE والتصوير الفوسفور المسمى hionine. تم تحليلها في موازاة ذلك، 10٪ مراقبة المدخلات pPsaD تضم في المختبر ترجمة بروتين (IVT). مقدمة (قبل) وناضجة (حصيرة) يشار إلى أشكال pPsaD، في حين بين أن هناك اثنين من العصابات التي تتوافق المرجح أن منتجات الترجمة مبتورة أو بروتين محلل بسبب كثافتها لم تتغير خلال الزمن (*). (ب) لمقارنة معدلات الاستيراد في البلاستيدات الخضراء من النباتات WT و SP1 نمت في ظل ظروف عصيبة، وكان كميا كثافة كل فرقة الموافق البروتين ناضجة المستوردة في A. يتم التعبير عن جميع البيانات كنسبة مئوية من كمية البروتين المستوردة في البلاستيدات الخضراء من النباتات WT بعد 12 دقيقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأظهرت لنا مؤخرا أن بلاستيدات الخضراء استيراد البروتين يمكن تنظيم بنشاط عن الإجهاد، وهو أمر حاسم لوظيفة بلاستيدات الخضراء والنباتات البقاء على قيد الحياة 3. في هذه الدراسة، لرصد مثل هذا التنظيم، علينا تعديل عزلتنا بلاستيدات الخضراء وفي إجراءات فحص واردات المختبر من أجل تمكين تقييم القدرة على الاستيراد من النباتات التي تزرع تحت ظروف الإجهاد. أشارت النتائج دورا هاما لSP1 في بلاستيدات الخضراء تنظيم بروتين الاستيراد.

التقليدية في المختبر فحوصات استيراد استخدام النباتات التي تزرع على MS القياسية أجار المتوسطة 6،17،18. في حالة متحولة SP1 الموصوفة هنا، لم هذه المقايسات التقليدية لا تكشف عن أي اختلافات في البروتين استيراد نسبة إلى WT 3. ومع ذلك، تبين دور SP1 في تنظيم استيراد البروتين بشكل واضح عندما يتم تقييم استيراد البروتين تحت ظروف الإجهاد باستخدام الأساليب المذكورة هنا (الشكل 1). في حين أنه معبد المنعم يوسف لا يكون من الممكن مقارنة مباشرة استيراد البيانات من فحص ظروف الإجهاد مع تلك التي تم الحصول عليها من المقايسات التقليدية (مثل أساليب تستخدم النباتات التي تزرع في ثقافة السائل وعلى وسط أجار، على التوالي)، مقارنات بين ظروف الإجهاد وعدم الإجهاد ممكنة شريطة أن تزرع النباتات كلها في نفس مستنبت السائل، مع أو من دون ضغوطات.

مقارنة مع علاج الضغط على وسط أجار، ثقافة السائل هو أكثر ملاءمة لعلاج أعداد كبيرة من النباتات اللازمة لفحوصات في المختبر الاستيراد. وعلاوة على ذلك، فإنه يسهل التطبيق الموحد للالضغوطات لجميع النباتات، وهو أمر مهم بشكل خاص لعلاج الإجهاد على المدى القصير. وقد تم تطبيق الطريقة المعروضة هنا لدراسة الضغط الاسموزي باستخدام العلاج مانيتول، ولكن يمكن بسهولة أن تتكيف مع مجموعة واسعة من الضغوط الأخرى؛ على سبيل المثال، الإجهاد الملحي على المدى القصير والاكسدة، التي الضغوطات المقابلة يمكن به تطبق بالمثل عبر المتوسط ​​MS السائل. لأنواع أخرى من الضغوط، فإننا نقترح على درجة من الإجهاد هو الأمثل لأول مرة. مفرط قد يكون العلاج شديدة آثار سلبية على المحصول و / أو الكفاءة الواردات من العضيات معزولة.

هناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول الذي ينبغي للمرء أن تولي اهتماما خاصا، كما هو موضح أدناه.

تركيز أجار الأمثل على المدى المتوسط ​​MS يمكن أن تختلف (0،6-0،9٪، ث / ت) اعتمادا على الشركة المصنعة. وبالتالي، فمن المستحسن أن تجريبيا تحسين تركيز أجار قبل بدء التجارب. لا ينبغي أن يكون وسيلة لينة بحيث تلتزم الأنسجة في خطوة حصاد (الخطوة 1.9)، لا ينبغي أن يكون من الصعب جدا أن يوقف نمو جذور النباتات. ويمكن أيضا أن تركيز السكروز تعديلها وفقا للنباتات المستخدمة. عند العمل مع المسوخ المرضى بشكل خاص، MS المتوسطة تستكمل مع 2-3٪ (ث / ت) السكروز قد تساعد النباتات على النمو بشكل أفضل. عندما التطبيقالكذب العلاجات الإجهاد، وأنها ليست جيدة لنقل المصانع القديمة جدا من الوسط السائل (على سبيل المثال،> 14 يوما). وذلك لأن جذور الأكثر تقدما من أقدم النباتات التي تضررت أكثر سهولة أثناء بالتحويل.

