الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات

Jacob O'Brien; Heyam Hayder; Chun Peng

doi:10.3791/54719

مقالة منهجية

الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات

DOI:

10.3791/54719

⸱

نوفمبر 17, 2016

Jacob O'Brien¹ , Heyam Hayder¹ , Chun Peng¹

¹Department of Biology, York University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الورقة القياس الكمي لمقياس الدم والصور المجهرية للهجرة / الغزو من خلال اثنين من المكونات الإضافية الجديدة مفتوحة المصدر ImageJ حاسبة تركيز الخلية وعداد مقايسة الهجرة. علاوة على ذلك ، فإنه يصف بروتوكولات الحصول على الصور ومعايرتها بالإضافة إلى مناقشة متطلبات إدخال المكونات الإضافية بالتفصيل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعهد الوطني لليماغيج الصحة هي قوية ومتاحة بحرية برمجيات معالجة الصور. يماغيج ديه خوارزميات شاملة تحليل الجزيئات التي يمكن استخدامها بشكل فعال لحساب الجزيئات البيولوجية المختلفة. عندما عد أعداد كبيرة من عينات من الخلايا، تقدم عدادة الكريات عنق الزجاجة بالنسبة لآخر. وبالمثل، عد الأغشية من المقايسات الهجرة / الغزو مع عداد خلية يماغيج المساعد، وإن كانت صحيحة، هو عمل استثنائي مكثفة، ذاتية، واشتهر عن التسبب في آلام الرسغ. لتلبية هذه الحاجة، قمنا بتطوير اثنين من الإضافات ضمن يماغيج للقيام بهذه المهمة الوحيدة للعدادة الكريات الآلي (أو حجم معروفة) وعد الخلايا الهجرة / الغزو. كل من الإضافات تعتمد على القدرة على اكتساب الميكروسكوب عالية الجودة مع الحد الأدنى من الخلفية. فهي سهلة الاستخدام والأمثل لفرز سريع وتحليل عينات كبيرة الحجم مع أدوات التحليل المدمج للمساعدة في معايرة التهم الموجهة إليه. من خلال الجمع بين المبدأ الأساسيالصورة من عداد الخليوي مع خوارزمية الفرز والعد بعد التحليل الآلي، وهذا يزيد كثيرا من السهولة التي المقايسات الهجرة يمكن ان يتم بدون أي خسارة من الدقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في عد الخلايا في المختبر هو أسلوب الأساسية الهامة في مجموعة واسعة من تجارب زراعة الأنسجة. تحديد بدقة عدد الخلايا في الثقافة أمر ضروري لاستنساخ التجارب وتوحيد ^1،2. عد الخلايا يمكن القيام بها يدويا باستخدام عدادة الكريات فضلا عن استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب الآلية، ولكل منها مزاياه وعيوبه ^3،4،5. معظم الطرق الآلية للعد الخلايا تنتمي إلى واحدة من فئتين، تلك التي تستخدم مبدأ كولتر أو التدفق الخلوي. عدادات كولتر الاستفادة من خلايا المقاومة الكهربائية لتحديد عدد الخلايا والحجم. فهي سريعة ودقيقة وأرخص من أجهزة قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك، نادرا ما يتم استخدامها لعد الخلايا الوحيد نظرا لتكلفتها كبيرة بالمقارنة مع العد والفرز اليدوي ^3. تدفق cytometers، من ناحية أخرى، هي مكلفة ولكن لديهم العديد من التطبيقات مثل عد الخلايا، وتحليل شكل خلايا، الحادي والعشرينructure وقياس الخلايا الداخلية علامات ^4،5. تتوفر العديد من الشركات المصنعة للأجهزة التي تستخدم أي من هذين المبدأين. العد والفرز اليدوي هو في متناول اليد ولكن وقتا طويلا وتخضع للانحياز في حين تأتي الأساليب الآلي مع جزء من الوقت اللازم لالعد والفرز اليدوي ولكن باستخدام أجهزة باهظة الثمن ^6.

