نقدم بروتوكول لتطبيق التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)، 3-الأبعاد جزيء واحد توطين طريقة سوبر قرار المجهر، لتصوير الهيكل الخلوي الأكتين في خلايا الثدييات ملتصقة. هذا النهج يسمح التصور القائم خفيفة من الميزات الهيكلية النانوية التي من شأنها أن تبقى على خلاف ذلك دون حل نتيجة التقليدي المجهر الضوئي محدودة الحيود.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مضان المجهر يمكن رؤية مباشرة من الجزيئات الحيوية محددة داخل الخلايا. ومع ذلك، للفحص المجهري مضان التقليدية، ويقتصر القرار المكانية التي الحيود إلى ~ 200 نانومتر داخل الطائرة صورة و> 500 نانومتر على طول المحور البصري. ونتيجة لذلك، المجهر مضان منذ فترة طويلة محدودة للغاية في مراقبة ملامح التركيبية داخل الخلايا. والتغلب على التطورات الأخيرة في طرق الفحص المجهري سوبر القرار هذا الحد. على وجه الخصوص، وظهور fluorophores photoswitchable تمكن القائم على توطين سوبر قرار المجهري، والتي تنص على حل السلطة يقترب من النطاق طول الجزيئي. هنا، نحن تصف تطبيق سوبر طريقة قرار المجهر ثلاثي الأبعاد على أساس واحد جزيء المجهري التعريب والتداخل متعدد المراحل، ودعا التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM). يوفر هذا الأسلوب قرار موحد الخواص على ما يقرب منترتيب 20 نانومتر في جميع الأبعاد الثلاثة. بروتوكولات لتصور الهيكل الخلوي الأكتين الخيطية، بما في ذلك إعداد العينات وتشغيل أداة iPALM، توصف هنا. هذه البروتوكولات هي أيضا قابلة للتكيف بسهولة ومفيدة لدراسة الخصائص التركيبية الأخرى في الخلايا.
المقدمة
كان التصور من الهياكل الخلوية المعقدة منذ فترة طويلة جزءا لا يتجزأ من رؤى البيولوجية والاكتشاف. على الرغم من أن الفحص المجهري مضان يمكن أن خلايا صورة مع خصوصية جزيئية عالية، ويقتصر حل السلطة عن طريق حيود إلى ~ 200 نانومتر في الطائرة صورة (س، ص، أو البعد الأفقي) و> 500 نانومتر على طول المحور البصري (ض، أو البعد المحوري) 1،2. وبالتالي، فإن مراقبة ملامح التركيبية تاريخيا تقتصر على المجهر الإلكتروني (EM). لحسن الحظ، فإن التطورات الأخيرة في القرار المجهر السوبر والتحايل هذا الحد، مما يتيح القرار المكانية في 10 - مجموعة نانومتر 100 1-6. على وجه الخصوص، نهج سوبر قرار بناء على توطين جزيء واحد، والمعروف من قبل المخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد العينات التصوير
- منذ إشارات مضان الخلفية تتداخل مع مضان من العلامات fluorophore، وتنظيف coverglasses قبل الشطف لأول مرة في المياه المتأينة ([ده 2 O) ثم الهواء تجفيفها باستخدام الهواء المضغوط. وفي وقت لاحق، نفذ النقش البلازما في نظافة البلازما لمدة 15 ثانية، أو أطول إذا لزم الأمر.
- لتمكين تصحيح الانحراف والمعايرة iPALM، استخدم # 1.5 الجولة (22 مم) coverglasses تنظيفها قبل جزءا لا يتجزأ من النانوية مع الفلورسنت كعلامات الإيمانية، التي تخدم fiducials كما صامد للغاية لمعايرة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
متطلبات حاسمة لiPALM هي محاذاة، والتسجيل، ومعايرة النظم البصرية. هذه هي اللازمة لضمان التدخل السليم داخل 3 في اتجاه شعاع الخائن شرطا لض تنسيق الاستخراج. لتمكين المراقبة المستمرة، ومصادر نقطة ثابتة من مضان ضرورية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الفلورسنت الاتحاد الافريقي أو النانوية ثنائية المعدنية 23 التي تنشأ من محلية الرنين مأكل السطح (LSPR) معان ضوئي. كما أنها بمثابة ثنائي القطب واحد مستقر على الإضاءة ويمكن عادة أن تكون مترجمة مع 5 - دقة 10.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويستند النظام البصري من iPALM على تصميم موضوعي 4 و- ð ثنائي تعارض، كما هو مبين في الشكل 1A. يتم إنشاء الإعداد باستخدام أجزاء كل من عرف تشكيله والتجارية البصريات الميكانيكية، كما هو موضح سابقا 23 والمدرجة في الجدول 1. بالإضافة إلى الإعداد لدينا، ومعهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) تستضيف النظام الذي هو في متناول المجتمع العلمي في مركز التصوير المتقدم في الحرم الجامعي بحوث Janelia. لرسومات كامل الميكانيكية، الخطط السيطرة، والبر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ستشغل وPK الامتنان الدعم المالي من مؤسسة البحوث الوطنية في سنغافورة، منحت لPK (جبهة الخلاص الوطني، NRFF-2011-04 وNRF2012NRF-CRP001-084). كما نشكر مختبر والأساسية المجهر مفتوحة مرافق MBI لدعم البنية التحتية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طاولة بصرية | Newport ، CA | RS4000 | iPALM ، مثبتة على 4 عوازل اهتزاز مثبت نيوبورت |
