مقالة منهجية

والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

8.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54726

⸱

نوفمبر 21, 2016

 ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Preventative Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh, 3Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University

في هذه المقالة

ملخص

الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي شبكات من الحمض النووي، الهستونات والبروتينات العدلة. على الرغم من أن المكون من الاستجابة المناعية الفطرية، وتورط المستجدة في المناعة الذاتية وتجلط الدم. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل العدلات الكلاب وتقدير من المستجدة باستخدام فحص صفيحة مضان.

الملخص

مصائد العدلات خارج الخلية هي شبكات من الحمض النووي والهيستونات وبروتينات العدلات التي يتم إطلاقها استجابة للمنبهات المعدية والالتهابية. على الرغم من أنها عنصر من مكونات الاستجابة المناعية الفطرية ، إلا أن NETs متورطة في مجموعة من عمليات المرض بما في ذلك المناعة الذاتية والتخثر. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل عدلات والقياس الكمي للشبكات باستخدام مقايسة مضان الصفيحة الدقيقة. يتم جمع الدم باستخدام تقنيات بزل الوريد التقليدية. يتم عزل العدلات باستخدام ترسيب ديكستران وتدرج الكثافة باستخدام ظروف محسنة لدم. بعد إتاحة الوقت للتعلق بآبار صفيحة 96 بئر ، تتم معالجة العدلات بناهضات محفزة للصابر مثل phorbol-12-myristate-13-acetate أو عامل تنشيط الصفائح الدموية. يتم قياس إطلاق الحمض النووي عن طريق تألق صبغة الحمض النووي غير المنفذة للخلية. هذا الاختبار هو طريقة بسيطة وغير مكلفة لقياس إطلاق NET ، ولكن يجب تأكيد تكوين NET بدلا من الأسباب الأخرى لموت الخلايا بطرق بديلة.

المقدمة

وهناك أكثر من 70 مليون الكلاب الاليفة في الولايات المتحدة وحدها 1. كأعضاء أسرة الكرام، هذه الحيوانات غالبا ما تلقي الرعاية الطبية خفض الحافة. على قدم المساواة لأنهم مشاركة بيئتنا، يمكن أن الكلاب أن تساعد في فهم المرضية والعلاج من الأمراض التي تصيب البشر 1. ومع ذلك، ما إذا كانت ترجمة الاكتشافات في الطب البشري في العلاجات البيطرية أو العكس بالعكس، فمن المهم أن تميز الاختلافات الأنواع حتى في أنظمة الحفظ للغاية تماما مثل الاستجابة المناعية الفطرية. وتشمل الأمثلة على الاختلافات بين الكلاب ونظام المناعة الفطري البشري العالي التعبير CD4 على العدلات الكلب 2. غياب homolog الوظيفي للاستشعار فلاجيلين حشوية IPAF في الكلاب 3 والتعبير عن هجين كاسباس 1/4 في الحيوانات آكلة اللحوم (4).

الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي عنصر المكتشفة حديثا نسبيا من مناعة فطرية 5. المستجدة هي شبكةالصورة من الحمض النووي والبروتينات النووية والحبيبية صدر ردا على مجموعة واسعة من التهابات أو المعدية المحفزات 6. وقد أثبتت يشبه الهياكل NET عبر العديد من الأنواع بما في ذلك الدجاج 7، 8 الأسماك والرخويات 9 و 10 acoelomates، ولكن هناك اختلافات الأنواع. على سبيل المثال، العدلات الفئران تستجيب ببطء أكثر للمؤثرات NETosis من العدلات الإنسان، وتشكل المستجدة أقل منتشر 11. وهناك مجموعة كبيرة من الأدلة من الأنواع المتعددة التي المستجدة إيقاع الميكروبات، وأكثر إثارة للجدل يمكن أن تشارك مباشرة في قتل مسببات الأمراض 12،13. ومع ذلك، مكونات NET أيضا تعزيز تلف الأنسجة، وتشجيع تخثر الدم ويكون بمثابة مستضدات الذاتية 14،15. قد تختلف التوازن بين الآثار المفيدة والضارة للالمستجدة بين الأمراض المختلفة والأنواع المختلفة، مما يدل على أنه من المهم للتحقيق المستجدة في كل من الأنواع وحالة من الفائدة.

نحن هناوصف بروتوكول بسيط لإحداث وقياس الافراج عن المستجدة التي كتبها العدلات الكلاب. هذه الطريقة مشابهة لتلك المستخدمة لعزل العدلات 16 و حمل NETosis في الأنواع الأخرى، ولكن الظروف مثل تركيز ناهض وفترة حضانة وقد تم تحسين لالعدلات الكلاب. كما تم وصف مماثل NET الكمي الحمض النووي الإفراج فحص في الأنواع الأخرى ولكن الطريقة المعروضة هنا هو الأمثل أيضا للكلاب 8،17،18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب بإذن الأخلاقي من لجنة جامعة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام ولاية أيوا.

مجموعة 1. الدم

  1. رسم 9 مل من الدم من الصافن، وريد رأسي أو الوداجي مباشرة إلى تخثر (على سبيل المثال، ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، و 1.8 ملغم ك 2 EDTA / ملليتر دم) vacutainers، أو إلى حقنة مع نقل على الفور إلى أنابيب الدم التي تحتوي على EDTA. لفة بلطف أو عكس أنابيب الدم لضمان خلط كافية من الدم ومكافحة تجلط الدم.

2. العدلات عزل

  1. في أنبوب مخروطي 50 مل، مزيج الدم مع حجم مساو من درجة حرارة الغرفة المعقمة 3٪ ديكستران-500 (تتكون في 0.9٪ محلول ملحي) من خلال انعكاس لطيف. ترك واقفا منتصبا ل18-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل القش الملونة الطبقة العليا إلى أنبوب جديد حتى لم يعد من الممكن جمعها دون تلوث طبقة حمراء أقل. كريات الدم الحمراء في اله أنبوب الأصلي يمكن التخلص منها.
  2. أجهزة الطرد المركزي لطاف في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. رسم الخروج وتجاهل طاف. يدويا إعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل درجة حرارة الغرفة معقمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). لاحظ أن vortexing للا ينبغي أن تستخدم لإعادة تعليق العدلات في أي مرحلة من مراحل هذا البروتوكول. رسم يدويا قبالة، بدلا من صب قبالة supernatants ويوصى أيضا في جميع أنحاء بروتوكول لتعظيم العائد الخلية.
  3. إضافة 10 مل من محلول فصل الخلية polysucrose درجة حرارة الغرفة ودياتريزوات الصوديوم (على سبيل المثال، Histopaque 1077) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. طبقة بعناية الحل التي تحتوي على خلية على حل فصل الخلية. لاحظ أن استخدام حل فصل الخلايا التي لم معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة قد يقلل العائد الخلية.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع قبالة الفرامل.
  5. كما العدلات هي في أدنى طبقة من التدرج، ورسم الخروج وتجاهل uppeص 3 طبقات، تتألف من طبقة العليا من البلازما والصفائح الدموية، والشريط الأبيض الضيقة للخلايا وحيدة النواة وطبقة واضحة من متوسطة الكثافة التدرج.
  6. ليز أي الكريات الحمراء المتبقية، وإعادة تعليق بيليه العدلات في 10 مل من الماء درجة حرارة الغرفة.
  7. بعد 30 ثانية، واستعادة تحظرب بإضافة 10 مل من معقم درجة حرارة الغرفة 1.8٪ كلوريد الصوديوم وتخلط بواسطة قلب لطيف.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. رسم قبالة طاف وتجاهل.
  9. إذا كان بيليه لا تزال حمراء، كرر الخطوة تحلل. إذا كان بيليه الأبيض (أو إذا كان قد تم إجراء تحلل مرتين)، بلطف اعادة تعليق الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة.
  10. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي أو عدادة الكريات. غلة النموذجية هي 10 على الأقل 6 خلايا لكل مليلتر من الدم.
  11. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. رسم قبالة طاف وتجاهل.
  12. إعادة تعليق الخلايا إلى التركيز المطلوب في العقيمة درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. فوص فحص الحمض النووي إطلاق وصف في الباب 2، و resuspend في 5 × 10 6 خلايا لكل مل.
  13. إذا رغبت في ذلك، ونقل كمية صغيرة من الخلايا مباشرة أو باستخدام cytocentrifuge إلى شريحة زجاجية. تسمح للخلايا حتى يجف وصمة عار يستخدم التثبيت وتلطيخ السريعة عدة وفقا لتصنع "تعليمات. إذا كانت العزلة العدلات ناجحة، عندما فحصها تحت المجهر يجب أن يكون 95٪ على الأقل من الخلايا الأنوية المحببة (العدلات، الخلايا القاعدية، الحمضات) مع التلوث كرات الدم الحمراء الحد الأدنى.

3. الحمض النووي الإصدار الفحص

  1. إعداد مقايسة إطلاق الحمض النووي مباشرة بعد العزلة العدلة.
  2. إذا تكتل خلية موجود على فحص المحلول بواسطة المجهر الضوئي، وتمرير تعليق الخلية من خلال 70 ميكرون تصفية عقيمة عقيمة على الفور قبل إعداد الفحص.
  3. إلى كل بئر اختبار العقيمة 96 لوحة جيدا، إضافة 5 × 10 4 خلايا / جيد. ناهض وروزويل بارك مذكرةالريال معهد-1640 (RPMI) وسيط وبدون الفينول الأحمر وتستكمل مع 0.5٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين إلى الحجم النهائي من 100-200 ميكرولتر. تشمل اثنين على الأقل من الآبار فارغة في ناهض الذي يتم استبدال المحلول العدلة من حجم مساو من برنامج تلفزيوني. لاحظ أن إنشاء الآبار فارغة لكل ناهض المهم في استبعاد تلوث الحمض النووي من ناهض أو تدخل من قبل ناهض مع مقايسة مضان.
  4. احتضان عند 39 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون (4٪).
  5. إضافة منبهات بتركيزات المطلوبة وخلية منفذة صبغ الحمض النووي. ملاحظة سوف تختلف بين مختلف الأصباغ الحمض النووي تركيز الأمثل للخلية الصبغة غير منفذة. ينبغي أن تدرج غير حفز ضوابط التي يتم استبدال منبهات التي كتبها حجم مساو من وسائل الإعلام في كل تجربة.
    ملاحظة: من المستحسن أن تخفف منبهات في كميات مماثلة من مستنبت للحفاظ على ظروف ثابتة بين الآبار. أحجام جيدا النهائية من 200 ووقد استخدمت ل بنجاح وإذا تم تغيير هذا، وأيضا كميات ينبغي أن تظل مطابقة لجميع الشروط؛ # 181. يمكن استخدام Phorbol-12-ميريستيت-13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) (تركيز النهائي ≥0.1 ميكرومتر) أو الصفيحات تفعيل عامل (القوات الجوية الباكستانية) (تركيز النهائي ≥31 ميكرومتر) كما الضوابط الإيجابية. وينبغي قياس منبهات على الأقل في مكررة.
  6. احتضان عند 39 درجة مئوية. قياس مضان باستخدام قارئ صفيحة بعد 2 ساعة أو على فترات المطلوب. لاحظ أن الفترات الزمنية المثلى سوف تختلف مع منبهات المستخدمة.
    ملاحظة: الطول الموجي يعتمد على الصبغة المستخدمة.
  7. طرح مضان فارغة قبل احتساب متوسط ​​مضان.
  8. للسماح للمقارنة بين الأفراد وبين لوحات، وحساب تغيير أضعاف في مضان بقسمة متوسط ​​مضان من الآبار يحفزه على مضان يعني من الآبار غير حفز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، يجب أن يكون هناك تغيير أضعاف القوي في مضان بعد تحفيز العدلات مع الضوابط الإيجابية، سلطة النقد الفلسطينية والقوات الجوية الباكستانية. كما هو موضح في الشكل 1B، وتحفيز العدلات الكلاب مع 31 ميكرومتر القوات الجوية الباكستانية ل1 النتائج ساعة في زيادة 4.0 أضعاف متوسط في مضان مقارنة مع الخلايا غير حفز (المدى 2،0-5،8، ن = 5 الكلاب) 18. سلطة النقد الفلسطينية عند 0.1 ميكرومتر (الشكل 1A) هو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

فحص الحمض النووي الإفراج قدم هو فحص للقياس بسهولة للالحمض النووي خارج الخلية. تم تعديل طريقة من تقنيات مشابهة تستخدم لتقييم تشكيل NET في الأنواع الأخرى، ولكن تم تغيير السرعات الطرد المركزي، وتركيزات ناهض وحضانة مرات لتحسين طريقة للاستخدام مع العدلات الكلاب 8،17،18. يمكن إجراء تعديلات مماثلة على التكيف مع طريقة لأنواع أخرى. الفحص غير واضحة وغير مكلفة بالمقارنة مع الطرق الأخرى لقياس NETosis مثل التدفق الخلوي أو تحليل الصور. الطريقة أيضا لا يتطلب الأجسام المضادة ضد مكونات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

يعرب المؤلفون عن تقديرهم للدكتورين جيمس روث وويليام نوسيف وكايوكو كيمورا والسيد توم سكادو للمساعدة في تطوير بروتوكولات عدلات. RDG مدعوم من قبل مرجع زمالة Wellcome Trust: WT093767MA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب دم كامل بلاستيكي مطلي بالرش K2< / sub>EDTABD367835
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771
Dextran-500شركة كيميائية وعلمية دقيقة.AN228410
محلول ملحيبالفوسفات ThermoFisher 20012043
مصل عجل البقر الجنيني ، معطل بالحرارةThermoFisher Scientific10100139
RPMI Media 1640 ، بدون الفينول الأحمر أو L-glutamineThermoFisher Scientific32404-014يجب أن يكون خاليا من الفينول الأحمر
96 صفيحة البوليسترين المعقمة ذات القاعالمسطح فالكون353072
Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP1585
عامل تنشيط الصفائحالدموية Sigma-AldrichP4904
SYTOX صبغة الحمض النووي الأخضرThermoFisher ScientificS7020
Synergy 2 قارئ متعدد الأوضاعBioTekNA
مخزن علمي

المراجع

  1. Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673(2015).
  2. Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
  3. Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
  4. Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
  5. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  7. Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
  8. Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
  9. Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
  10. Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627(2014).
  11. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  12. Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
  13. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
  14. Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
  15. Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
  16. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
  17. Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12(2013).
  18. Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
  19. McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة