مقالة منهجية

إنتاج بسيطة وفعالة وتنقية ماوس المايلين دبقية قليلة التغصن البروتين السكري لالتجريبية المناعة الذاتية الدراسات التهاب الدماغ

DOI:

10.3791/54727

⸱

أكتوبر 27, 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Western University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا بسيطا يستخدم معدات المختبر الأساسية فقط لتوليد وتنقية كميات كبيرة من بروتين الاندماج الذي يحتوي على بروتين سكري للفأر المايلين قليل التغصن. يمكن استخدام هذا البروتين للحث على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي الذي تقوده كل من الخلايا التائية والبائية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مزمن يصيب الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، ويعتقد أنه يحدث نتيجة لاستجابات المناعة الذاتية التي تستهدف المايلين. التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو النموذج الحيواني الأكثر شيوعا لأمراض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي ، وعادة ما يتم تحفيزه عن طريق التحصين باستخدام الببتيدات القصيرة التي تمثل حواتم الخلايا التائية CD4 + T المهيمنة للمناعة لبروتينات المايلين. ومع ذلك ، تتعرف الخلايا البائية على البروتين غير المعالج مباشرة ، والتحصين بالببتيد القصير لا ينشط الخلايا البائية التي تتعرف على البروتين الأصلي. نظرا لأن التجارب السريرية الحديثة للعلاجات المستنفدة للخلايا البائية في مرض التصلب العصبي المتعدد قد اقترحت دورا للخلايا البائية في دفع المرض لدى البشر ، فهناك حاجة ملحة لنماذج حيوانية تتضمن التعرف على الخلايا البائية للمستضد الذاتي. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بإنشاء بروتين اندماج جديد يحتوي على المجال خارج الخلية لنسخة الفأر من البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) بالإضافة إلى اندماجات N-terminal من علامة His-tag لأغراض التنقية وبروتين الثيوريدوكسين لتحسين الذوبان (علامة MOG). تم دمج موقع انقسام البروتياز لفيروس حفر التبغ (TEV) للسماح بإزالة جميع تسلسلات العلامات ، ولم يتبق سوى مجال MOGالنقي 1-125 خارج الخلية. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا يستخدم معدات المختبرات القياسية فقط لإنتاج كميات كبيرة منعلامة MOG النقية أو MOG1-125. يولد هذا البروتوكول باستمرار أكثر من 200 مجم من بروتينعلامة MOG. يولد التحصين باستخدامعلامة MOG أو MOG1-125 استجابة مناعية ذاتية تشمل الخلايا البائية المسببة للأمراض التي تتعرف على MOG الفأر الأصلي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصلب العصبي المتعدد هو مرض يصيب الإنسان تتميز التهاب مزمن والتنكس العصبي للجهاز العصبي المركزي والتي يعتقد أن تكون مدفوعة من قبل رد فعل المناعة الذاتية الموجهة نحو المايلين. فقدان المايلين ومحاور مع مرور الوقت تؤدي إلى الانحسار التدريجي لالمعرفية والحركية وظيفة 1. "التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ" هو مصطلح شامل لنماذج حيوانية من أمراض المناعة الذاتية الموجهة نحو الجهاز العصبي المركزي المايلين. مثل MS الإنسان، وعادة ما يتميز EAE بواسطة تسلل الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي، وفي بعض الحالات، إزالة الميالين 2. ومع ذلك، فإن الدرجة التي تشبه أي نموذج EAE نظرا MS البشري في جزء يعتمد على نوع أو سلالة المستخدمة وعلى مدى تعقيد استجابة المناعة الذاتية الكامنة مكافحة المايلين.

المناعة الذاتية مكافحة الميلين يمكن أن يتسبب تجريبيا في العديد من الطرق، ولكن الأسلوب الأكثر شيوعا اليوم هي لتحصين الفئران مع الببتيد قصيرة من الأحماض الأمينية محاكاة CD4 سائد مناعيا + الخلايا التائية حاتمة للبروتين النخاعين. وهذا يمثل الحد الأدنى المطلوب للحث على الاستجابة المسببة للأمراض. ولعل الأكثر شيوعا من هذه هو الببتيد حمض أميني 21 مشتقة من بروتين سكري المايلين دبقية قليلة التغصن (MOG 35-55)، والذي يستخدم للحث على EAE في C57BL / 6 الفئران 3. ومع ذلك، بالنسبة لبعض أغراض تجريبية من المرغوب فيه أو حتى من الضروري تحصين مع مستضدات بروتين أكبر وبالفعل هناك العديد من المزايا لهذا على تحصين مع الببتيد قصيرة. أولا، بسبب تقييد MHC، الببتيدات قصيرة وعادة ما تكون فعالة إلا في نطاق محدود جدا من السلالات، بينما أكبر مستضدات البروتين تمثل إما البروتين الكامل أو مجال معين يمكن معالجة عادة لعرضها في عدة سلالات الفئران الفطرية أو حتى في أنواع مختلفة 4. ثانيا، مستضد بروتين أكبر قادر على إحداث استجابة مناعية أكثر تعقيدا تضم ​​أكثر من أنواع الخلايا الليمفاوية في الاعتراف مستضد، بدلا من limitinز مستضد الاعتراف لخلايا CD4 + T. على سبيل المثال، الخلايا البائية عبر من مستقبلات الخلايا البائية (BCR) تتفاعل مباشرة مع كامل بدلا من معالجتها البروتين. نحن وآخرون قد أظهرت أن الخلايا البائية تفعيلها من خلال MOG 35-55 التحصين لا تعترف البروتين MOG 5. منذ تجلت الخلايا البائية مؤخرا للعب دور الممرضة في MS البشري 6، نماذج EAE التي تتضمن الخلايا البائية في أمراض المناعة الذاتية هي ذات أهمية متزايدة.