إجراءات زراعة الخلايا الأخرى الشائعة هي في المقايسات خلية حركية المختبر، وهي هجرة الخلايا وغزو ^7. وتستخدم الهجرة والغزو فحوصات عادة للتحقيق حركية الخلية والغزو ردا على استجابة الكيميائي. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم على نطاق واسع لدراسة التطور الجنيني، والتفريق، استجابة التهابية، والانبثاث من أنواع خلايا متعددة ^7-11. الخلايا التي هاجروا أو غزو من خلال غشاء مسامي لفحص الهجرة يمكن أن يكون كميا بطريقتين مختلفتين. أولا، من خلال تلطيخ الخلايا مع صبغة الفلورسنت، التفكك جيئة وذهابام الغشاء، وتقدير باستخدام قارئ الفلورسنت ^12. وجود قيود على هذا الأسلوب من تقدير هو أنه لا يوجد سجل يمكن الاحتفاظ بها في الأغشية وليس هناك احتمال لمزيد من التحليل ^13. طريقة القياس الكمي الثاني هو لهاجر / الخلايا لتكون ثابتة وملطخة صبغة الفلورسنت أو أكثر شيوعا، مع الأصباغ الخلوي مثل البنفسجي وضوح الشمس، طولويدين صبغة زرقاء أو الهيماتوكسيلين غزا. ثم يتم كميا الخلايا يدويا باستخدام الصور المجهرية مقلوبة من هذه الأغشية وهي تستغرق وقتا طويلا مهمة جدا ^12،13.

للتغلب على عيوب خلية العد والفرز اليدوي، وضعت اثنين من عدادات خلية الآلي موثوقة ودقيقة للتركيز خلية ولفحص الهجرة. وقد وضعت هذه الخوارزميات مكافحة خلية الآلي ليماغيج على النحو المساعد باستخدام لغة الكمبيوتر جافا أوراكل. يماغيج هو أداة معالجة الصور العامة وعلى نطاق واسع المستخدمة التي وضعها المعهد الوطني للهيئة التعليم العاليLTH (NIH) ^14،15. وبالتالي، أكتب هذه الإضافات ليماغيج يسهل سهولة الاندماج في المجتمع البيولوجي.

أتمتة عد الخلايا يضمن إنتاجية عالية واستنساخ مقارنة العد والفرز اليدوي. على الرغم من أن البرامج والإضافات أخرى متاحة يمكن استخدامها لحساب تركيز الخلية من خلال تحليل الصور ^5،16،17، خلية تركيز حاسبة المساعد سريع ويمكن أيضا التعامل مع التخفيفات من الخلايا والعلاجات. وعلاوة على ذلك، جميع النتائج والحسابات من هذه العدادات اثنين يمكن انقاذه وتصديرها. هي الأمثل الإضافات المذكورين في هذه الورقة لاستخدام على النقيض المجهر مرحلة لتصوير الخلايا الحية وحقل كبير للعرض (كامل القبض على غشاء) التصوير للأغشية الهجرة الفحص من خلال استخدام نطاق تشريح. هي متاحة بحرية للتحميل مع تعليمات التثبيت من الإضافات: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجهر 1. مجمع وإعداد الكاميرا (خلية تركيز حاسبة)

زيادة سطوع المصباح إلى كامل مع مقبض تعديل ضوء، والتحول إلى عدسة الهدف 4X، وضمان ويتم اختيار المرشحات النقيض من المرحلة.
ملاحظة: أي مقلوب المرحلة المجهر النقيض لزراعة الأنسجة مع خلفية مظلمة، على سبيل المثال، فب مرحلة النقيض من ذلك، يمكن استخدامها وفقا للإجراءات المجهر والكاميرا القياسية.
ضمن البرامج المجهر، تعيين إعدادات التقاط الصور إلى القيم الافتراضية.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم المجهر للعثور على موقع هذه الإعدادات.
1. مجموعة 'السطوع'، 'المقابل'، و 'التشبع "إلى 100٪ و" جاما "و" مكاسب "إلى 1.0.
  ملاحظة: اعتمادا على البرنامج، "السطوع" و "التباين" قد الافتراضي إلى قيمة 0٪ بدلا من 100٪.
2. مجموعة صور يتم التقاطها باللونين الأبيض والأسود باستخدام أعلى دقة المتوفرهه (1600 س 1200 بكسل (بكسل) أو أكبر).
  ملاحظة: "تشبع" من 0٪ لا يكفي إذا وضع أبيض وأسود غير متوفر.
وضع عدادة الكريات القياسية على خشبة المسرح المجهر والتقاط صورة كما هو مبين في الشكل (1A)؛ هذا هو "حجم الصورة المعايرة. ضبط التعرض توقيت كما هو مطلوب.

