والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

ملخص

الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي شبكات من الحمض النووي، الهستونات والبروتينات العدلة. على الرغم من أن المكون من الاستجابة المناعية الفطرية، وتورط المستجدة في المناعة الذاتية وتجلط الدم. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل العدلات الكلاب وتقدير من المستجدة باستخدام فحص صفيحة مضان.

الملخص

مصائد العدلات خارج الخلية هي شبكات من الحمض النووي والهيستونات وبروتينات العدلات التي يتم إطلاقها استجابة للمنبهات المعدية والالتهابية. على الرغم من أنها عنصر من مكونات الاستجابة المناعية الفطرية ، إلا أن NETs متورطة في مجموعة من عمليات المرض بما في ذلك المناعة الذاتية والتخثر. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل عدلات والقياس الكمي للشبكات باستخدام مقايسة مضان الصفيحة الدقيقة. يتم جمع الدم باستخدام تقنيات بزل الوريد التقليدية. يتم عزل العدلات باستخدام ترسيب ديكستران وتدرج الكثافة باستخدام ظروف محسنة لدم. بعد إتاحة الوقت للتعلق بآبار صفيحة 96 بئر ، تتم معالجة العدلات بناهضات محفزة للصابر مثل phorbol-12-myristate-13-acetate أو عامل تنشيط الصفائح الدموية. يتم قياس إطلاق الحمض النووي عن طريق تألق صبغة الحمض النووي غير المنفذة للخلية. هذا الاختبار هو طريقة بسيطة وغير مكلفة لقياس إطلاق NET ، ولكن يجب تأكيد تكوين NET بدلا من الأسباب الأخرى لموت الخلايا بطرق بديلة.

المقدمة

وهناك أكثر من 70 مليون الكلاب الاليفة في الولايات المتحدة وحدها ^1. كأعضاء أسرة الكرام، هذه الحيوانات غالبا ما تلقي الرعاية الطبية خفض الحافة. على قدم المساواة لأنهم مشاركة بيئتنا، يمكن أن الكلاب أن تساعد في فهم المرضية والعلاج من الأمراض التي تصيب البشر ^1. ومع ذلك، ما إذا كانت ترجمة الاكتشافات في الطب البشري في العلاجات البيطرية أو العكس بالعكس، فمن المهم أن تميز الاختلافات الأنواع حتى في أنظمة الحفظ للغاية تماما مثل الاستجابة المناعية الفطرية. وتشمل الأمثلة على الاختلافات بين الكلاب ونظام المناعة الفطري البشري العالي التعبير CD4 على العدلات الكلب ^2. غياب homolog الوظيفي للاستشعار فلاجيلين حشوية....

البروتوكول

أجريت جميع التجارب بإذن الأخلاقي من لجنة جامعة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام ولاية أيوا.

مجموعة 1. الدم

1. رسم 9 مل من الدم من الصافن، وريد رأسي أو الوداجي مباشرة إلى تخثر (على سبيل المثال، ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، و 1.8 ملغم ك ₂ EDTA / ملليتر دم) vacutainers، أو إلى حقنة مع نقل على الفور إلى أنابيب الدم التي تحتوي على EDTA. لفة بلطف أو عكس أنابيب الدم لضمان خلط كافية من الدم ومكافحة تجلط الدم.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، يجب أن يكون هناك تغيير أضعاف القوي في مضان بعد تحفيز العدلات مع الضوابط الإيجابية، سلطة النقد الفلسطينية والقوات الجوية الباكستانية. كما هو موضح في الشكل 1B، وتحفيز العدلات الكلاب مع 31 ميكرومتر القوات الجوية الباكستانية ل1 النتائج ساعة في زيادة 4.0 أضعاف متوسط في مضان مقارنة مع الخلايا غير حفز (المدى 2،0-5،8، ن = 5 الكلاب) ^18. سلطة النقد الفلسطينية عند 0.1 ميكرومتر (الشكل 1A) هو.......

المناقشة

فحص الحمض النووي الإفراج قدم هو فحص للقياس بسهولة للالحمض النووي خارج الخلية. تم تعديل طريقة من تقنيات مشابهة تستخدم لتقييم تشكيل NET في الأنواع الأخرى، ولكن تم تغيير السرعات الطرد المركزي، وتركيزات ناهض وحضانة مرات لتحسين طريقة للاستخدام مع العدلات الكلاب ^8،17،18. يمكن إجراء تعديلات مماثلة على التكيف مع طريقة لأنواع أخرى. الفحص غير واضحة وغير مكلفة بالمقارنة مع الطرق الأخرى لقياس NETosis مثل التدفق الخلوي أو تحليل الصور. الطريقة أيضا لا يتطلب الأجسام المضادة ضد مكونات .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنبوب دم كامل بلاستيكي مطلي بالرش K2< / sub>EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	شركة كيميائية وعلمية دقيقة.	AN228410
محلول ملحي	بالفوسفات ThermoFisher 20012043
مصل عجل البقر الجنيني ، معطل بالحرارة	ThermoFisher Scientific	10100139
RPMI Media 1640 ، بدون الفينول الأحمر أو L-glutamine	ThermoFisher Scientific	32404-014	يجب أن يكون خاليا من الفينول الأحمر
96 صفيحة البوليسترين المعقمة ذات القاع	المسطح فالكون	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
عامل تنشيط الصفائح	الدموية Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX صبغة الحمض النووي الأخضر	ThermoFisher Scientific	S7020
Synergy 2 قارئ متعدد الأوضاع	BioTek	NA

مخزن علمي