وعلى الرغم من مزايا استخدام المضادات البروتين أكبر للحث على EAE، لا تزال هناك بعض المصادر المتاحة تجاريا لهذه البروتينات. في الواقع، في حين أن الببتيدات القصيرة مثل MOG 35-55 يمكن توليفها بشكل سريع جدا وبتكلفة منخفضة نسبيا، والخيارات التجارية للبروتين MOG محدودة والتكلفة إلى حد كبير أكثر لشراء. ومع ذلك، هناك العديد من ناقلات التعبير المتاحة للمجموعات بحثية لتوليد MOG نطاق خارج الخلية (MOG 1-125) أنفسهم. Howeveص، وتقوم كل الأنظمة التعبير التي حددناها في الأدب على التقنيات القديمة التي منذ تم استبدال أنظمة التعبير أكثر كفاءة 7. وعلاوة على ذلك، تعتمد في الغالب على الفئران أو الإنسان MOG 8. بالنسبة لبعض التحقيقات من المناعة الذاتية في الفئران، مستضد على أساس مستضد ذاتي الماوس MOG هو الأفضل. وأخيرا، جميع البروتينات على أساس MOG التي حددناها، سواء التجارية أو ناقلات التعبير، هي البروتينات الانصهار التي تحتوي على الأحماض الأمينية إضافية إلى قاعدة MOG 1-125. وتشمل هذه شعارا لتنقية وتسلسل عادة أخرى أيضا، وكثير منها مع وظيفة لم نتمكن من التعرف عليها.

لمعالجة هذه القيود، ولدت لنا بروتين الانصهار رواية تقوم على الماوس MOG نطاق خارج الخلية لتنصهر علامة تحتوي على thioredoxin لمكافحة الذوبان معروفة من البروتين MOG 5. يحتوي على تسلسل العلامة أيضا تسلسل 6xHis لتنقية والبروتياز شركة كلي TEVموقع avage التي تسمح لإزالة كاملة من جميع تسلسل علامة، إذا رغبت في ذلك. هذا هو الأسلوب الوحيد الذي ندرك لتوليد النقي MOG 1-125 البروتين. لتسهيل إنتاج كميات كبيرة من البروتين، وتسلسل MOG 1-125 كان كودون الأمثل للتعبير عن البكتيريا وتم إدراج MOG البروتين العلامة الاندماج في النظام التعبير PET-32. هنا، نحن تصف بالتفصيل بروتوكول لإنتاج وتنقية MOG العلامة البروتين، وزارة النفط والغاز النقي 1-125، وذلك باستخدام المعدات غير المتخصصة المتاحة لمعظم مختبرات علم المناعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البروتين التعريفي

ملاحظة: في الخطوات التالية، BL21 القولونية بكتيريا القولونية تحولت مع ناقلات PET-32 التي تحتوي على تسلسل للبروتين العلامة MOG الانصهار (انظر المرجع 5) والشكل (1) تزرع على كثافة عالية ومن ثم يتم يسببها للتعبير عن MOG العلامة البروتين . انظر الشكل 2 لجدول زمني العام - لاحظ أن الأيام وأشار نقاط وقف التقريبية وبديلة في البروتوكول. إذا بدءا من تنقية الحمض النووي للحيوانات الاليفة 32 MOG العلامة ناقلات، وسوف يكون من الضروري لتحويل كيميائيا إلى المختص BL21 E. البكتيريا القولونية باستخدام اختيار الأمبيسلين، كما تم وصفها بشكل جيد 9. التحول الناجح يمكن التأكد من تنقية الحمض النووي من البكتيريا المحدد باستخدام مجموعة تجارية القياسية، تليها الهضم مع تقييد الانزيمات AGE1 وSac1 لإنتاج الفرقة 424 نقطة أساس على هلام الاغاروز 10.

    تلقيح 5 مل من عقيم استذابة مرق (LB) مرق (0.1 ملغ الأمبيسلين / مل) مع الأسهم العلامة الجلسرين BL21-MOG واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة.
  1. وضع اثنين 1 قوارير L مخروطي يحتوي على 500 مل من معقم مرق LB في الحاضنة 37 درجة مئوية في إعداد لليوم التالي.
  2. إضافة 500 ميكرولتر من 100 ملغ / مل الأمبيسلين إلى كل من قوارير تحتوي على 500 مل LB من الخطوة 1.2 (نهائي تركيز 0.1 ملغ / مل الأمبيسلين). نقل 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها من الخطوة 1.1 إلى كل من اثنين من قوارير من مرق LB. احتضان عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 5 ساعة أو ما يصل إلى الكثافة البصرية من 0.6.
  3. تأخذ واحدة 1 مل قسامة من واحدة من قوارير وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل منفصل. بيليه الخلايا في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف. تسمية أنبوب كما T 0 (قبل الاستقراء) ومن ثم وضع بيليه البكتيرية إلى -20 درجة مئوية الثلاجة لمدة المستقبل الصوديوم دوديسيل هلام كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-باغE) التحليل (انظر القسم 8) والشكل (3).
  4. إضافة 0.5 مل من 1 M الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside، الآيزوبروبيل β-D-thiogalactoside (IPTG) إلى كل قارورة الثقافة. احتضان قوارير عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة، ثم في درجة حرارة الغرفة في 75 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها.

2. حصاد MOG العلامة البروتين

ملاحظة: في هذه المرحلة، سيكون قد تنتج البكتيريا كميات كبيرة من MOG العلامة البروتين. حصاد العلامة MOG، وهي lysed البكتيريا لأول مرة في منطقة عازلة تريتون X-100 تليها صوتنة. ثم يتم تحرير MOG العلامة من الهيئات إدراج والتشويه والتحريف مع ايميدازول وغوانيدين، مما أدى إلى حل البروتين الخام التي تحتوي على علامة MOG البروتين.