2. صورة معايرة حجم

فتح يماغيج ومن قائمة الإضافات، وبدء تركيز خلية حاسبة (CCC) المساعد، على سبيل المثال، والإضافات> محلل> 'تركيز خلية حاسبة.
1. إذا كانت لوحة الجانب الأيمن "صورة حجم معايرة" غير مرئية، انقر على 'معايرة "لاظهار ذلك.
في ImageJ، وفتح "حجم الصورة المعايرة" من الخطوة 1.3 ( 'ملف'> 'المفتوحة') وفي CCC انقر على "احصل على صورة البعد 'زر.
ملاحظة: هذا سوف تملأ في كل صورة العرض ومربعات النص الارتفاع مع دقة وضوح الصورة بالبكسل تلقائيا.
في ImageJ، حدد "أداة خط مستقيم" إلى جانب اختيار الأدوات ورسم خط مستقيم عبر طول عدادة الكريات الابتدائية (P) -square موضح في (الشكل 1B) عن طريق النقر والسحب المؤشر.
1. دفع مفتاح 'م' لعرض إطار نتائج تحتوي على قياسات خط مستقيم. اكتب قيمة من العمود طول في مربع النص "ف مربع طول" في CCC (الشكل 1B).
2. انقر على زر "احسب صورة وحدة تخزين" لإخراج حجم الصورة في مربع النص صورة حجم. بالتناوب، إذا كان حجم الصورة هو معروف بالفعل، اكتب وحدة التخزين في NL في مربع النص صورة حجم.
انقر فوق الزر "حفظ".
ملاحظة: يتم الآن معايرة المساعد.

3. كاميرا التعرض المعايرة

بعد حصاد الخلايا لعد عبر عدادة الكريات، وتحميل 10 ميكرولتر من الخلايا في غرفة عدادة الكريات ووضعه على خشبة المسرح المجهر.
باستخدام نفس الإعدادات من الخطوة 1.2، وضبط وقت التعرض بحيث تكون خطوط خلفية عدادة الكريات تختفي.
1. ضبط التركيز حتى أن المناطق الداخلية من الخلايا أغمق من غشاء الخلية، مما يدل على التركيز داخل المقطع العرضي المركزي للخلية وليس القطبين.
2. وعلاوة على ذلك ضبط التعريض الضوئي بحيث لا يتم تعريض الخلايا وتشبه تلك المصورة في (الشكل 1C).
  ملاحظة: خطوط عدادة الكريات مرئية قليلا مقبولة. فمن المستحسن لحفظ أو تسجيل هذه الإعدادات للحفاظ على دقة والتكاثر.

4. الحصول على الصور

لكل عينة الخلية، وتحميل 10 ميكرولتر في مجلسي عدادة الكريات لزيادة قوة الاستدلال الإحصائي ^2. وضع عدادة الكريات على المسرح المجهرللتصوير.
ملاحظة: إن قرار والتكبير من كل صورة يجب أن تكون هي نفسها باسم 'حجم الصورة المعايرة. البرنامج المساعد بحساب جميع الصور من أي المجلد المحدد. تبقى الصور ليتم احتساب معا في نفس المجلد.
1. إذا وظيفة اسم الملف لصناعة السيارات زيادة متاح، قم بتشغيله والتأكد من عدم ظهور كل صورة بعد التقاط لزيادة الإنتاجية.
  ملاحظة: حفظ وإغلاق كل صورة سوف يتباطأ بشكل كبير بانخفاض العملية يدويا. الرجوع إلى دليل المستخدم المجهر للحصول على معلومات عن توافر وظيفة لصناعة السيارات في الزيادة.
2. القبض على ثلاثة أشخاص على الأقل الصور غير المتداخلة في المنطقة الوسطى من عدادة الكريات على الرغم من أن أكثر من المستحسن (5-10) لزيادة دقة.
  ملاحظة: تجنب كل من أعلى والمناطق السفلى من الدوائر كما تميل الخلايا لزيادة في كثافة في كلا الموقعين. خذ نفس العدد من الصور لكل غرفة. هذا مطلوب من أجل حسن سير العمل في البرنامج المساعد أثناء الفرز.

