مقالة منهجية

استخدام خرطوشة مرشح للترشيح المياه العينات واستخلاص الحمض النووي البيئي

DOI:

10.3791/54741

⸱

نوفمبر 25, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا لترشيح عينات المياه باستخدام خرطوشة مرشح واستخراج الحمض النووي البيئي (eDNA) دون الحاجة إلى قطع الغلاف لإزالة الفلتر. تم تطوير هذا البروتوكول للترميز الشريطي للحمض النووي الإلكتروني من الأسماك ، ولكنه ينطبق أيضا على الحمض النووي الإلكتروني من الكائنات الحية الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت الدراسات الحديثة استخدام الحمض النووي البيئي (eDNA) من الأسماك ليكون مناسبا كأداة مراقبة غير جراحية. استخدمت معظم هذه الدراسات مرشحات ألياف القرص لجمع الحمض النووي الإلكتروني من عينات المياه ، على الرغم من أن عددا من الدراسات الميكروبية في البيئات المائية قد استخدم خراطيش الترشيح ، لأن الخرطوشة تتمتع بميزة استيعاب كميات كبيرة من المياه وسهولة الاستخدام بشكل عام. نقدم هنا بروتوكولا لترشيح عينات المياه باستخدام خرطوشة المرشح واستخراج eDNA من المرشح دون الحاجة إلى قطع الغلاف. تتكون الأجزاء الرئيسية من هذا البروتوكول من 1) ترشيح عينات المياه (أحجام المياه ≤4 لتر أو >4 لتر) ؛ (2) استخراج الحمض النووي على المرشح باستخدام شاكر أسطواني يوضع في حاضنة مسخنة مسبقا ؛ و (3) تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تجارية. باستخدام هذا البروتوكول والبروتوكولات المستخدمة سابقا ، نقوم بإجراء تحليل الترميز الشريطي ل eDNA المأخوذ من خزان حوض مائي ضخم (7,500 م3) مع تكوين الأنواع المعروفة ، ونعرض عدد الأنواع المكتشفة لكل مكتبة من البروتوكولين كنتائج تمثيلية. تم تطوير هذا البروتوكول للترميز الشريطي للحمض النووي الإلكتروني من الأسماك ، ولكنه ينطبق أيضا على الحمض النووي الإلكتروني من الكائنات الحية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشير الحمض النووي البيئي (إدنا) في البيئات المائية على المواد الجينية الموجودة في عمود الماء. أثبتت الدراسات الحديثة فائدة ادنا للكشف عن الأسماك من البيئات المائية المختلفة، بما في ذلك البرك 1-3، 4-8 الأنهار والجداول 9، ومياه البحر 10-14. ركزت معظم هذه الدراسات على الكشف عن الأنواع واحدة أو عدد قليل الغازية 1،4-6،8،14 ونادرة أو مهددة 3،9، في حين حاولت بعض الدراسات التي أجريت مؤخرا كشف في وقت واحد من أنواع متعددة في المجتمعات الأسماك المحلية 7،9، 12،13،15 وmesocosms 11،12.

ويسمى هذا النهج الأخير "metabarcoding" ويستخدم إدنا metabarcoding واحدة أو عدة مجموعات من الاشعال PCR لcoamplify منطقة الجين عبر عينات متنوعة تصنيفيا. ويلي ذلك إعداد مكتبة مع الفهرسة وإضافة محول، ويتم تحليل المكتبات فهرستها من قبل الإنتاجية العالية التسلسل الموازيمنصة. مؤخرا ميا وآخرون. 12 وضعت الاشعال PCR عالمية لmetabarcoding إدنا من الأسماك (وتسمى "MiFish"). الاشعال MiFish تستهدف في منطقة التغير الزائد من الميتوكوندريا 12S الريباسي جين (163-185 بي بي)، الذي يحتوي على معلومات كافية لتحديد الأسماك لعائلة التصنيف، جنس والأنواع باستثناء بعض المتجانسات ترتبط ارتباطا وثيقا. مع استخدام تلك الاشعال في إدنا metabarcoding، ميا وآخرون. 12 الكشف عن أكثر من 230 نوعا البحرية شبه الاستوائية من الدبابات حوض السمك مع المعروفة تكوين الأنواع والشعاب المرجانية بالقرب من الحوض.