  1. تأخذ واحدة 1 مل قسامة من واحدة من الثقافات بين عشية وضحاها من الخطوة 1.5 وتحويلها إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. بيليه الخلايا في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف. تسمية الحوضالبريد T O / N (بعد الاستقراء) ثم وضع بيليه البكتيرية في الثلاجة -20 درجة مئوية لتحليل صفحة المستقبل SDS (الشكل 3).
  2. توزيع الثقافات بالتساوي بين 250 مل الزجاجات متوافقة مع ارتفاع سرعة الطرد المركزي وإبقاء هذه على الجليد من هذه النقطة إلى الأمام. بيليه الخلايا البكتيرية في 22000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. تجاهل طاف. تخزين الكريات البكتيرية عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة 2.4.
  4. إعداد العازلة تحلل (0.1 ملغ / مل الليزوزيم الدجاجة بيضة، 0.1٪ تريتون-X (ت / ت) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)) وذلك بإضافة 60 ميكرولتر من تريتون X-100 و 120 ميكرولتر من 50 ملغ / مل الدجاجة بيضة الليزوزيم حل سهم إلى 60 مل من برنامج تلفزيوني.
  5. و resuspend وتجمع بين كل من الكريات البكتيرية من الخطوة 2.3 في ما مجموعه 30 مل من تحلل العازلة. نقل هذا الكتاب إلى جولة أسفل أنبوب 50 مل قادرة على ارتفاع الطرد المركزي بسرعة. وضع هذا الأنبوب في 30 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة، ويهز أنبوبمرتين لresuspend الخلايا.
  6. بعد الحضانة، ونقل أنبوب على الجليد ويصوتن الحل في 20 كيلو هرتز، السعة 70٪، والنبض في 3 ثانية، نبض من 3 ثوان، وخمسة البقول في كل جولة. يصوتن الحل لمدة ستة مجموع الجولات والسماح للحل لتبرد على الجليد في الفترات الفاصلة بين الدورات.
  7. أجهزة الطرد المركزي الحل في 24000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف وكرر الخطوات من 2،5-2،7 مرة واحدة. تخزين بيليه في -20 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة 2.8.
  8. إعداد العازلة ألف (500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 5 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 7.9) وذلك بإضافة 0.8766 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.09456 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك، و0.01021 غرام من ايميدازول إلى دورق 100 مل. إضافة H 2 O حتى يصل إلى حجم 28 مل ثم ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7.9. ثم، ونقل الحل إلى 100 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى حجم 30 مل.
  9. resuspend الكرية من الخطوة 2.7 في 30 مل من العازلة ألف واحتضان هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. خلال هذا الوقتتزن من 17.2 غرام من غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك.
  10. يصوتن الحل على الجليد باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوة 2.6. ثم إضافة 17.2 غرام من غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى حل. احتضان هذا على الجليد لمدة 1 ساعة لإذابة البروتين العلامة MOG.
  11. أجهزة الطرد المركزي الحل في 24000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع طاف وتخزين طاف في 4 درجات مئوية حتى تنقية البروتين.

3. البروتين تنقية

ملاحظة: في الخطوات التالية سيتم تنقيته من MOG العلامة البروتين من خلال 4 جولات من امتصاص على الراتنج النيكل اتهم (عن طريق صاحب العلامة) وشطف.

  1. جعل المخازن وبعد:
    1. إعداد B الاحتياطي (500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 5 ايميدازول ملم، 6 M غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9). إضافة 5.844 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.6304 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك، 0.0681 غرام من إميدازول و114.64 ز غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى كوب 500 مل. ثم إضافة H 2 O حتى تصل إلى 190 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.9. نقل سولution إلى 250 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى حجم 200 مل.
    2. إعداد عازلة شطف (500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 0.5 M إميدازول 6 M غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9). إضافة 5.844 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.6304 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك، 6.808 غرام من إميدازول و114.64 ز غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى 500 مل دورق. إضافة H 2 O حتى تصل إلى 190 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.9. نقل الحل إلى 250 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى حجم 200 مل.
    3. إعداد عازلة قطاع (500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 100 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 7.9). إضافة 5.844 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.6304 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك، 40 مل 500 ملي EDTA إلى 500 مل دورق. إضافة H 2 O حتى تصل إلى 190 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.9. نقل الحل إلى 250 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى حجم 200 مل.
    4. إعداد المسؤول عازلة (0.1 م كبريتات النيكل). إضافة 5.257 غ كبريتات النيكل إلى مل دورق 500 و إضافة H 2 O حتى تصل إلى 190 مل (تنبيه، لا تتعامل مع النيكلتم حل كبريتات خارج غطاء الدخان حتى كبريتات النيكل في H 2 O). مرة واحدة وقد حل كبريتات النيكل، ونقل الحل إلى 250 مل تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى يصل حجم 200 مل.
  2. تقسيم 10 مل من الراتنج النيكل بين اثنين مخروطية 50 مل أنابيب الطرد المركزي قادرة على تحمل قوى الطرد المركزي أكثر من 4،500 x ج (5 مل في كل أنبوب).
  3. تهمة ويوازن الراتنج النيكل:
    1. غسل الراتنج وذلك بإضافة 40 مل H 2 O إلى كل أنبوب يحتوي على الراتنج. وضع أنابيب أفقيا على الكرسي الهزاز والسماح لهم تستنهض الهمم لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بمجرد الانتهاء، أنابيب الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
    2. تجاهل طاف قبل pipetting لتجنب إزعاج بيليه. إضافة 40 مل من العازلة تهمة إلى كل أنبوب. نقل الأنابيب على الكرسي الهزاز والسماح لهم تستنهض الهمم لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. بمجرد الانتهاء، أنابيب الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. تجاهل طاف ثم إضافة 40 مل من B العازلة للأنابيب. نقل الأنابيب على الكرسي الهزاز والسماح لهم تستنهض الهمم لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بمجرد الانتهاء، أنابيب الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية ثم تجاهل supernatants.
  4. اختياري: خذ 150 ميكرولتر من البروتين بالفاعلات التي تم جمعها في الخطوة 2.11 وتحويلها إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. تسمية أنبوب ما قبل الحضانة وتجميد هذا في -20 درجة مئوية لتحليل صفحة المستقبل SDS (الشكل 3، العلامة الخام MOG).
  5. تنقية العلامة MOG البروتين:
    1. نقل وحدة التخزين بالكامل من البروتين بالفاعلات من الخطوة 2.11 (~ 40 مل، ناقص عينة صغيرة إزالتها في الخطوة 3.4) إلى الأنبوب الأول (الشكل 2، أنبوب 1) التي تحتوي على الراتنج النيكل من الخطوة 3.3، مزيج، ووضع أفقي على الكرسي الهزاز عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. أنبوب الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. الانتهاء مرة واحدة، ونقل طاف للثانيأنبوب (الشكل 2، أنبوب 2) من الراتنج النيكل واحتضان كما هو موضح في الخطوة السابقة. في غضون ذلك، متابعة الخطوات 3-6 أدناه مع أنبوب 1.
    3. Resuspend والراتنج النيكل في أنبوب 1 في 40 مل من شطف العازلة ووضع أنبوب أفقيا على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. نقل طاف تحتوي على بروتين مزال العلامة MOG في زجاجة مل 250 المسمى "النقي العلامة MOG البروتين والحفاظ على هذه الزجاجة في 4 درجات مئوية. مع كل خطوة شطف، تجمع طاف الناتجة في هذه الزجاجة.
    5. إضافة 40 مل من العازلة الشريط إلى الراتنج النيكل ووضع أفقي على الكرسي الهزاز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. أنبوب الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، ثم إعادة شحن الراتنج النيكل كما هو موضح في الخطوة 3.3.
    7. بمجرد الانتهاء، المضي قدما في أنبوب الثاني كما هو موضح في الخطوة 3.5. ما مجموعه 4 جولةالصورة من امتصاص البروتين بالفاعلات من الخطوة 2.11 على الراتنج النيكل اتهم وشطف سوف تسترد أكثر من البروتين على الرغم من ذلك، إذا رغبت في ذلك، يمكن استرداد بروتين إضافي في جولات إضافية من امتصاص وشطف.
  6. مرة واحدة أربعة (أو أكثر) جولات من امتصاص وشطف كاملة، وتخزين البروتين المنقى المجمعة في 4 درجات مئوية خلال الليل. الراتنج النيكل يمكنك خزنها في 40 مل من محلول الإيثانول 20٪ في 4 درجات مئوية حتى الحاجة إليه مرة أخرى.