وفيما يتعلق بنظام النسخ / الترجمة، وهناك 2 النظم الرئيسية: تلك التي تقوم على جرثومة القمح، وتلك القائمة على الخلايا الشبكية أرنب. قد تستخدم هذه المجموعات قوالب مختلفة، مثل البلازميدات خطي، البلازميدات unlinearized، أو المنتجات PCR. مجموعات هي أيضا محددة لالمروجين T3، T7، وSP6. لاحظ أن عدة نوصي هنا لا يصلح إلا للاستخدام مع منتجات PCR والمروج T7. ومع ذلك، لأسباب غير معروفة، وبعض preproteins رديولبلد المصنوع من هذا النظام قد لا تعمل بكفاءة في فحص الواردات. في مثل هذه الحالات، يمكن للمرء النظر في محاولة لجرثومة القمح استخراج النظام أو نظام الخلايا الشبكية المحللة يعني لقوالب البلازميد. يمكن للمرء أيضا تحسين النتيجة من النسخ / ترجمة إعادةالعمل عن طريق تعديل ظروف التفاعل وفقا لكتيب الشركة المصنعة.

من المهم أن تبدأ العزلة بلاستيدات الخضراء في وقت مبكر من صباح اليوم (أو في دورة الخفيفة من الغرفة النمو في وقت مبكر) وذلك لتجنب تراكم النشا داخل البلاستيدات الخضراء نظرا لعملية التمثيل الضوئي، التي يمكن أن تعيق عزل عضيات سليمة. الإجراء بلاستيدات الخضراء العزلة الذي ينبغي القيام به بسرعة دون أي تأخير لا لزوم لها، ويجب أن تبقى في البلاستيدات الخضراء المعزولة دائما الباردة. هذا هو التخفيف من ملاحظة أن عزل البلاستيدات الخضراء سوف تفقد تدريجيا قدرتها على الاستمرار، وهي ليست جيدة. في حالة استخدام CIB إذابة حديثا أو عازلة HMS، تأكد من خلط عازلة جيدا قبل الاستعمال للحصول على حل متجانسة. وقد وضعت الظروف المثلى لتجانس المواد النباتية تجريبيا، ويمكن أن تختلف إذا تم استخدام الخالط الأنسجة المختلفة.

إذا كانت الأنماط الوراثية النباتية المختلفة تحتوي متشابهةمستويات الكلوروفيل ص، الكلوروفيل الكمي يمكن استخدام وسيلة بديلة لتطبيع عينات قبل إجراء فحوصات الاستيراد. يمكن تحديد الكلوروفيل طيفيا التالية استخراج عينة من البلاستيدات الخضراء المعزولة في 80٪ (ت / ت) الأسيتون مائي 19،20. ومع ذلك، إذا معدلات استيراد النباتات تظهر محتويات الكلوروفيل مختلفة (على سبيل المثال، المسوخ مع الظواهر داء الاخضرار) وينبغي مقارنة، استخدام عدد بلاستيدات الخضراء عد إلى تطبيع عينات بلاستيدات الخضراء في المقايسات الاستيراد. ومن الأهمية بمكان resuspend والبلاستيدات الخضراء تماما في خطوة 3.11. إعادة تعليق غير كاف قد ترك مجاميع من البلاستيدات الخضراء، الأمر الذي سيجعل من الصعب إحصاء عدد بدقة، وبالتالي سوف تعيق التحميل الصحيح في ردود الفعل الاستيراد. إذا كان ينظر تجميع شديد تحت المجهر (على سبيل المثال، يجمع مع> 10 بلاستيدات الخضراء انضمت معا)، لا تزال تهز عينة بلاستيدات الخضراء على الجليد حتى aggregatتتم إزالة العناوين. فمن السهل أن resuspend والبلاستيدات الخضراء في حجم أصغر من العازلة.

