يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و

20.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54767

⸱

أغسطس 23, 2016

 , 

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> يرتبط فيروس زيكا (ZIKV) ، وهو أحد مسببات الأمراض الناشئة ، بتشوهات نمو الجنين وصغر الرأس. يعد إنشاء نظام فعال لزراعة الخلايا المعدية أمرا بالغ الأهمية لدراسات تكرار ZIKV وكذلك تطوير اللقاحات والأدوية. في هذه الدراسة ، يتم توضيح ومناقشة العديد من المقايسات الفيروسية المتعلقة ب ZIKV.

الملخص

زيكا فيروس (ZIKV) هو الممرض الناشئة التي يرتبط تشوهات النمو الجنين مثل صغر الرأس، وعيوب العين، وإعاقة النمو. ZIKV هو فيروس RNA من عائلة الفيروسات المصفرة. ينتقل ZIKV أساسا عن طريق البعوض، ولكن يمكن أيضا أن ينتشر عن طريق الأم إلى الجنين انتقال العدوى فضلا عن الاتصال الجنسي. حتى الآن، هناك أي علاج أو لقاح خيارات الموثوقة المتاحة لحماية المصابين بالفيروس. تطوير نظام استنساخه وفعال زيكا الفيروسات المعدية زراعة الخلايا أمر بالغ الأهمية لدراسة الآليات الجزيئية من تكرار ZIKV وكذلك الأدوية واللقاحات التنمية. وفي هذا الصدد، يتم الإبلاغ عن بروتوكول يصف في المختبر زيكا نظام الثدييات خلية القاعدة ثقافة الفيروس لتحليل الإنتاج والنمو الفيروسي هنا. يتم عرض تفاصيل عن تشكيل لويحات فيروس زيكا على أحادي الطبقة الخلية وفحص اللوحة لقياس عيار الفيروسية. حركية تكرار الجينوم الفيروسيويتم تحديد المزدوج تقطعت بهم السبل وسيطة replicatory RNA الجينوم. وقد استخدمت هذه المنصة الثقافة إلى الشاشة ضد مكتبة من مجموعة صغيرة من السيتوكينات مما أدى إلى تحديد الإنترفيرون α (IFN-α)، IFN-β وIFN-γ باسم مثبطات قوية من النمو الفيروسي زيكا. وخلاصة القول إن أظهرت وجود نظام في المختبر المعدية زيكا الفيروسي الثقافة ومختلف فحوصات الفيروسية في هذه الدراسة، والتي لديها القدرة على الاستفادة بشكل كبير من الأوساط البحثية في توضيح مزيد من الآليات المرضية الفيروسية وتطور الفوعة الفيروسية. فيروسات الإنترفيرون ألفا يمكن إجراء مزيد من التقييم باعتباره، بعد التعرض للقائي، وخيار العلاج الوقائي للعدوى فيروس زيكا في السكان المعرضة للخطر، بما في ذلك النساء الحوامل المصابات.

المقدمة

زيكا فيروس (ZIKV) هو الممرض البشري المهم المرتبط صغر الرأس وضعف الحمل أدائهن 1،4. ZIKV ينتمي إلى مجموعة من flaviviruses ذات الصلة طبيا يمكن أن يسبب تشوهات عصبية مثل حمى الضنك وغرب النيل، والفيروسات التهاب الدماغ سانت لويس. الوسيلة الرئيسية لانتقال الفيروس هو من البعوض الناقل الزاعجة المصرية، وبالإضافة إلى ذلك، كما تم الإبلاغ عن الأمراض المنقولة جنسيا 5،6. أصبح ZIKV مشكلة صحية عالمية رئيسية بسبب التوزيع الجغرافي التوسع من البعوض الناقل للمرض وعلاقة قوية مع تشوهات خلقية. تم عزل ZIKV أولا في عام 1947 من قرد هندي صغير خفيرا في الغابة زيكا، أفيد أوغندا وأول حالة بشرية في عام 1952 7،8. الأفرا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: ويرد ملخص تخطيطي لتدفق العمل في الشكل 1.