4. قياس كثافة البروتين

ملاحظة: قبل المضي قدما من الضروري قياس كمية من البروتين النقي العلامة MOG ولدت في القسم 3. سيتم استخدام هذه القيمة لتحديد الحجم النهائي للتركيز هذا البروتين في نهاية البروتوكول. نحن تصف برادفورد الفحص القياسية هنا. يتم تحديد تركيز البروتين المنقى العلامة MOG بمقارنة الامتصاصية الطيفي متسلسل مخففإد MOG العلامة البروتين لمنحنى مستوى الزلال المصل البقري (BSA) بتركيز معلوم.

  1. جعل 10X العازلة خلات بإضافة 23 مل حامض الخليك الجليدي إلى 8.2 غ خلات الصوديوم في كوب 3 L ثم قم بإضافة 1.9 L من H 2 O بحل خلات الصوديوم. نقل هذا الحل إلى 2 لتر تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى يصل حجم 2 L. ثم تخزينه في زجاجة 2 لتر في درجة حرارة الغرفة. جعل 1 مل من العازلة خلات 1X بإضافة 100 ميكرولتر من 10X العازلة خلات إلى 900 ميكرولتر من H 2 O.
  2. إعداد لوحة 96-جيدا لالتخفيفات بإضافة 30 ميكرولتر من العازلة خلات 1x إلى الآبار G2-8 و 60 ميكرولتر إلى G9. إضافة 48 ميكرولتر من العازلة خلات 1x إلى H2 و H3.
  3. إعداد التخفيف المتسلسل الأولي للمستوى BSA في الصف G كما يلي: إضافة 216 ميكرولتر من العازلة خلات 1X و 54 ميكرولتر من المتاحة تجاريا 2 ملغ القياسية / مل BSA في G1 جيدا وتخلط جيدا. إضافة 210 ميكرولتر من G1 جيدا ان G2 جيدا، تخلط جيدا،ثم قم بإضافة 180 ميكرولتر من G2 جيدا ان G3 بشكل جيد. إضافة 150 ميكرولتر من G3 جيدا ان G4 جيدا، تخلط جيدا، ويستمر هذا الاتجاه إضافة 30 ميكرولتر أقل على كل بئر لاحقة حتى G8 جيدا. (انظر الجدول رقم 1 لقوائم عوامل التخفيف ما يعادلها).
  4. إعداد العينات ثلاث نسخ من كل تخفيف من خلال نقل 10 ميكرولتر من G1 جيدا ان الآبار A1 و B1 و C1، و 10 ميكرولتر من G2 جيدا ان الآبار A2، B2، و C2، وهلم جرا. استخدام ماصة الأقنية.
  5. لإعداد التخفيفات العلامة MOG، إضافة 60 ميكرولتر من تنقية البروتين العلامة MOG من الخطوة 3.6 إلى H1 جيدا. إضافة 12 ميكرولتر من H1 جيدا إلى ما H2، تخلط جيدا، ثم إضافة 12 ميكرولتر من H2 جيدا إلى ما H3، تخلط جيدا (وهذا ينتج عنه تخفيف 1X في H1 و 1/5 التخفيف في H2، و1/25 التخفيف في H3) .
  6. إعداد العينات ثلاث نسخ للعلامة MOG التخفيفات عن طريق نقل 10 ميكرولتر من الآبار H1-H3 إلى صفوف D، E و F، كما هو موضح في الخطوة 4.4.
  7. مزيج 2 مل من صبغة البروتين مقايسة التركيز كاشف مع 8 مل من H 2 O. إضافة 200 ميكرولتر من هذا الخليط لجميع الآبار التي تم تحميلها مسبقا في صفوف A، B، C، D، E، F و، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، إذا كانت متوفرة. البوب ​​أي فقاعات في الآبار باستخدام إبرة قبل قراءة تركيز البروتين.
  8. في غضون 10 دقيقة من إضافة كاشف صبغ، وقياس الامتصاصية 595 نيوتن متر من جميع الآبار في صفوف A، B، C، D، E، و F.
  9. استخدام الصفوف A، B، و C لإنشاء منحنى القياسية حيث المواقف 1-9 تتوافق مع 0.4، 0.35، 0.3، 0.25، 0.2، 0.15، 0.1، 0.05، و0 ملغ / مل BSA. واستنادا إلى هذا المنحنى، وحساب تركيز MOG العلامة البروتين باستخدام التخفيف من العلامة MOG الذي يناسب المنحنى القياسي. عادة، سوف يكون هناك 200-250 ملغ من MOG العلامة البروتين من 1 لتر من ثقافة البكتيرية باستخدام وصف بروتوكول هنا.
    ملاحظة: لجعل MOG 1-125 ننطلق من هنا إلى قسم اختياري 7 المدرجة في نهاية البروتوكول. خلاف ذلك، تابع إلى القسم 5.