مع تحقيق بروتوكول metabarcoding لاستيعاب مياه البحر الطبيعية مع مستويات تركيز إدنا من أسماك مختلفة، لاحظنا أن الاشعال MiFish فشلت في بعض الأحيان إلى تضخيم المنطقة المستهدفة لإعداد مكتبة لاحق. واحد من الأسباب الأكثر احتمالا لهذا التضخيم PCR ناجحة هو عدم وجود كميات كافية من الشركة المصرية للاتصالاتmplate الحمض النووي الواردة في كميات صغيرة من الماء المصفى (أي 1-2 L). وعلى الرغم من تركيز إدنا من مجموعة تصنيفية معينة هو مجهول قبل التضخيم، والترشيح من كميات المياه الكبيرة (> 1-2 لتر) من شأنه أن يكون وسيلة بسيطة وفعالة لجمع أكثر إدنا من البيئات المائية مع وفرة الأسماك النادرة والكتلة الحيوية، مثل المحيطات المفتوحة وأعماق البحار النظم الإيكولوجية.

بالنسبة للمرشحات الألياف القرص المستخدمة تقليديا في عدد من البحوث إدنا الأسماك 16، خراطيش تصفية لديها ميزة على استيعاب كميات المياه الكبيرة قبل انسداد 17. في الواقع، أظهرت دراسة حديثة حجم كبير (> 20 L) الترشيح للعينات مياه البحر الساحلية باستخدام خراطيش تصفية 18. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تعبئتها بشكل فردي ومعقمة، ويمكن إجراء عدة خطوات سير العمل التجريبي في السكن التصفية، وبالتالي تقليل احتمال تعرضها للتلوث من المختبر 19. الأخيرالميزة الهامة لإدنا metabarcoding، والذي من مخاطر التلوث ما زال ضمن أكبر التجريبية تتحدى 20،21. على الرغم من هذه المزايا التقنية خراطيش مرشح، لم يتم استخدامه في الدراسات إدنا من الأسماك مع اثنين من الاستثناءات 8،15.

نحن هنا نقدم بروتوكول لترشيح من عينات المياه مع فلتر خرطوشة واستخراج إدنا من مرشح من دون الحاجة إلى قطع فتح الإسكان. ونحن نقدم أيضا اثنين من أنظمة تنقية المياه البديلة اعتمادا على كميات المياه (≤4 L أو> 4 L). لمقارنة أداء بروتوكول المطورة حديثا وبروتوكول يستخدم سابقا باستخدام فلتر الألياف الزجاجية في مجموعتنا البحثية 12،14،22،23، ونحن أداء إدنا metabarcoding تحليل مياه البحر من خزان ماء ضخم (7500 م 3 ) مع تركيبة الأنواع المعروفة، وعرض عدد من أنواع الكشف المستمدة من البروتوكولين كنتائج التمثيلية. هذا البروتوكول حكما تم وضعها لmetabarcoding إدنا من الأسماك، ولكن ينطبق أيضا على ادنا من الكائنات الحية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: هذا البروتوكول لا يتعامل مع طرق أخذ العينات المياه وmetabarcoding. قد أخذ عينات المياه بطرق مختلفة اعتمادا على أغراض الدراسة 16 وانظر ميا وآخرون. (12) لتفاصيل الطرق metabarcoding باستخدام بادئات MiFish. لاحظ أن الماء عينات يجب أن تبقى باردة جدا وتصفيتها في غضون ساعات قليلة لتجنب تدهور إدنا. لاحظ أيضا أن هذا البروتوكول ينطوي على استخدام شاكر الدوارة وحاضنة، وهذه الأخيرة يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب السابق. وبالإضافة إلى ذلك، جهاز للطرد المركزي التي يمكن أن تستوعب كل من 15 مل و 50 مل أنابيب مخروطية أمر لا غنى عنه لإزالة السائل المتبقي من مرشح ما بعد الترشيح وجمع الحمض النووي المستخرج داخل خرطوشة، على التوالي.