1. الخلايا

  1. استخدام خلايا فيرو لإنتاج فيروس زيكا وتحليل دورة تكاثر الفيروس.
  2. إعداد وسائل الإعلام كاملة النمو التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتومايسين (100 وحدة / مل)، و 10 ملي HEPES.
  3. ثقافة خلايا فيرو مع متوسط ​​النمو الكامل المحدد عند 37 درجة مئوية مع....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد استخدمت؛ (بنك الجينات عدد الانضمام KU501215 PRVABC59) من النمط الجيني الآسيوية في هذه الدراسة 12 سلالة فيروسية زيكا. واستخدمت خلايا فيرو في 80٪ confluency للتحقيق من جديد زيكا عدوى فيروسية. لإنتاج الفيروسي وتوصيف الفيروسي لاحق، كان يعمل لمرور وقت مبكر (P3) زيكا الفيروس. وقد لوحظت لويحات الفيروسية في اليوم الثاني من العدوى. زيكا السلالات الفيروسية التي صدرت من الخلايا المصابة في البداية يمكن أن ينتشر إلى الخلايا المجاورة، مما.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، يتم تقديم بروتوكول مبسط لزراعة فيروس زيكا في المختبر. الخطوات الحاسمة بما في ذلك تحديد نقاط النهاية المثلى لتوسيع ثقافة الفيروسات، قياس عيار، وقياس تكرار الجينوم قدمت. زيكا الفيروس الممرض البشري، لذلك، في حين أن التعامل مع العوامل المعدية، وإجراءات السلامة الأحيائية هي التي يجب اتباعها بدقة. خط الخلية قرد الكلى، فيرو، وكان يستخدم لإظهار مختلف فحوصات الفيروسية. قد تختلف زيكا حركية تكاثر الفيروس في خلايا الأنسجة المختلفة والأنواع. يمكن استخدام خطوط الخلايا إضافية كما ه.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر الدكتور آرون براولت والدكتور براندي راسل من مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) بالولايات المتحدة الأمريكية على توفير سلالة زيكا الفيروسية PRVABC59. نشكر نيكولاس تن من جامعة ييل على تحرير هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة البحوث البرنامجية المؤسسية لمركز Cedars-Sinai الطبي إلى V.A.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو s النسر المعدل s متوسط (DMEM)Sigma Life ScienceD5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2.5٪ Trypsin ، 10x [-] Phenol Red & nbsp ؛  كورنينج25-054-C1
تريبان بلو داين 0.4٪Life TechnologiesT10282
كونتيسة & ndash ؛ عداد الخلايا الآليThermoFisher ScientificC10227
عد خلايا الكونتيسة   شرائح الغرفةThermoFisher ScientificC10283
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
الماوس أحادي النسيلة المضاد للجسم المضاد للحمض النووي الريبي J2 & nbsp ؛الإنجليزية & الاستشارات العلمية Kft.10010200
الماعز المضادة للأرانب IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
SUPERSCRIPT III RT لايف تكنولوجيز18080085
SYBR QPCR SUPERMIX مع ROXLife Technologies11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR SystemThermo Fischer4471088
DNasePromegaM6101
Vero Cell Line  ATCCCCL-81
سلالة زيكا الفيروسية PRVABC59مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) IL-6
Peprotech200-06                         
IL-1 alpha             Peprotech200-01A                   
TNF-alphaPeprotech300-01A                   
إنترفيرون ألفا A   R & D Systems11100-1
Interferon betaPeprotech300-02BC
Interferon gammaPeprotech300-02
جهاز طرد مركزي 5415REppendorf5415R
طرد مركزي 5810REppendorf5810R
Nikon Eclipse Ti مجهر التألق المناعي مع نيكون Intenselight C-HGFIنيكونقم بزيارة نيكون للطلب
جهاز

المراجع

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al.....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مقايسة عيار الفيروستشكل اللويحاتتضاعف الجينومالعلاج بالإنترفيرونفحص السيتوكيناتخلايا Veroالكيمياء النسيجية المناعية الخلويةتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)