معشوقة = "jove_title"> 5. غسيل الكلى

ملاحظة: يتم تنفيذ غسيل الكلى لإزالة غوانيدين تدريجيا من محلول يحتوي على النقاء، التشويه والتحريف العلامة MOG للسماح للبروتين لrefold. يجب توخي الحذر خلال هذه الخطوة كما MOG نفسها غير قابلة للذوبان جدا، وعلى الرغم من هذا هو تحسن من وجود علامة thioredoxin، فإنه لا يزال عرضة للخروج من الحل. لذلك، refolding ينبغي أن يقوم تدريجيا وعلى منخفض نسبيا تركيز العلامة MOG.

  1. قبل البدء في غسيل الكلى، وتمييع المطهرون MOG العلامة البروتين مع العازلة ب (يمكن أن يتم كما هو موضح في الخطوة 3.1 B العازلة) حتى تركيز 0.5 ملغ / مل أو أقل، على أساس كمية من البطاقات MOG المحسوبة في القسم 4.
  2. قطع ما يقرب من 30 سم من جلد الثعبان غسيل الكلى أنابيب وتأمين نهاية واحدة مع مرقئ تأمين من قبل للطي نهاية جلد الثعبان أكثر من ثلاث مرات، وتحامل على نهاية مطوية مع مرقئ. ملء جلد الثعبان مع مخففةالعلامة MOG البروتين (بين 60 الى 90 مل من MOG العلامة البروتين لكل أنبوب) ثم إزالة فقاعات الهواء من جلد الثعبان من قبل اجبارهم على الخروج من نهاية مفتوحة. وأخيرا، ختم الطرف الآخر من الأنبوب باستخدام مرقئ قفل الثاني.
  3. كرر الخطوة 5.2 لملء أقسام إضافية من أنابيب غسيل الكلى حتى يتم نقل جميع MOG العلامة البروتين في أنابيب الثعبان غسيل الكلى. تأكد من عدم وجود تسرب.
  4. جعل خلات 1X مع 4 M غوانيدين وزنها عن طريق 382،12 غرام من غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك وإضافة 100 مل من العازلة 10X خلات في الخطوة 4.1 إلى دورق 2 لتر. إضافة 0.5 لتر من H 2 O إلى الكأس والسماح للغوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى حل. مرة واحدة حله، ونقل الحل إلى 1 لتر تخرج اسطوانة وإضافة H 2 O حتى يصل حجم 1 L. كرر هذه الوصفة لكل 2 snakeskins المطلوبة.
  5. أداء غسيل الكلى على النحو التالي: ملء دلو كبير (الحد الأدنى 10 لتر) مع 1 لتر من العازلة خلات 1X مع 4 M غوانيدين من الخطوة 5.4. وضع ما يصل رس 2 أجزاء من أنابيب غسيل الكلى تحتوي على العلامة MOG في دلو، مما يترك مجالا لشريط مغناطيسي تدور دون عوائق في القاع. وضع دلو في غرفة C 4 درجات على لوحة تحريك مغناطيسي وتحويلها إلى معدل دوران بطيء (أي ليست عالية، ما يكفي لتحريك السوائل):
    ملاحظة: نفذ الخطوات التالية للحد تدريجيا من كمية غوانيدين في المخزن المؤقت. وتعطى مرة ضجة كما الحد الأدنى، ولكن يمكن أن تترك ليلة وضحاها. وغسيل الكلى تأخذ ما لا يقل عن 3 أيام، ولكن يمكن تمديد هذه الفترة اذا شئت. تحقق بانتظام للتأكد من أن أنابيب سليمة وأن الغاية مغلقة بإحكام.
    1. السماح للدلو يجلس ويقلب لمدة 4-5 ساعة.
    2. إضافة 1 لتر من العازلة خلات 1X (100 مل 10X العازلة خلات و 900 مل من H 2 O) على كل دلو.
    3. كرر الخطوات من 5.5.1 و 5.5.2 ما مجموعه 3 مرات ليصبح المجموع 4 لتر من العازلة في دلو.
    4. تجاهل نصف عازلة في دلو وإعادة ملء مع 1 لتر من العازلة خلات 1X (100 مل 10X العازلة خلات و 900 مل من H 2 O، لا غوانيدين) وإعداد أنابيب ويقلب شريط.
    5. كرر الخطوات من 5.5.1 و 5.5.2 مرة واحدة (أي حتى يكون هناك ما مجموعه 4 لتر من العازلة في دلو).
    6. وأخيرا، استبدال كامل حجم 4 لتر في وعاء مع 4 لتر من العازلة 1X خلات جديدة والسماح ضجة لمدة 4-5 ساعة. للحصول على أفضل النتائج، القيام بهذه الخطوة في اليوم من تركيز البروتين.
    7. إزالة بعناية أنابيب غسيل الكلى مع العلامة MOG refolded وتجاهل عازلة دلو.

6. التركيز MOG العلامة البروتين

ملاحظة: في الخطوة الأخيرة، ويتركز refolded MOG العلامة البروتين لتخفيف العمل للتخزين. كما MOG البطاقة هي غير قابلة للذوبان جدا، فإنه لا ينبغي أن يتجاوز 5 ملغ / مل. هذا التركيز هو متساوي المولية تقريبا مع 0.4 ملغ / مل MOG 35-55 الببتيد، والذي يستخدم عادة للحث على EAE في الفئران (مختلطة 1: 1 مع كامل adjuv فرويندالنمل (CFA)). وخلال عملية الاعتقال ليس من غير المألوف لكمية صغيرة من البروتين للخروج من الحل في شكل راسب أبيض. هطول المفرط هو المشكلة، ولكن.