5. عد صورة والتخفيفات

في CCC، انقر على 'عدد خلايا "ومراقبة مربع الحوار اختيار دليل. حدد المجلد المراد فرزها.
مراقبة مربع إدخال رقم العينة بعد اختيار المجلد. أدخل عدد من الصور التي التقطت في غرفة، أي 4.1.2، وانقر على 'موافق'. والبرنامج المساعد الآن عد جميع بي، شجار، وبابوا نيو غينيا الصور في المجلد المحدد حسب الترتيب الأبجدي.
ملاحظة: يؤدي النقر على زر 'عارض نموذج' إظهار إطار عارض نموذج عرض معلومات حول عينات فرزها. تركيز العينة هو متوسط تركيز جميع الصور التي التقطت في الغرفة. عينات مع تركيزات الكمية اللابعدية يمكن أن تضاف إلى هذه القائمة، مثل إضافة الدواء أو العلاج جزيء صغير.
1. إعادة فرز الأصوات في عينات من الخلايا إذا تختلف تركيزات بشكل كبير في تهم نفس العينات (القسم 4).
  ملاحظة: لحساب التخفيفات عن كل طنانه احصى-العينات، CCC تلقائيا يستخدم الصيغة C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
استخدام سيناريو البذر 15000 خلية لكل 200 ميليلتر إلى 30 بئرا من لوحة 96-جيدا + 1 اضافية:
1. تعيين النص إلى اليمين من التسمية C2 إلى 15،000 وتركيز حجم النص إلى 200، تغيير وحدة مربع التحرير والسرد المجاورة ل"ميكرولتر.
  ملاحظة: البرنامج المساعد حساب في نهاية المطاف التركيز في خلية / مل.
2. تأكد من مربع التحرير والسرد حجم وV2 اختيار (الحجم النهائي) وفي مربع النص إلى اليمين إدخال 6200 (200 ميكرولتر س (30 + 1))، واختيار "ميكرولتر" في مربع التحرير والسرد وحدة حجم.
انقر على "حساب التخفيف" لإضافة التخفيف دخلت حاليا إلى مربع القائمة الأيسر السفلي.
ملاحظة: للحصول على كل تخفيف المضافة، وسيتم حل لكل عينة وعرض في مخطط الشجرة إلى اليمين. انقر مرتين على كل دخول للتوسع.
النقر روقال انه على زر "حفظ" أسفل زر "عارض نموذج 'الكتابة إلى ملف جميع البيانات والتخفيفات عينة.
ملاحظة: يمكن استعادة هذه البيانات في أي وقت عن طريق النقر على 'تحميل' واختيار الملف المحفوظ.

6. الهجرة والغزو (عداد)

أداء الهجرة والغزو فحوصات باستخدام معيار طريقة بويدن غرفة ^7-9.
بعد خلايا هاجروا / غزا، وإزالة بعناية وسائل الإعلام في إدراج كتبها قلب والتنصت بلطف. انضمت الفتيل بعيدا بأية وسيلة الزائدة إلى أسفل الغشاء عن طريق لمس حافة منشفة ورقية.
ملاحظة: لا تلمس الغشاء نفسه إلى منشفة، وهذا قد إزاحة الخلايا الالتزام.
إصلاح وصمة عار على الخلايا كما ذكرت ^7-9 في 24 لوحة جيدا اقامة مع كل صف يحتوي على ~ 500 ميكرولتر من حل مختلف، على سبيل المثال، تثبيتي، وصمة عار 1، وصمة عار 2، والماء المقطر المزدوج ([ده ₂ O). ملء طبق الثانية مع برنامج تلفزيوني 1X رس وضع تدرج في قبل القطع.
غسل إدراج عن طريق وضعها في آبار مليئة ده ₂ O وملء إدراج مع ده ₂ O. استنزاف المياه قبل ينظف بعيدا الخلايا عن طريق انقلاب.
استخدام قضيب من القطن نظيفة لإزالة الخلايا من الامم المتحدة وهاجر / برنامج الأمم المتحدة للغزو من أعلى الغشاء مع الحرص على عدم تلف الغشاء. تكون شاملة حول حواف الغشاء.
قطع الغشاء باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط وبعناية نقل الغشاء (الجانب أسفل إلى أعلى) على شريحة زجاجية نظيفة.
إضافة قطرة صغيرة من محلول المتصاعدة تحت وفوق الغشاء، وتغطي مع انزلاق الغطاء رقيقة.
ملاحظة: تجنب احتباس فقاعات في الحل متزايدة للحفاظ على صحة التهم الموجهة إليه.

7. تشريح نطاق وكاميرا الإعداد

بدوره على مصدر للضوء المجهر والكاميرا.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم المجهر للحصول على إرشادات مفصلة.
خفة دمهين البرمجيات، وضبط إعدادات التقاط الصور المجهر إلى القيم الافتراضية.
ملاحظة: في حالة وجود وظيفة المتوسط، فمن المستحسن قيمة الأربع. هذا هو حل وسط جيد بين درجة المتوسط والحصول على الصور وقت. وبالمثل، وعلى درجة صغيرة من شحذ قد يزيد صورة الإخلاص.
1. مجموعة 'السطوع'، 'المقابل'، و 'التشبع "إلى 100٪ و" جاما "و" مكاسب "إلى 1.0.
  ملاحظة: اعتمادا على البرنامج، "السطوع" و "التباين" قد الافتراضي إلى قيمة 0٪ بدلا من 100٪.
2. عرض مجموعة (الوقت الحقيقي) وقرار القبض على ضبط الحد الأقصى من (1600 س 1200 بكسل و2،592 خ 1،944 بكسل، على التوالي).
  يمكن تعديل عرض القرار على النحو المطلوب إذا كان معدل التحديث بطيئة جدا: ملاحظة. وقرارات أقل من صعوبة في التركيز بدقة ولكن زيادة معدل التحديث.
للمرحلة نطاق تشريح، واستخدام backgro الأبيض الصلبةاوند. خلفية سوداء أو زجاج غير كافية.
استخدام مصدر ضوء المرحلة المذكورة آنفا، ويفضل أن يكون من اثنين من أضواء LED مرنة إلى يمين ويسار المسرح.
ملاحظة: أقل من المرحلة مصدر الضوء سوف تضيء المسام داخل غشاء فحص الهجرة التي قد تؤثر سلبا على دقة التهم اللاحقة.
وضع تكتمل الهجرة فحص شريحة الغشاء على خشبة المسرح. وعند النظر إلى الصورة في الوقت الحقيقي التي يعرضها البرنامج، وضبط التكبير مع مقبض تعديل التكبير بحيث حواف غشاء واحد ليست سوى في مجال الكاميرا وجهة نظر.
ملاحظة: وضع الشريحة على طبق من زجاج فاق مرحلة خلفية بيضاء يسهل على المناورة الشريحة للتصوير.
توفيق أوضاع الخفيفة المصدر (7.6.1) وأوقات التعرض لإنتاج قدر الإمكان الصورة المثالية هو مبين في الشكل 2A. اعتمادا على السطوع، ويجب التعرض مرات من 5-60 مللي تكون كافية.
ملاحظة:والهدف هو إنتاج صورة مع اقل قدر من لون الخلفية ممكن وغشاء مضاءة بشكل موحد دون التقليل الإخلاص صورة، أي التعرض المفرط مما يؤدي إلى فقدان الخلايا المرئية.
1. ضع مصادر الضوء اليسار واليمين في زاوية منخفضة نسبة إلى الشريحة. هذا وسوف تساعد على إزالة وصمة عار الخلفية والانحرافات لوني. محاولة للحفاظ على كل مصدر الضوء المعاكس مباشرة إلى أخرى.
  ملاحظة: أثناء المناورة كل مصدر الضوء في الموقف، وتحويل بعضا. هذا يساعد على مركز للمجال الإضاءة على الغشاء نفسه أكثر سهولة ودقة.
إزالة الشريحة وتوازن اللون الأبيض للصورة باستخدام زر واحد في البرنامج المجهر.
ملاحظة: يتم الآن معايرة المجهر. حفظ العديد من الإعدادات ممكن لاستخدامها في المستقبل واتخاذ علما بالمواقف مصدر الضوء وكثافة.

8. الحصول على الصور وFlatfield

في داخل البرنامج، تعيينموقع المجلد القبض، والقبض على صورة واحدة في الغشاء. تسمية الصور التالية القالب العام لل: الاسم - ###، على سبيل المثال، مراقبة - 001.tif، التحكم - 002.tif، اختبار المخدرات - 001.tif، وهلم جرا.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج صورة، حفظ نوع ملف الصورة كما شجار على الأشكال الضياع أخرى مثل الحياة السياسية في فرنسا.
ملاحظة: الصور لا يتبع القالب العام لا تزال تحسب لكنها لن تكون خاضعة للتجمع الآلي وإيفاد شقة.
1. إذا المطلوب هو تصحيح flatfield، لكل شريحة العثور على منطقة فارغة وأخذ صورة فارغة التالية اصطلاح التسمية: الاسم - فارغة.
  ملاحظة: فارغة هي منطقة تقع على الشريحة التي لا تحتوي على الغشاء ويمثل الإضاءة الخلفية.
2. على الفور قبل التصوير، تتسطح كل الغشاء عن طريق الضغط على ساترة وإزالة العديد من فقاعات المحاصرين وقت ممكن.
في ImageJ، انتقل إلى الإضافات وفتح المساعد TC. على سبيل المثال، والإضافات> تحليل> & #39؛ Transwell مكافحة '.
ضمن TC، انقر على زر "Flatfield" ومراقبة مربع الحوار اختيار دليل. حدد المجلد حيث تم حفظ الصور الغشاء.
ملاحظة: فقط الصور المحفوظة مع القالب العام فوق سيتم تلقائيا flatfield تصحيح وحفظها في مجلد جديد يسمى Flatfield داخل المجلد الذي تم اختياره. انظر الشكل 2B للحصول على مثال صورة flatfield تصحيحها.

9. إعدادات التكوين

فتح صورة غشاء الهجرة فحص في ImageJ ( 'ملف'> 'فتح') ثم اختر صورة> ضبط> 'اللون عتبة ...'. مراقبة نافذة عتبة اللون لضبط ما هي الألوان وسوف تخرج من الصورة.
1. في الجزء السفلي من النافذة، وتحديد طريقة استيفاء الحد الأدنى ل"Shanbhag"، اللون عتبة إلى 'الأبيض'، ومساحة اللون إلى "RGB" (أحمر أخضر أزرق)؛ الخلفية الداكنة إلغاء تحديد اذا تم اختيارهم.
2. ضبط أعلىالمتزلجون عن طريق النقر والسحب علامات ل0 والمتزلجون أسفل إلى 255 (ترك المتزلجون السفلي في 255). تأكد من أن صورة بيضاء بالكامل.
ضبط أكبر المتزلجون الأخضر والأحمر فقط حتى نوى مرئية.
ملاحظة: الإعدادات المحددة ستختلف كليا على وصمة عار الخلايا المستخدمة. انظر الشكل 2C.
في البرنامج المساعد TC، إدخال القيم من كبار المتزلجون RGB إلى مربعات النص وإعدادات التكوين المرتبطة "عتبة RGB. انقر على "إضافة / تعديل 'زر والكتابة التكوين.
1. مغادرة حجم متوسط السفلى والعليا القيم في 1 - اللانهاية.
في لوحة إعدادات التكوين، انقر فوق "حفظ" لكتابة الإعدادات إلى القرص الصلب.

10. صور العد والمعايرة

فتح المساعد TC (8.2) وانقر على "عدد المجلدات 'ومراقبة مربع الحوار اختيار دليل. حدد المجلد لتحسب لالثانية انتظر حتى النهاية.
يضاف كل عينة تحسب تلقائيا إلى الجدول الرئيسي. الأعمدة الرئيسية هي 'عدد'، 'نوعية'، و 'معايرة؟ ".
ملاحظة: عدد معايرة الامم المتحدة هو عدد الجسيمات في غشاء داخل المنطقة المعروضة في العمود "مجموعة المساحة.
ملاحظة: تتراوح الجودة من حوالي -0.8 إلى 1.7. س ≥ 0.5 غير مقبول.
1. لاحظ علامة في "معايرة؟ العمود إذا كان يتم وضع صورة للمعايرة بناء على التشابه بينه وبين مقاييس مثالية.
  ملاحظة: كل من الجودة والمعايرة قد يوحي بأن الإعدادات الحالية هي ربما كافية. إذا كان بعد "نطاقات الحجم 'الصحيح' اللون استيفاء الحد الأدنى" وتم اختيارها وما زال اقترح المعايرة، والتفتيش على الأصلي وعدها يجب أن تكون الصور المحدد النهائي لعدد صحيح.
تحديد جميع العينات في الجدول مأشر للمعايرة.
1. انقر بزر الماوس الأيمن في تيانه الجدول وحدد إعادة فرز الأصوات> 'حجم المقترحة. وهذا سرد الصور مع منطقة الجسيمات الحد الأدنى المقترح.
2. انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى واختر "إظهار مؤامرة". مراقبة مؤامرة تردد مبعثر من المناطق الجسيمات. وصورة مثالية لديهم الرسم البياني يشبه توزيع طويل الذيل اليمين العادي، أي منحنى الجرس. انظر الشكل 3B.
3. ضبط انخفاض حجم متوسط، إذا لزم الأمر، من خلال تحديد العينة، النقر بزر الماوس الأيمن، واختيار إعادة فرز الأصوات> 'الإعدادات اليدوية. مراقبة الحوار إعدادات اليدوي. أدخل الإعدادات المطلوبة وعدد النقرات لإعادة فرز الأصوات في صورة مع الإعدادات الجديدة.
لضبط التهم يدويا، اختر العينات، الحق النقر على الطاولة، وحدد "فتح صورة مع التهم". لاحظ الصورة الأصلية مع علامات حمراء تمثل كل الجسيمات عدها من قبل المساعد.
ملاحظة: إعادة فرز الأصوات> 'مشاهدة أحصت الصورة الثنائية "يمكن أن تكون مفيدة للتحقق من مدى جودة طيجري حلها خلايا ndividual من قبل العتبة اللون.
1. لإضافة عدد، عقد 'السيطرة' وانقر على اليسار. لاحظ علامة في موقع المؤشر التي ستضاف إلى عينات العدد الإجمالي. لإزالة علامة، انقر على الحق في الصورة. سوف المساعد إزالة علامة الأقرب إلى المؤشر.
2. لإزالة مجموعة من علامات، استخدم أداة التحديد في ImageJ لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI). في حين عقد 'السيطرة'، انقر على الحق في الصورة وسيتم إزالة كل علامات داخل العائد على الاستثمار. مراقبة عدد الخلايا في العمود "الكونت".

11. توفير / فتح نتائج والتصدير إلى CSV

في TC، انتقل إلى شريط القوائم وانقر على 'ملف'> 'حفظ النتائج ". لاحظ مربع الحوار نتائج حفظ. اختيار اسم والمقصد وانقر على 'حفظ'.
1. استخدام 'ملف'> 'نتائج المفتوحة "لتحميل ملف يحتوي على جميع البيانات المعروضة في الجدول الرئيسي، منها:ز المؤامرة.
  ملاحظة: الملف النتائج يحفظ الدلائل يتم حفظ الصور في إذا تم نقل الصور الأصلية بعد إنقاذ، و "الصورة الأصلية المفتوحة" و "فتح صورة مع التهم" ستفشل الوظائف.
2. لإعادة تعيين الدليل صورة، حدد العينات، انقر على الحق في الجدول، واختر "إعادة تعيين الدليل صورة". لاحظ مربع الحوار اختيار دليل. حدد المجلد الجديد وفي حالة وجود الصور، والدلائل يمكن إعادة تعيين. إعادة حفظ الملف النتائج.
حفظ ملف القيم المفصولة بفواصل (CSV)، في شريط القائمة اذهب إلى 'ملف'> 'تصدير إلى ملف .csv. وهذا ينتج ملف مع عينات تنظيمها في مجموعات الإحصائية مع متوسط العد والخطأ المعياري للمتوسط. تم تصميم تخطيطه لبرسوم بيانية سريعة في برامج الرسوم البيانية المشتركة.
ملاحظة: توجد هذه المجموعات الإحصائية عن المجموعات التي تم إنشاؤها ضمن TC.
1. إذا كانت العينات تتبع قالب التسمية العام، تحديد العينات لتكون غرامouped، انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر "تجمع السيارات. وهذا يضيف عينات تحمل نفس الاسم "لنفس المجموعة. استخدام التحكم سبيل المثال - 1، التحكم - 2، العلاج - 1، العلاج - 2: ستضاف على حد سواء ضوابط لمجموعة "تحكم" والعلاجات ل'العلاج'.
2. إضافة عينات يدويا إلى مجموعة عن طريق النقر المزدوج خلية العينة "المجموعة" وكتابة اسم المجموعة. اختيار العينات التي يمكن ان تضاف إلى هذه المجموعة، انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر "إضافة إلى مجموعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركيز خلية حاسبة

ويبين الشكل 1 مجمل عملية المعايرة مجلس التعاون الجمركي والحصول على الصور معدود. الشكل 1A 1B وتصور صورة معايرة ف مربع وحساب طول ف مربع في بكسل. يحدد مجلس التعاون الجمركي تركيز خلية في حجم معين باستخدام المعادلة التالية:

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات حاسمة، حل المشاكل، والقيود

