Method Article

الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات

DOI:

10.3791/54719

⸱

November 17th, 2016

 ,  , 
1Department of Biology, York University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الورقة القياس الكمي لمقياس الدم والصور المجهرية للهجرة / الغزو من خلال اثنين من المكونات الإضافية الجديدة مفتوحة المصدر ImageJ حاسبة تركيز الخلية وعداد مقايسة الهجرة. علاوة على ذلك ، فإنه يصف بروتوكولات الحصول على الصور ومعايرتها بالإضافة إلى مناقشة متطلبات إدخال المكونات الإضافية بالتفصيل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعهد الوطني لليماغيج الصحة هي قوية ومتاحة بحرية برمجيات معالجة الصور. يماغيج ديه خوارزميات شاملة تحليل الجزيئات التي يمكن استخدامها بشكل فعال لحساب الجزيئات البيولوجية المختلفة. عندما عد أعداد كبيرة من عينات من الخلايا، تقدم عدادة الكريات عنق الزجاجة بالنسبة لآخر. وبالمثل، عد الأغشية من المقايسات الهجرة / الغزو مع عداد خلية يماغيج المساعد، وإن كانت صحيحة، هو عمل استثنائي مكثفة، ذاتية، واشتهر عن التسبب في آلام الرسغ. لتلبية هذه الحاجة، قمنا بتطوير اثنين من الإضافات ضمن يماغيج للقيام بهذه المهمة الوحيدة للعدادة الكريات الآلي (أو حجم معروفة) وعد الخلايا الهجرة / الغزو. كل من الإضافات تعتمد على القدرة على اكتساب الميكروسكوب عالية الجودة مع الحد الأدنى من الخلفية. فهي سهلة الاستخدام والأمثل لفرز سريع وتحليل عينات كبيرة الحجم مع أدوات التحليل المدمج للمساعدة في معايرة التهم الموجهة إليه. من خلال الجمع بين المبدأ الأساسيالصورة من عداد الخليوي مع خوارزمية الفرز والعد بعد التحليل الآلي، وهذا يزيد كثيرا من السهولة التي المقايسات الهجرة يمكن ان يتم بدون أي خسارة من الدقة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في عد الخلايا في المختبر هو أسلوب الأساسية الهامة في مجموعة واسعة من تجارب زراعة الأنسجة. تحديد بدقة عدد الخلايا في الثقافة أمر ضروري لاستنساخ التجارب وتوحيد 1،2. عد الخلايا يمكن القيام بها يدويا باستخدام عدادة الكريات فضلا عن استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب الآلية، ولكل منها مزاياه وعيوبه 3،4،5. معظم الطرق الآلية للعد الخلايا تنتمي إلى واحدة من فئتين، تلك التي تستخدم مبدأ كولتر أو التدفق الخلوي. عدادات كولتر الاستفادة من خلايا المقاومة الكهربائية لتحديد عدد الخلايا والحجم. فهي سريعة ودقيقة وأرخص من أجهزة قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك، نادرا ما يتم استخدامها لعد الخلايا الوحيد نظرا لتكلفت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجهر 1. مجمع وإعداد الكاميرا (خلية تركيز حاسبة)

  1. زيادة سطوع المصباح إلى كامل مع مقبض تعديل ضوء، والتحول إلى عدسة الهدف 4X، وضمان ويتم اختيار المرشحات النقيض من المرحلة.
    ملاحظة: أي مقلوب المرحلة المجهر النقيض لزراعة الأنسجة مع خلفية مظلمة، على سبيل المثال، فب مرحلة النقيض من ذلك، يمكن استخدامها وفقا للإجراءات المجهر والكاميرا القياسية.
  2. ضمن البرامج المجهر، تعيين إعدادات التقاط الصور إلى القيم الافتراضية.
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم المجهر للعثور على موقع هذه ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركيز خلية حاسبة

ويبين الشكل 1 مجمل عملية المعايرة مجلس التعاون الجمركي والحصول على الصور معدود. الشكل 1A 1B وتصور صورة معايرة ف مربع وحساب طول ف مربع في بكسل. يحدد مجلس التعاون الجمركي تركيز خلية في حجم معين باستخدام المعادلة التالية:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات حاسمة، حل المشاكل، والقيود

طبيعة الأساليب الحسابية الآلي، وعلى وجه التحديد تلك التي تحليل الجزيئات، تستلزم القدرة الحسابية لتحديد هذه الجسيمات. ونتيجة لذلك، فإن دقة كلا حاسبة تركيز خلية والهجرة فحص العداد تعتمد مجورلي على الإخلاص صورة، وهذا هو، مدى الارتباط الوثيق بين الصورة التي تم التقاطها تشبه عينة الخلية أو فحص الهجرة الغشاء. ولذلك من أهمية ليفنات لمتابعة المجهر وما يرتبط بها من بروتوكولات معايرة البرمجيات.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية إلى CP (OR 142730 و OR 89931). نود أن نشكر جيلينا بركيتش على فكرتها الأولية عن تحليل الجسيمات الثنائية في ImageJ.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - مع L-GlutamineFisher ScientificSH3002702Cell culturing Media 
مصل الجنين (FBS)GIBCO BRLP00015الوسائط
HTR8 / SVneo تمالحصول على الخلايا من الدكتور تشارلز جراهام (كوين" s University, Kingston, Canada)تم تصميم البرنامج للعمل مع أي خط خلوي.
التربسينجيبكو BRL27250-018محضر بنسبة 0.20٪ (وزن / حجم) في 10 ميكرو ؛ M EDTA 1x PBS
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
10 سم لوحات زراعة الخلاياSARSTEDT833902أي ألواح معالجة بزراعة الأنسجة ستكون مناسبة
إدراج غشاء البوليستر Transwell - 8.0 & nbsp ؛ ومايكرو. م حجم المسامCostar 3422 تم طلبها من Fisher Scientific7200150لألواح 24 بئر ؛ حجم المسام: 8.0 وميكرو ؛ m; قطر 6.5 مم 0.33 سم < سوب > 2 < / سوب> منطقة النمو
بقع وكواشف أمراض الدم HARLECO ، EMD Millipore - الحلويات 1 و 2 و 3EMD Millipore وطلبت من VWR65044A و B و & amp تتكون مجموعة بقع الهيماكولور C من ثلاث زجاجات بولي سعة 500 مل (16.9 أونصة) وتتضمن مثبتا للميثانول (محلول 1) ، وصبغة من اليوزين أو الحمض (الحل 2) ، وصبغة زرقاء أو أساسية من الميثيلين (الحل 3) قضيب
قطني ذو رأسPuritan Medical806-WC
شفرات حلاقة صناعية أحادية الحافةVWR55411 - 055السماكة: 0.30 مم (0.012 بوصة) شرائح
المجهر - منظفة مسبقا / سادةأبعاد فيشر Scientific12550A3: 25 مم × 75 مم × 1.0 مم
غطاء Fisherbrand - المستطيلات رقم 1Fisher Scientific12-545Eالسماكة: 0.13 إلى 0.17 مم ؛ الحجم: 50 مم × 22 مم
فيشر كيميكال بيرمونت تصاعد متوسطفيشر سيانتيفيكSP15-500
لايكا ستيريو تشريح المجهرلايكا مايكروسيستمزتم تجهيز الميكروسوب بكاميرا مجهر لايكا موديل MC170 HD وبرنامج الكاميرا هو تطبيق Leica. Suite (LAS E2) الإصدار 3.1.1 [البناء: 490]. أجزاء المجهر:  LED3000 نموذج إضاءة البقعة: MEB126 ، Leica M80 Optic Carrier Model M80 ، Objective achromat 1.0X ، WD = 90   ؛ مم الموديل: MOB306 & أمبير أكرومات موضوعي 0.32X, WD=303  نموذج مم: MOB315 ، هدف الفيديو 0.5X الموديل: MTU-293
مقياس الدمألمانيا   ؛0.100 مم عمق - 0.0025 مم < sup > 2 < / sup>
Olympus المجهر الضوئي المقلوبOlympus CorporationCKX41SFتم تجهيز الميكروسوب ب Lumenera Infinity 1-2
2.0 ميجابكسل CMOS Color Camera & amp Software هو Infinity Analyze الإصدار 6.5.2
خزانة التدفق الصفحي 1300 Series A2Thermo Scientific   ؛الموديل: 1375أي خزانة تدفق رقائقي لأعمال زراعة الخلايا ستكون مناسبة   ؛
حاضنة زراعة الخلاياThermo Scientific الموديل: 370أي حاضنة لزراعة الخلايا ستكون مناسبة - تم زراعة الخلايا في بيئة رطبة ، 5٪ CO2< / sub> ، 37 درجة ؛ ج 
ImageJNIHالإصدار 1.50eالحد الأدنى للإصدار المطلوب
Java Runtime EnvironmentOracle الإصدار 1.8.0_66الحد الأدنى للإصدار المطلوب
إمداد نظارات مساعد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752(2008).
  2. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
  3. Graham, M. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ImageJ PluginsCell CountingHemocytometer AnalysisMigration AssayParticle AnalysisAutomated CountingImage CalibrationColor ThresholdingCell Concentration CalculatorTC Plugin

Related Articles