  1. حساب الحجم النهائي المطلوب لتحقيق تركيز العلامة MOG من 5 ملغ / مل، استنادا إلى القيمة المحسوبة في القسم 4.
  2. خط مقلاة مع رقائق الألومنيوم وتشمل رقائق الألومنيوم مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG) 3350 وPEG 8000 في نسبة 1: 1. وأدرجت PEG 3350 إلى هذا الخليط لأنها يمكن أن تساعد على منع تراكم البروتين خلال التركيز وغير فعال cyropreservative 11.
  3. وضع أنابيب الثعبان (مع MOG العلامة البروتين داخل) على أعلى من رقائق الألومنيوم، وتغطي مع PEG 8000. ولهذا الاعتصام في درجة حرارة الغرفة والتحقق من حجم بانتظام حتى حجم يساوي أو أقل من الحجم النهائي المقدرة (المحسوبة في الخطوة 6.1)، وسوف يقاس الحجم الفعلي في الخطوة التالية. إذا أصبح عموممشبعة بالماء أثناء عملية الاعتقال، وإنشاء عموم جديدة مع رقائق الألومنيوم وPEG 3350 وPEG 8000.
  4. غسل خارج snakeskins مع H 2 O ونقل البروتين العلامة MOG لزجاجة منفصلة باستخدام ماصة المصلية. تتبع حجم كما يتم نقل البروتين لضمان وحدة التخزين الصحيح.
    1. إذا تم تخفيض حجم أقل من الحجم النهائي المقدرة، إضافة عازلة خلات 1X حتى يتم الوصول إلى حجم المطلوب. وإذا كان حجم فوق الحجم النهائي المقدرة، نقل العلامة MOG البروتين مرة أخرى في أنابيب غسيل الكلى ومواصلة تركيز (الخطوات 6،2-6،3).
    2. توزيع العلامة MOG البروتين بين 1.5 مل أنابيب (0.5 مل لكل أنبوب)، وتخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. للحث على EAE، هذا المزيج حجم 1: 1 مع CFA.
  5. تشغيل هلام صفحة SDS لتأكيد التعبير عن العلامة MOG البروتين باستخدام عينات أخذت في 1 الخطوات.4، 2.1، 3.4، وتنقية البروتين MOG من الخطوة 6.4.

7. توليد MOG 1-125 من MOG العلامة عن طريق TEV البروتيني (اختياري)

ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية وتستمر من نهاية الخطوة 4. إذا كان مطلوبا MOG 1-125 دون أي سمة تسلسل إضافية، ويمكن إزالتها تسلسل العلامة باستخدام TEV البروتيني (الشكل 4). بقدر ما نعلم، ليس هناك نظام التعبير الأخرى قادرة على توليد النقي MOG 1-125. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه من دون العلامة thioredoxin، MOG 1-125 غير قابلة للذوبان للغاية وهذا قد يسبب مشاكل أثناء تنقية ومعالجة، ولهذا السبب إزالة العلامة عند الضرورة القصوى لأسباب التجريبية. مطلوبة عدة خطوات لتوليد النقي MOG 1-125. ومدال MOG العلامة لأول مرة في TEV عازلة البروتيني الانقسام. بعد الهضم مع TEV البروتيني، يتم تقليل حجم للمساعدة في وقت لاحق تنقية الواحدالعائد على السهم، ثم مدال إلى B العازلة، ثم صاحب العلامة التي تحتوي على العلامة تسلسل وإزالتها باستخدام الراتنج النيكل. وأخيرا، وكميا البروتين ويتركز MOG النقي 1-125 إلى التركيز النهائي.

  1. جعل 1 لتر من العازلة 10X انشقاق TEV (500 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 5 ملي EDTA) وذلك بإضافة 1،861 ز EDTA، 44.4 غرام تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 26.5 جم تريس إلى دورق 2 لتر. إضافة H 2 O حتى يصل حجم 990 مل ثم ضبط درجة الحموضة إلى 8 إلى حل EDTA. نقل الحل إلى 1 لتر تخرج اسطوانة وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر باستخدام H 2 O.
  2. تمييع MOG العلامة البروتين من الخطوة 3،6-0،5 ملغ / مل باستخدام B العازلة (المخزن نفسه هو موضح في الخطوة 3.1)، استنادا إلى كمية من البروتين المحسوبة في القسم 4. نقل 120 مل من المخفف البروتين العلامة MOG إلى الثعبان غسيل الكلى أنابيب كما وصفها في خطوات 5،2-5،3. يمكن زيادتها رفع مستوى الصوت ولكن كمية TEV البروتيني اللازمة ليلتصق كل من العلامة MOG البروتين سوف يكون substantial.
  3. متابعة بروتوكول غسيل الكلى المذكورة في الخطوة 5.5، باستثناء استبدال العازلة 10X خلات مع عازلة انشقاق 10X TEV في الخطوة 7.1.