من المهم أن ندرك أن ردود الفعل البروتين استيراد (القسم 5) يجب أن تتم مع الاحتياطات المناسبة لطبيعتها المشعة. وتشمل الاحتياطات اللازمة: ارتداء القفازات القابل للتصرف، الملابس المخبرية والنظارات الواقية والرصد وتطهير سطح العمل والمعدات، والتخلص من جميع النفايات المشعة في حاوية النفايات المعتمدة. كما نضع في اعتبارنا أن الضغط الاسموزي الصحيح أمر بالغ الأهمية للحفاظ على intactness من البلاستيدات الخضراء خلال ردود الفعل الاستيراد، وهذا يتم الاحتفاظ بصورة رئيسية من قبل المخزن المؤقت HMS. لأن 10X HMS هي لزجة، فإنه ينبغي أولا أن تكون درجة حرارة تصل إلى RT، ثم يخلط جيدا، وتطبيقها باستخدام قطع ماصة لضمان قياس كميات دقيقة. في رد فعل على الواردات، إضافة الميثيونين البارد لتحول دون إدماج ميثيونين رديولبلد مجانا إلى chloropl لا علاقة لهاالبروتينات AST عن طريق الترجمة organellar خلال الخطوة الحضانة، في حين يتم استخدام جيش صرب البوسنة للحد من التحلل البروتيني من خلال العمل باعتبارها الركيزة لالبروتياز.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من خلال منحة لPJ من التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC، منح المرجع BB / K018442 / 1).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Murashige و Skoog الملح القاعدي ميلفوردM0221
phytoagarميلفوردP1003
2- (N-مورفولينو) حمض السلفونيك الإيثان (MES)ميلفوردB2002
تريتون X-100فيشرBPE151-500
شريط جراحي ( على سبيل المثال < / م > ، Micropore ، 3M)3M1530-1
ورق ترشيحفيشرFB59023
بيركولفيشر10607095
حمض الإيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك (EGTA)سيجماE4378
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) فيشرD / 0700/53
4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-حمض الإيثان سلفونيك (HEPES) قماشترشيح ميلفوردB2001
(Miracloth)كالبيوكيم475855
أنبوب الطرد المركزي سعة 50 ملفيشرCFT-595-040M
زجاجة طرد مركزي سعة 250 ملفيشرCFT-891-V
Polytron (e.g.< / em> ، Kinematica PT10-35)فيشر11010070
بوليترون (<م > على سبيل المثال < / م > ، Kinematica PTA20S)فيشر11030083
جهاز طرد مركزي (e.g.< / em> ، Beckman Coulter Avanti JXN-26 ، لأنابيب 50 و 250 مل)Beckman CoulterB34182
دوار بزاوية ثابتة ل 250   ؛ زجاجات مل (e.g.< / em> ، JLA-16.250) BeckmanCoulter363930
دوار بزاوية ثابتة ل 50 & nbsp ؛ أنابيب مل ( على سبيل المثال < / em> ، JA-25.50)Beckman Coulter363058
دوار دلو متأرجح لأنابيب 50 مل ( على سبيل المثال < / em> ، JS-13.1) بيكمانكولتر346963
مسمى إشعاعي [35< / sup>S] الميثيونينPerkin ElmerNEG072002MC
نظام الترجمة الخالي من الخلايا القائم على محلل الخلايا الشبكية للأرانب (مجموعة TNT T7 السريعة للحمض النووي PCR)مجهر تباين الطور PromegaL5540
(على سبيل المثال< / em> ، نيكون Eclipse 80i)غير متوفرمن نيكون
(غرفة Neubauer BS748 المحسنة)Hawksley TechnologyAC10000.1 مم عمق ، 1/400 مم 2< sup>
غطاء نظاراتVWR16004-09422 مم & مرات ؛ 22 مم ، سمك 0.13-0.17 مم
1.5 مل أنابيب الطيفSarstedt72.690.001
2 مل أنابيب الطيف الدقيقStarlabS1620-2700
microfuge (على سبيل المثال < / em> ، Eppendorf 5415D)Eppendorfغير متوفر
Nanodrop 2000 مقياس الطيف الضوئي أو حمض الجلوكونيكالمماثل Thermo FisherSPR-700-310L
(ملح البوتاسيوم)فيشر22932-2500
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجماA7906
MgATPسيجماA9187
ميثيونينسيجماM6039
بروموفينول أزرقفيشرB / P620 / 44
جلسرينفيشرG / 0650/17
SDSفيشرS / 5200/53
تريس بیس   ؛برنامج تحليل الصور MelfordB2005
dithiothreitol (DTT)برنامج تحليل الصور MelfordMB1015
(e.g.< / em> ، محلل الصور Aida)Raytestغير متاح
مسبار مقياس الدم الدقيق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses. Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).
  3. Ling, Q., Jarvis, P. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants. Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).
  4. Chua, N. H., Schmidt, G. W. In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits. Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).
  5. Highfield, P. E., Ellis, R. J. Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase. Nature. 271, 420-424 (1978).
  6. Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).
  7. Froehlich, J. Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases. Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).
  8. Flores-Pérez, Ú, Jarvis, P. Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts. Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).
  9. Kubis, S., et al. The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins. Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).
  10. Kubis, S., et al. Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors. Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).
  11. Aronsson, H., et al. Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency. Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).
  12. Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane. Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  14. Aronsson, H., et al. Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves. Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).
  15. Aronsson, H., Jarvis, R. P. Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays. Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).
  16. Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma. J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).
  17. Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants. Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).
  18. Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts. Plant Cell. 14, 641-654 (2002).
  19. Miras, S., et al. Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast. J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).
  20. Nada, A., Soll, J. Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway. J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS PAGE

مقالات ذات صلة