يصف هذا العمل سير عمل متقدما لتحديد دقيق وسريع لعدد خلايا NK (القاتل الطبيعي) وسمية الخلايا الطبيعية في عينات الدم البشري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
NK الخلية السمسة هو مقياس يستخدم على نطاق واسع لتحديد تأثير التدخل الخارجي على وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية. ومع ذلك، فإن دقة واستنساخ هذا الاختبار يمكن اعتبار غير مستقر، سواء بسبب أخطاء المستخدم أو بسبب حساسية الخلايا القاتلة الطبيعية للتلاعب التجريبية. للقضاء على هذه القضايا، تم إنشاء سير العمل الذي يقلل منها إلى أدنى حد ويرد هنا. ولتوضيح ذلك، حصلنا على عينات من الدم، في نقاط زمنية مختلفة، من العدائين (ن = 4) التي قدمت لنوبة شديدة من ممارسة الرياضة. أولا، الخلايا القاتلة الطبيعية ويتم تحديد وقت واحد وعزل من خلال وضع علامات CD56 والفرز على أساس المغناطيسي، مباشرة من الدم الكامل ومن اقل من واحد ملليلتر. تتم إزالة الخلايا القاتلة الطبيعية فرزها في أي كاشف أو متوجا الأجسام المضادة. ويمكن عدها من أجل إقامة دقيق NK عدد خلايا في كل ملليلتر من الدم. ثانيا، الخلايا القاتلة الطبيعية فرزها (المستجيبات الخلايا أو E) يمكن أن تكون مختلطة مع 3،3'-Diotadecyloxacarbocyanine البركلورات (ديو) الموسومة خلايا K562 (الخلايا المستهدفة أو تي) في ل1-فحص الأمثل: 5 T: نسبة E، وتحليلها باستخدام التصوير تدفق الكريات التي تسمح لتصور كل حدث والقضاء على أي إيجابية كاذبة أو السلبيات كاذبة (مثل الحلل أو خلايا المستجيب). ويمكن الانتهاء من هذا العمل في حوالي 4 ساعات، ويسمح للحصول على نتائج مستقرة جدا حتى عند التعامل مع العينات البشرية. عندما تكون متاحة، يمكن للفرق البحثية اختبار عدة تدخلات التجريبية في المواد البشرية، ومقارنة القياسات عبر عدة نقاط وقت دون التأثير على سلامة البيانات و.
المقدمة
الخلايا القاتلة الطبيعية تشكل عنصرا أساسيا من نظام المناعة الفطري. في حين أنها تنظم جدا، لديهم القدرة على التعرف والقضاء على الخلايا الشاذة من خلال الاتصال خلية الى خلية ودون تفعيل مسبق 1. على هذا النحو، فإنها تشكل خط سريع من الدفاع ضد الالتهابات. ممارسة، وخاصة مكثفة، وقد تبين لخفض عابر جهاز المناعة 2، 3، 4، 5. الخلايا القاتلة الطبيعية معرضة بشكل خاص لهذا الغرض 4، 6، 7، على نحو ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: أجريت جميع إجراءات جمع الدم وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة ولاية الآبالاش (ASU) لجنة المراجعة المؤسساتية (IRB).
1. جمع الدم كله
- هل لديك فصاد مصدقة رسم الدم وفقا لتوجيهات منظمة الصحة العالمية.
- سحب الدم إلى واحدة 4 مل أنبوب جمع الدم التي تحتوي على حمض دي البوتاسيوم Ethylenediaminetetraacetic (K 2 EDTA). عكس أنبوب جمع الدم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حافظ على أنبوب جمع الدم في درجة حرارة الغرفة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحديد عدد الخلايا القاتلة الطبيعية
وقد تم قياس تأثير تشغيل ثقيلا على عدد الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم الكامل، وذلك باستخدام بروتوكول ممارسة موضح في الشكل (2). تم سحب عينات من الدم قبل ممارسة، وعلى الفور بعد ممارسة الرياضة، و 1.5 ساعة بعد التمرين، وأخيرا 24 و 48 ساعة بعد التعادل الدم الأولي. وقد تم قياس تركيز الخلايا القاتلة الطبيعية لكل مليلتر من الدم الكامل لكل عداء (الشكل 3A) وفي المتوسط (الشكل 3.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة يقيس بشكل مباشر على نشاط محدد من الخلايا القاتلة الطبيعية الفرد في الاستجابة للمؤثرات (في هذه الحالة بالذات، وممارسة لفترات طويلة). عادة، يتم عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من دم واحد باستخدام تدرجات الكثافة أو الفرز الخلية باستخدام مزيج من علامات. في حين تستخدم هذه الأساليب على نطاق واسع، لديهم العديد من نقاط الضعف: أنها تستغرق وقتا طويلا، تنطوي على التلاعب متعددة، وتكون بشكل كبير الاستعمال يتوقف. ونتيجة لذلك، يتم وضع ضغوط لا داعي لها على الخلايا الق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا المشروع من قبل المنحة التنافسية لمبادرة أبحاث الزراعة والأغذية رقم 2100-68003-30395 من المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| K-562 الخلايا الليمفاوية | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | نسبة عالية من الجلوكوز ، مع L-Glutamine ، مع HEPES ، |
| Alpha Minimum Essential Medium | ATCC | CRL-2407 | بدون ريبونوكليوسيدات وديوكسي ريبونوكليوسيدات ولكن مع 2 ملي مولار L-glutamine و 1.5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم |
| Trypan Blue Solution 0.4٪ | Amresco | K940-100ML | حل |
| تلطيخ بروبريديوم يوديد | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO حل وضع العلامات | على الخلايا Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS تشغيل العازلة | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| عازلة الغسيل autoMACS | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| أعمدة autoMACS | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| الدم الكامل CD56 MicroBeads ، البشرية | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II مقياس التدفق الخلوي | للتصوير EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7٪ هيبوكلوريت (معقم) | VWR | JT9416-1 | |
| كولتر كلينز | بيكمان | كولتر 8546929 | |
| 70٪ إيزوبروبانول (مزيل الفقاعات ) EMD | Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (سائل غمد) EMD | Millipore | BSS-1006-B (1X) | خال من الكالسيوم أو المغنيسيوم |
| برنامج INSPIRE | EMD Millipore | الإصدار Mark II ، سبتمبر 2013 | |
| برامج تطبيقات الأفكار | EMD Millipore | الإصدار 6.1 ، يوليو 2014 |
المراجع
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