1. معالجة كاب برغي وL كيس من البلاستيك 1

ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم الترشيح هو> 4 L.

  1. حفر حفرة من خلال مركز المسمار جا ف ب (تعلق على التخلص منها 1 لتر كيس من البلاستيك) مع نفس القطر (4.8 مم) كما أنبوب إسقاط من الذكور موصل LUER قفل. باستخدام كماشة قطري، وتقصير أنبوب من الذكور موصل LUER قفل إلى الطول المناسب (كاليفورنيا 3 ملم) لتجنب انسداد كمية صغيرة من الماء داخل الغطاء بعد الترشيح.
  2. تطبيق الغراء اللاصق المتخصصة للبولي ايثيلين (PE) والبولي بروبلين (PP) إلى كل من القاع والسطح من الذكور موصل LUER القفل والمسمار كأب، على التوالي. انتظر بضع دقائق لارتباط لاصقة جيدة (راجع إرشادات الشركة المصنعة).
  3. إدراج موصل ذكر LUER قفل في حفرة من سقف المسمار. انتظر حتى ارتباط لاصقة كاملة من جزأين (عادة> 24 ساعة). تعقيم سقف المسمار مع الذكور موصل LUER قفل مع التبييض 10٪ التجاري (كاليفورنيا. 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم) قبل الاستخدام.
  4. لكمة اثنين من الثقوب على اثنين من الزوايا السفلية للكيس من البلاستيك 1 L من أجل تعلقها من MESلوحة ح (الخطوة 3). تأكد من أن قطر الثقوب أكبر من ذلك من شوكات على شبكة لوحة.

2. جمعية نظام الترشيح

  1. إرفاق عالية أنابيب فراغ إلى موصل إدخال مضخة الشافطة ونعلق على الطرف الآخر من الأنبوب إلى مشعب. مما لا شك فيه أن تي الصمامات الثلاثة الحمراء من مشعب هي في "وضع إيقاف التشغيل" (أي، أفقي).
  2. يرتدي نظيفة مجموعة من القفازات، وإدراج LUER الإناث المناسب وموصل فراغ في نهايات العلوية والسفلية من أنابيب المطاط فراغ لترشيح، على التوالي.
  3. بعناية إرفاق بالتركيبة الإناث المناسب لمنفذ مخرج خرطوشة الفلتر وإرفاق موصل فراغ سدادة السيليكون.

3. الترشيح من عينات المياه (≤4 L) باستخدام فلتر خرطوشة

ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم الترشيح هو> 4 L. هذا النظام الترشيح يتطلب قائمة بذاتها لوحة وأو معلقة في كيس من البلاستيك مليئة 1 لتر من الماء. ومن شأن شبكة لوحة، شوكات متعددة، وموقف لوحة، كل ما هو متاح من المخازن على الانترنت، أن تكون مفيدة لتجميع هذه الوحدة. الأوتوكلاف مدخل ومخرج قبعات LUER لخرطوشة الفلتر قبل الاستخدام.

  1. صب الماء عينات 1 لتر في كيس من البلاستيك وأغلق الغطاء المسمار مع الذكور موصل LUER قفل.
  2. بعناية توصيل مدخل الميناء من خرطوشة فلتر تجميعها مع الذكور موصل LUER قفل من كيس من البلاستيك. لا تبالغ في تشديد موصل LUER القفل. خلاف ذلك سوف تسرب الوحدة بمجرد أن يبدأ الضخ. تأكد من أن كافة الاتصالات آمنة قبل شنقا في كيس من البلاستيك من شبكة لوحة.
  3. بعناية شنق كيس من البلاستيك مع خرطوشة تصفية اثنين من شوكات على شبكة لوحة وإدراج سدادة سيليكون بمنفذ مدخل مشعب.
  4. بدوره على الشافطة. فتح تي صمامات الحمراء للترشيح. تشغيل متعددة حتى خرطوشة الفلتر جافة، ردجاجة تتحول الحمراء تي صمام إلى موقف قبالة.
  5. كرر 3،1-3،4 الخطوات حتى يتم تصفية المبلغ المطلوب من المياه.
    ملاحظة: للحصول على 1 لتر من المياه المأخوذة من الشعاب المرجانية المدارية، ويستغرق حوالي ثلاث دقائق عن الترشيح.
  6. بعناية إزالة خرطوشة مرشح من كيس من البلاستيك وموصل فراغ.
  7. تتويج طرفي خرطوشة مع مدخل ومخرج قبعات LUER.
  8. تسمية غطاء خرطوشة وLUER مدخل مناسب باستخدام قلم المذيبات دليل لسرعة التجفيف وغير تلطيخ وضع العلامات.
  9. تخزين خرطوشة مرشح في -20 مئوية قبل استخراج الحمض النووي.

4. ترشيح المياه (> 4 L) عينات باستخدام فلتر خرطوشة

ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم تنقية المياه هو ≤4 L. هذا النظام الترشيح يتطلب زجاجة كتاب 10 لتر مجهزة صمام والمتاح طرف ماصة 10 مل. قطرها الداخلي 10 مل ماصة (15.0 مم) وتفتق من طرفنهاية وينبغي أن تندرج إلى القطر الخارجي للصمام (15.0 مم) ومدخل الميناء من خرطوشة مرشح، على التوالي. يتم الاحتفاظ كلا اتصالات بشكل آمن أثناء الترشيح في نوبة الاحتكاك. تعقيم طرف ماصة مع التبييض التجارية 10٪ (حوالي 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم) قبل الاستخدام.

  1. إعداد كمية مناسبة من الماء العينة في زجاجة الكتاب. إدراج بإحكام 10 مل ماصة في صمام زجاجة كتاب 10 لتر.
  2. إدراج بإحكام ميناء منفذ للخرطوشة مرشح في نهاية طرف ماصة وإدراج سدادة السيليكون في مدخل الميناء من مشعب. بدوره على الشافطة. فتح تي صمامات الحمراء للترشيح. تشغيل متعددة حتى خرطوشة الفلتر جافة، ثم اتجه الحمراء تي صمام إلى موقف قبالة.
    ملاحظة: للحصول على 10 لتر من مياه البحر التي أخذت من الشعاب المرجانية الخارجي شبه الاستوائية، ويستغرق حوالي 30-40 دقيقة للترشيح.
  3. بعناية إزالة خرطوشة مرشح من كيس من البلاستيك وموصل فراغ. كاب على حد سواءينتهي من خرطوشة مع مدخل ومخرج قبعات LUER. تسمية غطاء خرطوشة وLUER مدخل مناسب باستخدام قلم المذيبات دليل لسرعة التجفيف وغير تلطيخ وضع العلامات. تخزين خرطوشة مرشح في -20 درجة مئوية قبل استخراج الحمض النووي.

5. استخراج إدنا من تصفية

ملاحظة: في الخطوات 4 و 5، ونحن نستخدم مجموعة تجارية، إلى حد كبير بعد بروتوكول ل "الدم الأنوية" التي تقدمها المجموعة. عن البساطة، ووصف الإجراء لمعالجة خرطوشة الفردية. في الممارسة العملية، ونحن نوصي تجهيز 8 (أو الحد الأقصى لعدد أجهزة الطرد المركزي) أو أقل المرشحات في وقت واحد.

  1. سخن حاضنة إلى 56 درجة مئوية.
  2. إعداد أنبوب 2.0 مل عن طريق خفض الحد الأقصى يتوقف من الأنبوب. تجاهل الغطاء.
    ملاحظة: يستخدم هذا الأنبوب كما أنبوب لجمع السائل المتبقي في التصفية.
  3. إزالة مدخل (لا مخرج) غطاء LUER من خرطوشة الفلتر وإدراج ط مدخل الميناءn لأنبوب جمع. بإحكام اغلاق اتصال بين أنبوب خرطوشة وجمع باستخدام فيلم الختم الذاتي.
  4. إدراج وحدة دمجها في محول الطرد المركزي لأنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي خرطوشة في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة السائل المتبقي في التصفية.
  5. إزالة أنبوب جمع من خرطوشة الفلتر والتخلص من الأنبوب. إعادة سقف مدخل الميناء من الخرطوشة.
  6. تحضير خليط من 20 ميكرولتر حل بروتين-K، 220 ميكرولتر PBS (الفوسفات مخزنة المالحة، لم تقدم من قبل عدة) و 200 العازلة ميكرولتر AL.
    ملاحظة: خرطوشة مرشح تستوعب ما يصل إلى أربعة أضعاف حجم الخليط (. كاليفورنيا 1.8 مل).
  7. إزالة الغطاء مدخل وإضافة الخليط (440 ميكرولتر) في خرطوشة تصفية باستخدام طرف ماصة. إدراج ماصة تماما في مدخل الميناء بحيث غيض ماصة مرئيا داخل خرطوشة فقط فوق الغشاء.
  8. إعادة سقف مدخل الميناء ووضع السيارة فلترtridge على شاكر دوارة.
  9. ضع شاكر دوارة في الحاضنة محمى على حرارة 56 مئوية، وتشغيل شاكر بسرعة 20 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
  10. أثناء الحضانة، وإعداد أنبوب 2.0 مل جديد، تسمية أنبوب بشكل مناسب باستخدام قلم المذيبات واقية ووضعه في أنبوب مخروطي 50 مل.
    ملاحظة: السابقة (2.0 مل)، وأنابيب الأخيرة (50 مل) وتستخدم لجمع الحمض النووي المستخرج ولعقد أنبوب 2.0 مل، على التوالي.
  11. بعد الحضانة، وإزالة الغطاء مدخل وإدراج مدخل (لا مخرج) ميناء خرطوشة في أنبوب 2.0 مل في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إغلاق أنبوب مخروطي 50 مل مع غطاء المسمار.
  12. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 50 مل في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع الحمض النووي المستخرج من الخرطوشة. إزالة خرطوشة الفلتر وأنبوب 2.0 مل باستخدام ملقط معقم وغطاء الأنبوب. تجاهل خرطوشة الفلتر.

6. تنقية المستخلصة الحمض النووي

ملاحظة: نحن أزل إدنا مع 100 العازلة ميكرولتر AE بدلا من 200 ميكرولتر المحددة في دليل من عدة التجارية.