  4. نقل العلامة MOG، الآن في TEV عازلة انشقاق، لزجاجة جديدة زجاج 250 مل ورصد زيادة حجم من غسيل الكلى. إضافة 1 ميكرولتر من β-mercapto الإيثانول في كل 2.85 مل من MOG العلامة بروتين يضاف إلى زجاجة. إضافة على الأقل 1 ملغ من TEV البروتيني (الأسهم حل TEV في 5 ملغ / مل) لكل 50 ملغ من MOG العلامة بروتين (يمكن إضافة البروتيني TEV تصل إلى 01:10 TEV: نسبة البروتين MOG)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء لمدة 72 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: في نهاية البروتيني حضانة TEV، ينبغي أن ينظر إلى رواسب بيضاء في الجزء السفلي من زجاجة.
  5. قبل نقل البروتين لأنابيب غسيل الكلى، إضافة غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك إلى حل حتى تذوب البروتينات لمنع البروتين يترسب من التمسك زجاجة. نقل 150 ميكرولتر منهذا الحل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتسمية أنبوب بأنها "MOG مع TEV". تخزين الحل في -20 درجة مئوية لتحليل SDS-PAGE في المستقبل.
  6. نقل جميع السوائل من الخطوة 7.5 في أنابيب غسيل الكلى كما هو موضح في الخطوات 5،2-5،3. ملء دلو كبير مع 2 لتر من H 2 O ووضع أنبوب غسيل الكلى في دلو. احتضان هذا في 4 درجات مئوية مع ضوء اثارة بين عشية وضحاها. هذه الخطوة مهمة لتخفيف خارج غوانيدين للسماح للتركيز البروتين تحدث بسرعة وتبدأ إزالة EDTA من الحل الذي سوف تتداخل مع تنقية البروتين.
  7. تركيز البروتين في أنابيب غسيل الكلى كما هو موضح في الخطوات 6،2-6،3 (باستثناء استخدام فقط PEG 8000) بحيث الحجم النهائي من الحل هو ~ 40 مل. غسل أنابيب غسيل الكلى مع H 2 O وإزالة أي PEG المتبقية 8000 لا تزال تعلق على الأنبوب. هذا الانخفاض في حجم يجعل من الممكن لتناسب جميع من البروتين المهضوم إلى أنبوب 50 مل تحتوي على النيكل إعادةالخطيئة، كما هو موضح في الخطوة 3.5.
  8. Dialyze على البروتين المهضوم إلى B الاحتياطي:
    1. ملء دلو كبير مع 1 لتر من العازلة ب (29.22 جم كلوريد الصوديوم، 3.152 غرام تريس، حمض الهيدروكلوريك، 0.3405 ز إميدازول 573.18 غرام من غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9).
    2. وضع snakeskins تحتوي على البروتين المهضوم من الخطوة 7.7 في دلو جنبا إلى جنب مع المغناطيس ضجة (كما هو موضح بمزيد من التفصيل في الخطوة 5.5). وضع دلو إلى 4 درجات مئوية غرفة باردة على طبق من ضجة لتعيين ضجة بطيئة والسماح للsnakeskins إلى dialyze لمدة 5 أو أكثر من ساعة.
    3. تفريغ دلو وإعادة ملء مع 1 لتر آخر من B العازلة وترك هذا الجلوس في غرفة C 4 درجات الباردة على طبق من ضجة لتعيين ضجة بطيئة والسماح للsnakeskins إلى dialyze لمدة 5 أو أكثر من ساعة.
  9. أداء تنقية MOG 1-125 البروتين كما هو مفصل في الباب 3، مع فارق مهم من شأنها أن تكون ملزمة تسلسل العلامة المشقوق من الراتنج النيكل، وترك MOG 1-125 في الحل. مرة أخرى، سوف 4 جولات من تنقية يكونتجرى على نفس الحجم، ولكن في هذه الحالة كان الهدف هو تحسين نقاء، بدلا من استعادة الكثير من البروتين ممكن. انظر الشكل 4.
    1. جعل مخازن تنقية البروتين المذكورة في الخطوة 3.1
    2. توجيه الاتهام كلا أنابيب من الراتنج النيكل كما هو موضح في الخطوة 3.3.
    3. تنقية MOG 1-125 من مفصل في خطوة 3.5، باستثناء الضروري أن شطافة من الراتنج النيكل التي تحتوي على بطاقة يتم تجاهل بروتوكول (الحفاظ على 150 ميكرولتر من شطافة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لتحليل SDS-PAGE المستقبل)، في حين يتم الاحتفاظ محلول يحتوي على MOG 1-125 كمنتج نهائي.
  10. قياس تركيز MOG 1-125 البروتين كما هو موضح في القسم 4:
    1. إعداد BSA التخفيفات منحنى القياسية كما هو موضح في الخطوات 4.2 و 4.4.
    2. إعداد التخفيفات من MOG 1-125 كما هو موضح في الخطوات 4.5 و 4.6. بدلا من ذلك، قد يكون من المفيد أن تولد مجموعة أكبرمن التخفيفات (1X، 1/2، 1/4، 1/8 وعلى سبيل المثال). ضبط كميات من العازلة خلات 1X و MOG 1-125 وفقا لذلك.
    3. أداء برادفورد الفحص كما هو موضح في الخطوات 4،7-4،9 وحساب كمية من MOG 1-125 إنشاؤه. العائد المتوقع هو حوالي 4 ملغ أو أكثر من البروتين.
  11. Refold MOG 1-125 عن طريق إزالة تدريجية من غوانيدين عبر غسيل الكلى، كما هو موضح في المادة 5.
  12. التركيز MOG 1-125 البروتين كما هو موضح في القسم 6. التركيز النهائي يجب أن يكون 2.24 ملغ / مل، وهو متساوي المولية إلى 5 ملغ / مل MOG العلامة.

8. SDS-PAGE جل لتأكيد MOG العلامة إنتاج والطهارة

ملاحظة: عينات مأخوذة من الخطوات 1.4، 2.1، 3.4، و 6.4 يتم تحليلها من قبل القياسية SDS-PAGE لتأكيد MOG إنتاج العلامة والنقاء. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد تنقية النهائية إما MOG العلامة أو MOG 1-125.

    <لى> جعل منطقة عازلة تحميل 2X SDS-PAGE بإضافة 1.576 غرام من تريس، حمض الهيدروكلوريك إلى 2 مل من H 2 O وتعيين الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. إضافة 0.4 غرام SDS في حل تريس، حمض الهيدروكلوريك ومن ثم إضافة H 2 O حتى يصل إلى حجم 7 مل.
  1. إضافة 0.2 غرام من برموفينول الأزرق إلى 10 مل من H 2 O ثم إضافة 1 مل من هذا الحل في الخطوة 8.1. أخيرا، إضافة 2 مل من الجلسرين لإنهاء العازلة تحميل 2X SDS-PAGE. عند تخزين هذا الحل، والحفاظ على 4 درجات مئوية، وحمايته من الضوء لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. ذوبان الجليد في قسامات المجمدة من البكتيريا من الخطوات 1.4 و 2.1 وكذلك MOG بالفاعلات العلامة البروتين من الخطوات 3.4 و 6.4 في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة الأملاح من الحلول التي تم جمعها في الخطوات 3.4 و 6.4 وذلك بإضافة 60 ميكرولتر من كل الأعمدة البروتين تحلية. تنقية البروتينات التالية تعليمات الشركة الصانعة.
  4. إضافة 20 ميكرولتر من β-mercapto الإيثانول إلى 1 مل من محلول في الخطوة 8.2. إضافة 40 ميكرولتر من هذا إلى البكالوريا اثنينالكريات البكتيرية من الخطوة 8.3 و 60 ميكرولتر من البروتينات المحلاة من الخطوة 8.4 واحتضان هذه على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. جعل 1X عازلة تشغيل الصفحة SDS وزنها عن طريق 5 غرام من تريس، 28.8 غرام الجلايسين، و 1 غرام SDS. إضافة هذه إلى كوب 1 لتر وإضافة 500 مل H 2 O حل كل شيء. مرة واحدة حله، ونقل الحل إلى 1 لتر تخرج اسطوانة وملء مع H 2 O حتى يصل حجم 1 L.
  6. اقامة هلام بولي أكريلاميد 12٪ في جهاز الجل ثم إضافة SDS-PAGE العازلة 1X تشغيل لجهاز هلام مثل أن المخزن المؤقت تشغيل فقط فوق الجزء العلوي من الآبار في هلام. غسل الآبار من هلام قبل pipetting 50 ميكرولتر من العازلة على التوالي في الآبار خمس مرات لكل منهما.
  7. تحميل 10 ميكرولتر من سلم البروتين في البئر الأول وإضافة 10 ميكرولتر من الحلول المغلي من الخطوة 8.5 لفصل الآبار. تشغيل هلام في 115 فولت لمدة 60 دقيقة.
  8. إزالة هلام من الجهاز ونقلها إلى وعاء صغير. ملء حساب المشتركINER مع 100 مل من H 2 O النقي ونقل الحاوية إلى منصة دوارة ببطء لمدة 8 دقائق. بعد دقيقة 8، تفريغ المياه وغسل هلام مرتين أكثر مع H 2 O.
  9. تفريغ H 2 O من الحاوية وإضافة 100 مل من كاشف وصمة عار السريع إلى الحاوية. نسمح لهذا أن يجلس على منصة دوارة ببطء بين عشية وضحاها، وتغطي بورق الألمنيوم.
  10. تفريغ وصمة عار الكاشف السريع وإضافة حوالي 100 مل من H 2 O إلى الحاوية. نسمح لهذا أن يجلس على منصة دوارة لمدة 8 دقائق. تفريغ H 2 O وتكرار غسل H 2 O مرتين.
  11. صورة هلام باستخدام تصوير لبقع زرقاء coomassie. ابحث عن النطاق حول 31.86 كيلو دالتون (MOG العلامة بروتين) والفرقة خفوتا في 63.72 كيلو دالتون (MOG العلامة dimers).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرة واحدة في تنقية كاملة، والعينات التي تم جمعها في الخطوات 1.4، 2.1، 3.4، ويجب أن يتم تشغيل المنتج النهائي من الخطوة 6.4 على هلام بروتين (الشكل 3A). العلامة MOG يجب أن تظهر أولا والفرقة كيلو دالتون 31.86 في العينة T O / N، ولكن ليس ر 0، وينبغي أن تكون الفرقة الوحيدة في منتج نقي النهائي. لاختبار ما إذا كانت العلامة MOG البروتين ومطوية بشكل صحيح، العلامة MOG البروتين يمكن أن تست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، التي وصفناها بروتوكول لإنتاج MOG البروتين العلامة وكيفية توليد MOG النقي 1-125 من البروتين العلامة MOG. ويستند هذا البروتوكول على حد سواء على أساس طرق تنقية البروتين القياسية صاحب العلامة، وكذلك بروتوكول سبق وصفها لتوليد البروتين كبار السن على أساس MOG-15. على الرغم من عدم وصفها هنا، واستخدام الرئيسي للبروتين العلامة MOG هو للحث على EAE من خلال تحصين مع مستضد البروتين. بروتوكول يصف كيف هو فعل EAE في الفئران، والذي يتوافق ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنحة من جمعية التصلب المتعدد في كندا. حصلت RWJ على جائزة منح الدكتوراه من جمعية Waugh Family MS في كندا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BL21 E. القولوني< / em>- PET32-MOGtagKerfoot labهذه البكتيريا مطلوبة لجعل بروتين MOGtag< / sub>. مخزون الجلسرين من هذه البكتيريا متوفرة عند الطلب.
LB مرق ميلربيوشوبLBL407.1
أمبيسلينحيوي أساسيAB0028أعد تركيب المسحوق إلى 50٪ إيثانول / 50٪ H2< / sub>O عند 100 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
IPTGBioshopIPT002.5أعد تركيب المسحوق في H2< / sub>O عند 1M وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
ليزوزيم بيض الدجاجBioshopLYS702.10يعاد تكوينه في H2< / sub>O عند 50 مجم / مل ويخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
Triton-X100SigmaT-8532
تقنيات الحياةالمالحة المخزنة بالفوسفات20012-027المحلول الملحي المخزنة بالفوسفات التجاري غير مطلوب ، وأي محلول ملحي مخزن بالفوسفات القياسي المصنوع في المختبر كاف.
كلوريد الصوديومBioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
ImidazoleBioshopIMD508.100
Guanidine-HClSigmaG3272يجب أن تكون الجودة أكبر من 98٪ نقاء.
0.5 M EDTAbioshopEDT111.500
كبريتات النيكل (II)BioshopNIC700.500
راتنج ربطEMD Millipore69670-3يخزن في 20٪ إيثانول 80٪ H2< / sub>O عند 4 درجة ؛ ج
الإيثانول اللامائي الكحوليات التجاريةP016EAANتمييع بالماء حسب الحاجة.
حمض الخليك الجليديBioshopACE222.1
أسيتات الصوديوم ثلاثي الهيدراتBioshopSAA305.500
ألبومين مصل الأبقار القياسيbio-rad500-0206
Bio-rad بروتين فحص صبغة كاشف التركيزbio-rad500-0006
حمض رباعي الإيثيلين ديامين ، ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديومفيشر علميBP120-500
Tris-baseBioshopTRS001.1
7000 ميجاوات أنابيب غسيل الكلى من جلد الثعبانThermoscientific68700
2-mercaptoethanolSigmaM3148-25mlلا ينبغي التعامل مع هذا الكاشف خارج غطاء الدخان.
AcTEV proteaselifetechnologies12575-015يمكن إنتاج بروتياز TEV الخاص بك باستخدام (https://www.addgene.org/8827/) وتنقيته كما هو موضح في المرجع 17
Polyethyleneglycol 3350BioshopPEG335.1
Poly glycol 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp مسطح القاع 96 لوحة بئرebioscience44-2404-21
SonicatorFisher العلميFB-120-110
مطياف الصفيحة الدقيقة EonBiotek11-120-611يستخدم هذا الجهاز برنامج تحليل البيانات Gen5.
برنامج تحليل البيانات Gen5BioTek
كبريتات دوديسيل الصوديومBioshopSDS001
بروموفينول الأزرقBioshopBRO777
GlycerolBioshopGLY001
أعمدة تحلية البروتينالعلميالحراري 89849
جلايسينبيوشوبGLN001
مسبقة الصب 12٪ بولي أكريلاميد جلbio-rad456-1045
كاشف وصمة عار سريعةEMD Millipore553215
Gel dock EZ imagerbio-rad1708270
White Light Sample Traybio-rad1708272 تستخدم جنبا إلى جنب مع جهاز تصوير EZ لحوض الجل للبقع الزرقاء coomassie
سلم البروتينbio-rad1610375

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470(2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EAE MOG

مقالات ذات صلة