طبيعة الأساليب الحسابية الآلي، وعلى وجه التحديد تلك التي تحليل الجزيئات، تستلزم القدرة الحسابية لتحديد هذه الجسيمات. ونتيجة لذلك، فإن دقة كلا حاسبة تركيز خلية والهجرة فحص العداد تعتمد مجورلي على الإخلاص صورة، وهذا هو، مدى الارتباط الوثيق بين الصورة التي تم التقاطها تشبه عينة الخلية أو فحص الهجرة الغشاء. ولذلك من أهمية ليفنات لمتابعة المجهر وما يرتبط بها من بروتوكولات معايرة البرمجيات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية إلى CP (OR 142730 و OR 89931). نود أن نشكر جيلينا بركيتش على فكرتها الأولية عن تحليل الجسيمات الثنائية في ImageJ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - مع L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing Media
مصل الجنين (FBS)	GIBCO BRL	P00015	الوسائط
HTR8 / SVneo تم	الحصول على الخلايا من الدكتور تشارلز جراهام (كوين" s University, Kingston, Canada)		تم تصميم البرنامج للعمل مع أي خط خلوي.
التربسين	جيبكو BRL	27250-018	محضر بنسبة 0.20٪ (وزن / حجم) في 10 ميكرو ؛ M EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 سم لوحات زراعة الخلايا	SARSTEDT	833902	أي ألواح معالجة بزراعة الأنسجة ستكون مناسبة
إدراج غشاء البوليستر Transwell - 8.0 & nbsp ؛ ومايكرو. م حجم المسام	Costar 3422 تم طلبها من Fisher Scientific	7200150	لألواح 24 بئر ؛ حجم المسام: 8.0 وميكرو ؛ m; قطر 6.5 مم 0.33 سم < سوب > 2 < / سوب> منطقة النمو
بقع وكواشف أمراض الدم HARLECO ، EMD Millipore - الحلويات 1 و 2 و 3	EMD Millipore وطلبت من VWR	65044A و B و & amp	تتكون مجموعة بقع الهيماكولور C من ثلاث زجاجات بولي سعة 500 مل (16.9 أونصة) وتتضمن مثبتا للميثانول (محلول 1) ، وصبغة من اليوزين أو الحمض (الحل 2) ، وصبغة زرقاء أو أساسية من الميثيلين (الحل 3) قضيب
قطني ذو رأس	Puritan Medical	806-WC
شفرات حلاقة صناعية أحادية الحافة	VWR	55411 - 055	السماكة: 0.30 مم (0.012 بوصة) شرائح
المجهر - منظفة مسبقا / سادة	أبعاد فيشر Scientific	12550A3	: 25 مم × 75 مم × 1.0 مم
غطاء Fisherbrand - المستطيلات رقم 1	Fisher Scientific	12-545E	السماكة: 0.13 إلى 0.17 مم ؛ الحجم: 50 مم × 22 مم
فيشر كيميكال بيرمونت تصاعد متوسط	فيشر سيانتيفيك	SP15-500
لايكا ستيريو تشريح المجهر	لايكا مايكروسيستمز		تم تجهيز الميكروسوب بكاميرا مجهر لايكا موديل MC170 HD وبرنامج الكاميرا هو تطبيق Leica. Suite (LAS E2) الإصدار 3.1.1 [البناء: 490]. أجزاء المجهر: LED3000 نموذج إضاءة البقعة: MEB126 ، Leica M80 Optic Carrier Model M80 ، Objective achromat 1.0X ، WD = 90 ؛ مم الموديل: MOB306 & أمبير أكرومات موضوعي 0.32X, WD=303 نموذج مم: MOB315 ، هدف الفيديو 0.5X الموديل: MTU-293
مقياس الدم	ألمانيا ؛		0.100 مم عمق - 0.0025 مم < sup > 2 < / sup>
Olympus المجهر الضوئي المقلوب	Olympus Corporation	CKX41SF	تم تجهيز الميكروسوب ب Lumenera Infinity 1-2 2.0 ميجابكسل CMOS Color Camera & amp Software هو Infinity Analyze الإصدار 6.5.2
خزانة التدفق الصفحي 1300 Series A2	Thermo Scientific ؛	الموديل: 1375	أي خزانة تدفق رقائقي لأعمال زراعة الخلايا ستكون مناسبة ؛
حاضنة زراعة الخلايا	Thermo Scientific	الموديل: 370	أي حاضنة لزراعة الخلايا ستكون مناسبة - تم زراعة الخلايا في بيئة رطبة ، 5٪ CO_{2< / sub> ، 37 درجة ؛ ج}
ImageJ	NIH	الإصدار 1.50e	الحد الأدنى للإصدار المطلوب
Java Runtime Environment		Oracle الإصدار 1.8.0_66	الحد الأدنى للإصدار المطلوب

إمداد نظارات مساعد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752(2008).
JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. Animal Cell Culture. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).
Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).
Scott, W. N. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).
Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).
Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/ (2007).
Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).
Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , Available from: https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة