وغالبا ما يسبب عدم انتظام ضربات القلب ورثت من الطفرات التي تغير تسليم سطح القنوات الأيونية واحد أو أكثر. هنا، علينا أن نكيف التدفق الخلوي المقايسات لتوفير الكمي من إجمالي وسطح الخلية بروتين تعبير نسبي من القنوات الأيونية المؤتلف وأعرب في TSA-201 الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقرير من سطح الخلية النسبي ومجموع التعبير عن قنوات المؤتلف ايون باستخدام التدفق الخلوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
قد تؤدي الطفرات الموروثة أو الجديدة في القنوات الانتقائية للكاتيون إلى موت قلبي مفاجئ. غالبا ما يفترض أن التغيير في تهريب غشاء البلازما لهذه البروتينات متعددة الغشاء ، مع أو بدون تغيير في بوابات القناة ، يساهم بشكل كبير في هذه العملية. وبالتالي أصبح من الأهمية بمكان تطوير طريقة لتحديد التغيير في التعبير النسبي عن سطح الخلية للقنوات الأيونية للقلب على نطاق واسع. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لتحديد التعبير الكلي النسبي وسطح الخلية لقنوات الكالسيوم القلبية من النوع L CaV1.2 والوحدات الفرعية المرتبطة بالغشاء في خلايا tsA-201 باستخدام فحوصات القياس الخلوي الفلوري ثنائي اللون. بالمقارنة مع الطرق النوعية الأخرى القائمة على الفحص المجهري أو القائمة على النشاف المناعي ، فإن تجارب قياس التدفق الخلوي سريعة وقابلة للتكرار وكبيرة الحجم توفر نقاط نهاية قابلة للقياس الكمي على عينات كبيرة من الخلايا الحية (تتراوح من 104 إلى 106 خلايا) ذات خصائص خلوية مماثلة في تدفق واحد. تم تصميم التركيبات للتعبير بشكل أساسي عن mCherry في الطرف C داخل الخلايا (مما يسمح بتقييم سريع لتعبير البروتين الكلي) والتعبير عن حاتم هيماجلوتينين خارج الخلية (HA) لتقدير التعبير عن سطح الخلية لبروتينات الغشاء باستخدام جسم مضاد مترافق مضاد لمضان HA. لتجنب السلبية الكاذبة ، تم إجراء تجارب أيضا في الخلايا المنفذة لتأكيد إمكانية الوصول والتعبير الصحيح عن حاتمة HA. يوفر الإجراء التفصيلي: (1) تصميم تركيبات الحمض النووي الموسوم (الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين) ، (2) تعداء التركيبات بوساطة الدهون في خلايا tsA-201 ، (3) زراعة وحصاد وتلوين الخلايا غير المنفذة والنفاذة ، و (4) اكتساب وتحليل إشارات الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، يتم شرح المبادئ الأساسية لقياس التدفق الخلوي ومناقشة التصميم التجريبي بدقة ، بما في ذلك اختيار الفلوروفورات ، ومعايرة الجسم المضاد HA وتجارب التحكم. يوفر هذا النهج المحدد تقديرا نسبيا موضوعيا للتعبير الكلي وسطح الخلية للقنوات الأيونية التي يمكن تمديدها لدراسة المضخات الأيونية وناقلات غشاء البلازما.
المقدمة
وتقدم هذه الورقة فحص موثوق للإبلاغ عن التعبير سطح الخلية النسبي للبروتينات غشاء مثل القنوات الأيونية التي أعرب عنها في خلايا المؤتلف باستخدام تقنية التدفق الخلوي القائمة. القنوات الأيونية هي تشكيل المسام بروتينات غشاء التي هي المسؤولة عن السيطرة على الإشارات الكهربائية عن طريق النابضة تدفق الأيونات عبر غشاء الخلية. يتم تصنيفها من قبل آلية تفعيل، والطبيعة، والانتقائية الأنواع أيون تمر عبر المسام حيث يتم ترجمة ما. في مستويات الخلايا والأنسجة، وتدفقات أيون العيانية من خلال القنوات الأيونية هي نتاج الخصائص الفيزيائية الحيوية 1 (النابضة وتخلل)، والكيمياء الحيوية (الفسفرة)، ونشوء حيوي (التوليف، بالغليكوزيل، والاتجار، وتدهو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. يبني المضاعفة معلم الحمض النووي
- إدراج حاتمة HA (YPYDVPDYA) في رابط خارج الخلية كا الخامس α2δ1 بين D676 و R677 من قبل الموقع الموجه الطفرات (الشكل 3B) 20. استخدام gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC التمهيدي إلى الأمام وعكس acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC التمهيدي.
- Subclone تسلسل كدنا] من ها كا الخامس α2δ1 الموسومة في ناقلات التعبير عن pmCherry N1 الثدييات تهدف إلى التعبير عن بروتين تنصهر إلى N-محطة من mCherry بين المواقع ساسي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
توضح هذه المقالة بروتوكول يمكن الاعتماد عليها لتحديد مساحتها الكلية وخلية من القنوات الأيونية المؤتلف وأعرب في TSA-201cells بتدفق اللونين الخلوي الفحص. وكمثال على ذلك، كان كميا سطح الخلية النسبي ومجموع تعبير البروتين لV α2δ1subunit الكالسيوم. من أجل أداء تدفق اللونين الخلوي الفحص، كانت المعلمة الكالسيوم الخامس α2δ1 مضاعف إبداء HA حاتمة غير فلوري خارج الخلية التي يمكن الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة HA FITC مترافق وال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تطبيق هذا التدفق الفحص القائمة على الخلوي بنجاح لقياس مستويات الكلية وسطح الخلية النسبية للمفارز fluorescently المسمى تشكيل المسام وما يرتبط بها من قنوات الكالسيوم الجهد بوابات 14،22،26. يتم استخدام أفضل ما عند التحقيق في تأثير الطفرات الوراثية، وبالتالي يتطلب أن كثافة مضان الجوهرية للمن النوع البري بناء fluorescently المسمى الموسومة تكون على الأقل 10-100 أضعاف أكبر من لشدة مضان من بناء علامة عليه fluorescently المسمى . في هذه الحالة بالذات، وmCherry-كا بناء V
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر السيد سيرج سينشال والدكتور جاك ثيبودو على مشاركة خبراتهما ومنحنا إمكانية الوصول إلى نظام قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا. وقد أنجز هذا العمل بمنحة تشغيلية 130256 من المعاهد الكندية للبحوث الصحية، ومنحة مساعدة من المؤسسة الكندية للقلب والسكتة الدماغية، وبدعم من "مؤسسة معهد أمراض القلب في مونتريال" إلى L.P.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Q5 مجموعة الطفرات الموجهة للموقع | نيو إنجلاند Biolabs | E0554S | يمكن استبدالها بمجموعة الطفرات الموجهة من الموقع QuickChange (Agilent ، # 200523). |
| أنابيب 1.5 مل | Sarstedt | 72-690-001 | |
| أنابيب 15 مل | Sarstedt | 62-554-002 | |
| Tranfer Pipets المتدرجة القابل للتصرف | VWR | 160001-192 | |
| طبق ثقافة 100 مم | 430167 Corning | للثقافة القياسية لخلايا HEKT. | |
| طبق استزراع 35 مم | Falcon | 353001 | للاستزراع القياسي لخلايا HEKT. |
| ماصة مصلية 1 مل | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| ماصة مصلية 5 مل | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| ماصة مصلية 10 مل | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| ماصة مصلية 25 مل | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| Dulbecco متوسطة الجلوكوز | تقنيات الحياة | 12100-046 | دافئة في 37 & درجه; ج حمام مائي قبل الاستخدام. |
| مصل الأبقار الجنيني ، مؤهل ، معطل بالحرارة ، من أصل أمريكي | Life Technologies | 16140-071 | |
| البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) Life | Technologies | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 & nbsp ؛ | لايف تكنولوجيز | 11668-019 | لتعداء الجثومات الشحمية. يمكن استبداله بتعداء فوسفات الكالسيوم. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life | Technologies 31985-070 | دافئة في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام. |
| Trypsin-EDTA (1x) 0.05٪ ، الفينول الأحمر | Life Technologies | 25300-062 | |
| 1.5 مل microtubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| يمكن أن يكون محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x | فيشر | BP661-10 | "محلي الصنع". |
| الأجسام المضادة المترافقة المضادة المضادة HA FITC | Sigma | H7411 | |
| IgG1 & ناقص ؛ FITC Isotype التحكم في الجسم المضاد | Sigma | F6397 | |
| BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilization Solution | Biosciences | 554714 | التثبيت / النفاذية. محلول النفاذية / الغسيل ، يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| مقياس الدم | فيشر | 49105161 | |
| تريبان بلو | فيشر | 15250061 | للوصول إلى صلاحية الخلية. |
| أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردة ، 5430R | Eppendorf ؛ | A14H172200 | |
| Forma Steri-Cycle CO2< / sub> حاضنة | فيشر | 370 | |
| منصة مختبر هزاز | فيشر | 545034 | |
| حمام مائي | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III & nbsp ؛ | BD Biosciences | 648282 | مقياس التدفق الخلوي. |
| برنامج FlowJo v10 | FlowJo | FlowJo v10 Dongle | لتحليل البيانات. |
المراجع
- Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
- Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defec....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