  1. إضافة 200 ميكرولتر الإيثانول (96-100٪) إلى الحمض النووي المستخرج في أنبوب 2.0 مل من الخطوة أعلاه (حوالي 440 ميكرولتر)، وتخلط جيدا من قبل vortexing.
  2. الماصة الخليط في عمود الدوران وضعت في أنبوب جمع 2 مل. أجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع.
  3. ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، إضافة 500 ميكرولتر عازلة AW1، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 5000 ز س. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع.
  4. ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، إضافة AW2 العازلة 500 ميكرولتر، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 20000 ز س. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع.
  5. إعداد أنبوب 1.5 مل جديد (لم تقدم من قبل عدة) وتسمية أنبوب بشكل مناسب باستخدام قلم ماء لسرعة التجفيف وغير تلطيخ وضع العلامات. نقل ر عمود الدورانس أنبوب 1.5 مل.
  6. أزل الحمض النووي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر عازلة AE إلى مركز للغشاء عمود الدوران. احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  7. تجاهل عمود الدوران وغطاء الأنبوب. تخزين الحمض النووي تنقيته في -20 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فمن الصعب من الناحية الفنية لعزل وتحديد إدنا الأسماك فقط من إدنا الأكبر المستخرج، لأن الاشعال MiFish coamplify المنطقة المستهدفة من بعض الفقاريات غير السمكية، مثل الطيور والثدييات، مع منتجات PCR من نفس الحجم (كاليفورنيا 170 شركة بريتيش بتروليوم ) 12. بدلا من قياس السمك إدنا، ونحن أداء MiFish metabarcoding تحليل إدنا من خزان ماء مع تكوين الأنواع المعروفة باستخدام طريقتين مختلفة من الترشيح واستخراج الحمض النووي، ومقارنة أعداد من أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العديد من الدراسات metabarcoding باستخدام العينات البيئية مثل المياه والتربة، والعلاج في مرحلة ما بعد الترشيح من خرطوشة الفلتر بشكل عام على النحو التالي 24،25: 1) قطع مفتوحة أو تكسير السكن مع الأدوات اليدوية (قطع الأنابيب أو كماشة)؛ 2) إزالة عامل التصفية من خرطوشة. و3) قطع مرشح الى قطع صغيرة بشفرة حلاقة لاستخراج الحمض النووي. لتجنب مثل هذه عدة طرق استخراج الحمض النووي مرهقة والإجراءات التي تكون عرضة للتلوث في المختبر تستغرق وقتا طويلا، حاولنا داخل السكن من خرطوشة الف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة كبحث أساسي من قبل CREST من وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية (JST) ومن خلال المنح المقدمة من JSPS / MEXT KAKENHI (رقم 26291083) ومؤسسة Canon إلى M.M. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لوحة شبكيةIris OhyamaMPP-3060-BE
الشق المعدنيIris OhyamaMR12F
Stand للوحة الشبكيةلا توجد علامة تجارية4184-9507متوفرة من Amazon Japan
كيس بلاستيكي سعة 1 لتر مع غطاء لولبيYanagiDP16-TN1000
موصل قفل لور ذكرISIS11620
ماصة 10 ملEppendorf0030 000.765
زجاجة كتاب سعة 10 لتر مع صمامAs One1-2169-01
مرشح Sterivex-HVMilliporeSVHVL10RCيشار إليه باسم "خرطوشة الفلتر" طوال فترة MS وتستخدم في البروتوكول
تركيب لورذكر كواحد1-7379-04
تركيب أنثى لوركواحد5-1043-14 & nbsp ؛  
غطاء مدخل لورISISVRMP6
غطاء مخرجلور ISISVRFP6
أنابيب فراغ عاليةكواحد6-590-01
موصل فراغواحد6-663-02
سدادة سيليكونكواحد1-7650-07
مشعبكواحد2-258-01
الشفاطة-GAS-1كواحد1-7483-21
DNeasy Blood & مجموعة المناديل (250)Qiagen69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation KitBIO14600-50-NFيشار إليها بأنها "مجموعة اختيارية" في أجهزة
الطرد المركزي المنضديةms KubotaModel 4000السرعة القصوى 6,000 دورة في الدقيقة
محول دوار بزاوية ثابتةKubotaAT-508C
لأنبوب مخروطي سعة 15 ملKubota055-1280
RNAlater حل التثبيتThermo Fisher ScientificAM7020
ParafilmPM992يشار إليه بأنه "فيلم ذاتي الختم"
طرف MO

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584(2013).
  2. Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868(2012).
  3. Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
  4. Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
  5. Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
  6. Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316(2013).
  7. Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
  8. Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
  9. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520(2013).
  10. Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732(2012).
  11. Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
  12. Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088(2015).
  13. Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
  14. Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786(2016).
  15. Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
  16. Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
  17. Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
  18. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161(2009).
  19. Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
  20. Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
  21. Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383(2015).
  22. Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
  23. Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
  24. Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
  25. Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
  26. Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
  27. Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
  28. Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
  29. Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
  30. Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
  31. Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
  32. Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA Metabarcoding Luer Connector

مقالات ذات صلة