| عازل اهتزاز للطاولة البصرية | نيوبورت ، CA | S-2000 | |
| ليزر -642 | نيوبورت ، كاليفورنيا | 1185055 | طاقة الإخراج = 100 ميجاوات |
| ليزر -561 | نيوبورت ، كاليفورنيا | 1168931 | طاقة الإخراج = 200 ميجاوات |
| ليزر -488 | نيوبورت ، كاليفورنيا | طاقة الإخراج 1137970 | = 200 ميجاوات |
| ليزر-405 | نيوبورت ، كاليفورنيا | 1142279 | طاقة الإخراج = 100 ميجاوات |
| مرايا عازلة عريضة | Thorlabs ، NJ | BB1-E02 | مجمع ليزر |
| ثنائي اللون شعاع مقسم | سيمروك ، نيويورك | LM01-427-25 | |
| مرشح صوتي قابل للضبط | AA Opto-Electronic ، فرنسا | AOTFnC-VIS-TN | |
| خطي المستقطب | نيوبورت ، كاليفورنيا | 05LP-VIS-B | |
| ورشة عمل محلية | للوحة | مرآة تحول مخصصة | |
| (22.5 درجة ؛) | Reynard Corpporation ، CA | مخصصة | 22.5 درجة ؛ مرآة |
| بمحركات بصرية حوامل | تركيز جديد ، CA | 8816 | |
| مرحلة الترجمة الآلية XYZ | Thorlabs ، NJ | MT3 / M-Z6 | حامل عينة |
| T-Cube DC وحدة تحكم محرك سيرفو | Thorlabs ، NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente ، ألمانيا | S-303.CD | |
| عدسة موضوعية | نيكون ، اليابان | MRD01691 | الهدف. مرحلة ترجمة الزيت Apo TIRF 60X / 1.49 |
| تركيز جديد ، CA | 9062-COM-M | ||
| مشغل محرك بيكو | تركيز جديد ، CA | 8301 | |
| الملف اللولبي الدوار / مصراع | DACO Instruments ، CT | 5423-458 | |
| 3-way شعاع الفاصل | Rocky Mountain Instruments ، CO | مخصص | شعاع |
| التقطيع Piezo Z / Tip / Tilt | Scanner Physik Instrumente ، ألمانيا | S-316.10 | |
| محاذاة إمالة بمحركات خماسية المحاور | تركيز جديد ، CA | 8081 | |
| وحدة تحكم إيثرنت Picmotor | تركيز جديد ، CA | 8752 | |
| وحدات تحكم بيزو / مكبر للصوت / وحدة تشغيل رقمية | Physik Instrumente ، ألمانيا | E-509 / E-503 / E-517 | |
| مرشح تمرير النطاق | Semrock ، NY | FF01-523 / 20 | مرشحات |
| مرشح تمرير النطاق | Semrock ، NY | FF01-588 / 21 | |
| مرشح تمرير النطاق | Semrock ، NY | FF01-607 / 30 | |
| مرشح تمرير النطاق | Semrock ، NY | FF01-676 / 37 | |
| مرشح الشق | Semrock ، NY | NF01-405 / 488/561/635 | |
| عجلة المرشح الآلية مع التحكم | Thorlabs ، NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor ، المملكة المتحدة | DU-897U-CSO-#BV | 3 مجموعات |
| من أجهزة الكمبيوتر المكتبية للتحكم في الكاميرات ومزامنة | Dell | Precision T3500 | PC ، 4 مجموعات |
| أغطية مع | Hestzig الإيمانية ، VA | 600-100AuF | إعداد العينة. العلامات الإيمانية ذات الكثافة والأطياف المختلفة المتاحة |
| فيبرونيكتين | ميليبور ، MT | FC010 | |
| بارافورمالدهايد | إلكترون علوم الفحص المجهري ، تثبيت PA | 15710 | . 16٪ |
| الإلكتروني للجلوتارالديهايد | ، PA | 16220 | 25٪ |
| تريتون X-100 | سيجما ألدريتش ، MO | T8787 | |
| تقنيات الحياة لخلايا HUVEC | ، CA | C-015-10C | |
| تقنيات الحياة المتوسطة 200 | ، CA | M-200-500 | |
| العوامل | البطانية للأوعية الكبيرةLife Technologies ، CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin / Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin / EDTA | Life Technologies ، CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich ، MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base ، ماليزيا | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich ، MO | E3889 | |
| MgCl 2< / sub> | Millipore ، MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen ، CA | A22287 | تلطيخ |
| بوروهيدريد الصوديوم (NaBH 4< / sub>) | Sigma aldrich ، MO | 480886 | تبريد |
| الجلوكوز | 1st قاعدة ، ماليزيا | BIO-1101 | مخزن التصوير |
| الجلوكوز أوكسيديز | سيجما ألدريتش ، MO | G2133 | |
| كاتالاز | سيجما ألدريتش ، MO | C9322 | |
| سيستامين | سيجما ألدريتش ، MO | 30070 | |
| إيبوكسي | ثورلاب ، NJ | G14250 | |
| الفازلين | سيجما ألدريتش ، MO | 16415 | عينة ختم |
| اللانولين | سيجما ألدريتش ، MO | L7387 | |
| شمع بارافين | سيجما ألدريتش ، MO | 327204 | |
| غمر | زيت الغمر علوم المجهر الإلكتروني ، تصوير PA | 16915-04 | . كارجيل نوع HF |
المراجع
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super reso....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
