إعداد الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الكبار ماوس النخاع الشوكي الأنسجة

ملخص

تطوير ألم الاعتلال العصبي وتشمل التغيرات المرضية للخلايا الحبل الشوكي الدبقية. نظام الثقافة الدبقية موثوقة مستمدة من أنسجة الحبل الشوكي الكبار ومصممة لدراسة هذه الخلايا في المختبر غير متوفرة. لذلك، نعرض هنا كيفية تأسيس الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الماوس الكبار نسيج الحبل الشوكي.

الملخص

وقد تم قبول جيدا أن الحبل الشوكي الردود الدبقية تساهم بشكل كبير في تطوير ألم الأعصاب. وقد تم الحصول على معلومات هائلة فيما يتعلق بأنشطة الدبقية على المستويات الخلوية والجزيئية من خلال المختبر في أنظمة زراعة الخلايا. نظم في المختبر تستخدم، وتشمل أساسا الدبقية الأولية المستمدة من الأنسجة القشرية الدماغ حديثي الولادة وخلد خطوط الخلايا. ومع ذلك، قد لا يعكس هذه النظم خصائص خلايا الحبل الشوكي الدبقية في الجسم الحي. من أجل مواصلة التحقيق في أدوار خلايا الحبل السري الدبقية العمود الفقري في تطوير الأعصاب الطرفية ألم الأعصاب الاصابة التي يسببها استخدام نظام الثقافة التي تعكس على نحو أفضل حالة في الجسم الحي، وقد وضعت لدينا مختبر طريقة لوضع الحبل الشوكي الأساسي الثقافات الدبقية مختلطة من فئران بالغة. لفترة وجيزة، يتم جمع النخاع الشوكي من فئران بالغة ومعالجتها من خلال الهضم غراء تليها إزالة المايلين مع أوكارإيتي-التدرج المتوسطة. تعليق خلية واحدة يتم تربيتها في كامل Dulbecco وسائل الإعلام النسر المعدلة (cDMEM) تستكمل مع 2-المركابتويثانول (2-ME) في 35.9 ^{درجة مئوية.} تم تحسين هذه الظروف والثقافة خصيصا لنمو الخلايا الدبقية مختلطة. في ظل هذه الظروف، الخلايا جاهزة لاستخدامها في التجارب بين 12-14 د (خلايا وعادة ما تكون في مرحلة سجل خلال هذا الوقت) بعد تأسيس ثقافة (D 0)، ويمكن أن تبقى في ظروف ثقافة تصل إلى D 21. هذا النظام الثقافة يمكن استخدامها لتحقيق استجابات خلايا الحبل الشوكي الدبقية على التحفيز مع مختلف المواد والوكلاء. إلى جانب ألم الأعصاب، وهذا النظام يمكن استخدامه لدراسة الاستجابات الدبقية في غيرها من الأمراض التي تنطوي على التغيرات المرضية للخلايا الحبل الشوكي الدبقية.

المقدمة

الألم المزمن هو مشكلة صحية خطيرة تؤثر على ما يقرب من 100 مليون من البالغين في الولايات المتحدة، مع تكلفة سنوية تقديرية تصل إلى 635000000000 ^$ 1. وقد أشارت أدلة متزايدة على مساهمة كبيرة من خلايا الحبل الشوكي الدبقية في تطوير ألم الأعصاب، واحدة من أكثر أنواع المدمرة للألم المزمن ^2. ومن شأن في المختبر نظام الثقافة السليم يساعد بشكل كبير في مواصلة التحقيق في دور الخلايا الدبقية على المستويات الخلوية والجزيئية.

حاليا، في المختبر أنظمة ثقافة الدبقية تستخدم من قبل الباحثين وتشمل الخلايا الدبقية أساسا مشتقة من الأنسجة القشرية من الأطفال حديثي الولادة الماوس أو الفئران العقول وتخليد خطوط الخلايا الدبقية مشتقة من الماوس حديثي الولادة أو خلايا الفئران الدبقية الأولية. خلايا حديثي الولادة تحتوي على أعداد كبيرة من خلايا غير متمايزة التي يمكن زيادة متباينة في الخلايا الدبقية (خاصة الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة)، وبالتالي توفيرخلايا bundant للاستخدام التجريبي ^3. ومع ذلك، فقد أظهرت دراستنا السابقة أن الأطفال حديثي الولادة الدماغ الخلايا الدبقية استجابت بشكل ملحوظ مختلفة من خلايا الحبل الشوكي الدبقية الكبار على lipopolysaccharide في (LPS) التحفيز. على سبيل المثال، انترلوكين (IL) -4 المعروضة تعزيز الآثار المثبطة على أكسيد النيتريك التي يسببها LPS (NO) الإنتاج في الفئران البالغين الدبقية الحبل الشوكي مقارنة مع الأطفال حديثي الولادة الدبقية في الدماغ ^4. وعلاوة على ذلك، لمحات من إنتاج chemokine على التحفيز من قبل نيوروبيبتيدي، الكالسيتونين الببتيد ذات الصلة الجين (CGRP)، تختلف بلا شك بين الماوس حديثي الولادة الدبقية في الدماغ (الطرق الموضحة في المرجع 5) والفأر الشوكي الكبار الدبقية الحبل (الشكل 1). خطوط الخلايا أنشئت هي سهلة الاستخدام والحفاظ على ويمكن أن توفر عدد كبير من الخلايا في فترة زمنية قصيرة. بشكل عام، خلد يتم إنشاء خطوط الخلايا إما باستخدام نظام تخليد بوساطة فيروس (مثل خط خلية دبقية تستخدم على نطاق واسع BV2) ^{6 أو 7} أو عشر التاليةتحديد البريد التحول التلقائي (مثل خط خلية نجمية C8-D1A وخط خلية دبقية C8-B4) ^{8، 9} خطوط خلية ممتازة في دراسة خصائص الجزيئية الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة بشكل فردي؛ ومع ذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا تتطلب دائما مزيدا من التحقق من الصحة في الخلايا الأولية أو في ظروف في الجسم الحي. كما ينبغي الإشارة إلى أنه لم يكن هناك تقرير من خط الخلايا الدبقية التي مشتق من الدبقية الحبل الشوكي القوارض.

للمساعدة في التحقيق في دور خلايا الحبل السري الدبقية العمود الفقري في تطوير ألم الأعصاب، ونظام الثقافة التي مشتق من الحبل الشوكي الماوس الكبار تم تطويرها من قبل التكيف مع طريقة ذكرت سابقا يستخدم لتوليد فأر بالغ مختلطة الثقافات الدبقية ^{4، 5} وقد تم صقل ثقافة الدبقية الماوس الحبل الشوكي مزيد مؤخرا ¹⁰ ويوصف في مزيد من التفاصيل في هذه المقالة. الكبار الحبل الشوكي مختلطة الثقافات الدبقية جوتنشأ مع ماوس من السلالات المختارة التي تتناسب مع احتياجات دراسة معينة، ويمكن الحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى 21 د الرد على الشروع في الثقافة. يمكن استخدام هذا الأسلوب في الدراسات ألم الأعصاب، وكذلك في التحقيقات من مختلف الأمراض العصبية التي تنطوي على تغييرات مرضية داخل الحبل الشوكي، مثل التصلب الضموري الجانبي (ALS)، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -associated الاعتلال العصبي الحسي، ومتعددة التصلب (MS).

البروتوكول

وتمت الموافقة على بروتوكول التالية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة نيو انغلاند. بروتوكول التالية لإعداد الثقافات الدبقية من 4 الماوس الكبار النخاع الشوكي.

1. إعداد حلول في هود الثقافة تحت ظروف معقمة

1. إعداد وسائل الإعلام والثقافة: تعديل كامل Dulbecco وسائل الإعلام النسر (cDMEM) التي تحتوي على DMEM (مع 4.5 جم / لتر جلوكوز)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ملغ / مل الستربتومايسين 250 نانوغرام / مل الامفوتريسين B، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول (2-ME؛ انظر 1.1.1). خلط وتصفية تعقيم جميع مكونات أخرى ثم قم بإضافة FBS. تخزين وسائل الإعلام والثقافة في 4 ^{درجة مئوية.}
   1. تجهيز 50 مم 2-ME / الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل الأوراق المالية: إضافة 100 ميكرولتر من تركزت 2-ME (14.3 م) إلى 28.6 مل من برنامج تلفزيوني 1X، ومرشح تعقيم (يمكن تخزين الحل في 4 ^درجة مئوية لمدة عدة أشهر). Uحد ذاتها 1 مل من 2-ME حل سهم مقابل كل 1000 مل من وسائط الثقافة.
2. إعداد وسائل الإعلام كثافة التدرج
   1. إعداد المخزون متساوي التوتر حل وسائل الإعلام التدرج الكثافة (على سبيل المثال، 100٪ Percoll) من 1 جزء 10X منتظم برنامج تلفزيوني العقيمة و 9 أجزاء وسائل الإعلام التدرج معقمة كثافة الأوراق المالية (على سبيل المثال، Percoll).
   2. تمييع 100٪ وسائل الإعلام التدرج الكثافة (صنع في 1.2.1) مع 1X منتظم برنامج تلفزيوني العقيمة لجعل 20٪ من وسائل الإعلام التدرج الكثافة (على سبيل المثال، 10 مل من 100٪ وسائل الإعلام كثافة التدرج مع 40 مل من برنامج تلفزيوني 1X) وتخزينها في 4 ^{درجة مئوية.} تحقيق 20٪ من وسائل الإعلام كثافة التدرج في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل إعداد ثقافة الخلية.
3. إعداد الحلول من نظام التفكك غراء
   ملاحظة: يمكن التعرف على نظام التفكك غراء في جدول المواد. ويمكن أيضا مجموعات التفكك مماثلة أخرى (بما في ذلك هؤلاء الذين اجتمعوا في منزل) يمكن أن تستخدم. جميع عناصر حيجب أن يكون اليلة العقيمة.
   1. إضافة 32 مل من ايرل محلول الملح المتوازن (EBSS) إلى خليط مخاطاني البيض المانع (مسحوق).
   2. إضافة 5 مل من EBSS إلى قارورة غراء واحد (مسحوق). ضع قارورة غراء في 37 ^درجة مئوية حمام الماء لمدة 10 دقيقة أو حتى يذوب غراء.
   3. إضافة 500 ميكرولتر من EBSS إلى قنينة الدناز واحد (مسحوق). المزيج بلطف.
   4. إضافة 250 ميكرولتر من محلول الدناز (أعلاه) إلى القارورة غراء.
   5. حساب المبلغ الإجمالي للأعلاه خليط غراء / الدناز الحاجة (حوالي 800 ميكرولتر من غراء / الدناز الخليط في الماوس الحبل الشوكي) ونقل خليط حاجة إلى أنبوب 50 مل للهضم الأنسجة (الخطوة 3.2). تخزين الطعام المتبقي في قارورة الأصلي في 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين على الأقل.
   6. منع جميع المكونات من مجموعات على الجليد لحين الحاجة إليها.
4. إعداد العمود الفقري أنابيب جمع الحبل: واحد عقيم أنبوب 15 مل مع 5 مل من محلول ملح هانك المتوازن (HBSS، من نظام غراء التفكك،0؛ لجمع النخاع الشوكي) ومعقم 15 أنبوب واحد مل مع برنامج تلفزيوني 1X (لملء حقنة 5 مل، راجع الخطوة 2.4). وبالإضافة إلى ذلك، وإعداد طبق واحد عقيم بتري (35 مم أو 60 مم) مع 5 مل من HBSS وابقائه في هود الثقافة.

2. الحبل الشوكي مجموعة

ملاحظة: يجب أن تكون جميع المعدات المعقمة. أداء المجموعة في مجال معين وافق عليها IACUC.

1. الحصول على الأدوات التالية للحصاد الماوس النخاع الشوكي: حادة مقص مستقيمة حادة / 18 سم الجراحية، مشرط 12 سم القياسية (# 3 الصلبة)، والكربون الصلب معقمة شفرات مشرط رقم 10، وهي آلة فصل الرأس الحيوانات الصغيرة، 12 سم، ومعيار المنحني ملقط، و20G إبرة معقمة تعلق على حقنة 5 مل.
2. الموت ببطء الحيوان مع CO ₂ وتطهير الرأس الماوس والمنطقة الخلفية مع 70٪ من الإيثانول (ETOH).
3. قطع رأس الحيوان مع آلة فصل الرأس. جعل شق طولي الأوسط على أسفل الظهر لفضح طبقة العضلات. صنعوtransection نظيفة من خلال العمود الفقاري على مستوى الورك (قطع أيضا من خلال طبقة العضلات التي تغطي العمود الفقاري) مع مقص جراحي مستقيم معقمة (18 سم).
4. وضع الحيوان على ورقة جديدة يمكن التخلص منها القضاء. إدراج بعناية إبرة G 20 (تعلق على حقنة 5 مل مملوءة العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (الخطوة 1.4)) في العمود الفقري نحو الجانب منقاري. عقد الحيوان أسفل بإحكام ودفع الحقنة بسرعة. الحبل الشوكي كله يجب أن يخرج من نهاية عنق الرحم. جمع النخاع الشوكي في أنبوب 15 مل تحتوي على HBSS.
5. كرر الخطوة 2.4 لبقية الفئران. بين كل حيوان، وتطهير جميع الأدوات المستخدمة مع 70٪ ETOH.
   ملاحظة: عادة، يمكن إنشاء واحدة 12 لوحة جيدا لكل 4 الماوس النخاع الشوكي (انظر 4.3).

3. إعداد تعليق خلية واحدة

ملاحظة: تنفيذ الخطوات 3 و 4 في الثقافة هود للحفاظ على كل شيء العقيمة.

1. نقل عن النخاع الشوكي في طبق بتري HBSS التي تحتوي على (الخطوة 1.4). قطع كل من النخاع الشوكي إلى العديد من القطع الجميلة، الصغيرة مع مقص العقيمة وملقط. نقل الأنسجة في الحبل الشوكي إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على غراء استعداد / الدناز الإنزيم خليط (الخطوة 1.3.5) باستخدام ملقط معقم أو 10 مل ماصة (تجنب إضافة HBSS إلى خليط الانزيم، حيث سيؤدي ذلك إلى مزيد من إضعاف أعدت حل انزيم وقد يؤدي إلى انخفاض الأداء للانزيم).
2. دوامة أنبوب بلطف لمزج. احتضان الأنبوب عند 37 ^درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة / شاكر مع المدار اهتزاز في 150 دورة في الدقيقة.
3. دوامة الأنبوب مرة أخرى وبقوة يسحن الحل الانزيم مع النسيج باستخدام 5 مل ماصة لتشجيع المزيد من التفكك.
4. نقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
5. أثناء الطرد المركزي، خلط 2.7 مل EBSS مع 300 ميكرولتر من إعادة تشكيل INH الألبومين مخاطاني البيضحل ibitor (1.3.1) في أنبوب العقيمة. إضافة 150 ميكرولتر من محلول الدناز (الخطوة 1.3.3).
6. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف و resuspend بيليه الخلية مع الحل أعد فوق (الخطوة 3.5). دوامة جيدا لكسر بيليه الخلية.
7. إضافة 3 مل من تشكيلها حل المانع الألبومين مخاطاني البيض (الخطوة 1.4.1) إلى تعليق خلية. خلايا الطرد المركزي في 70 x ج لمدة 6 دقائق على RT. إزالة طاف (التي تحتوي على شظايا غشاء).

4. مزيد من إزالة المايلين من تعليق خلية واحدة

1. إضافة 8 مل من 20٪ سائل الإعلام التدرج الكثافة (المعد في الخطوة 1.2.2) في الأنبوب الذي يحتوي على بيليه الخلية، دوامة بلطف لعرقلة بيليه، وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 800 x ج لمدة 30 دقيقة في RT دون الكبح. بعناية إزالة الطبقة العليا من الحطام (ومعظمهم المايلين)، وطاف، ولكن يبقى بيليه.
2. للتخلص من بقايا التدرج الكثافة، وغسل الخلايا عن طريق resuspendiنانوغرام بيليه الخلية مع 8 مل من cDMEM المخفف (1 جزء cDMEM و 2 أجزاء HBSS). الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 ^{درجة مئوية.} إزالة طاف وغسل الخلايا مرة أخرى مع cDMEM المخفف (أعلاه) بنفس الطريقة. تبقي الخلايا على الجليد حتى بذر لهم.
3. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في وسائل الإعلام ثقافة (cDMEM المتوفرة مع 2-ME (المعد في الخطوة 1.1)). واحد 12 لوحة جيدا، استخدام 3 مل × 4 (عدد من الفئران المستخدمة) + 2 مل = 14 مل سائل الإعلام. وهذا يضمن أن هناك تعليق خلية كافية لوحة كاملة (12 بئرا)، وسوف توفر للآبار الإضافية التي يمكن استخدامها لتحديد متوسط ​​عدد الخلايا لكل بئر ومحتوى دبقية من الثقافة. إذا كان سيتم استخدام أنواع أخرى من السفن الثقافة، وحساب الحجم الكلي للسائل الإعلام والثقافة اللازمة نسبيا.
4. إضافة 1 مل من تعليق خلية في كل بئر من لوحة ال 12 أيضا.
5. احتضان الخلايا عند 35.9 ^درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
تغيير وسائل الإعلام (إزالة وسائل الإعلام القديمة عبر الطموح) على D 1 ثم كل 3-4 د بعد ذلك (عادة تغيير وسائل الإعلام على D: 1، 4، 8، و 11، ومن ثم استخدام الخلايا في يوم 12).
ملاحظة: في يوم 1، قد يحتوي على ثقافة كميات كبيرة من الحطام بسبب المايلين بقايا من أنسجة الحبل الشوكي. وبالتالي، وتغيير وسائل الإعلام في يوم 1 غير موصى بها (يرجى الاطلاع على مناقشة للمزيد من المعلومات). الثقافات جاهزة لتلقي العلاج بين D 12 - 14. خلايا وعادة ما تكون 80٪ متكدسة في D 12 ويمكن أن تكون قرب 100٪ متموجة التي كتبها D 14. عادة، على D 12، هناك حوالي 100،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 12-جيدا .

الشكل 2: صور الممثل الخلايا الدبقية المختلطة في أوقات مختلفة بعد تأسيس ثقافة الدبقية مختلطة أعدت الدبقية مختلطة الحبل الشوكي الأولية من الكبار C57BL / 6 الفئران. صور الممثليظهر تقدم ثقافة الدبقية بعد الطلاء. في يوم 1، وتعلق بعض الخلايا إلى لوحة الثقافة، لكنها لا تزال في معظمها الجولة. هناك أيضا العديد العائمة الخلايا والحطام كبير. في يوم 4، وترد الغالبية العظمى من الخلايا إلى لوحة الثقافة. الخلايا تبدو متشعبة مع عمليات مرئية. يتم توزيع الخلايا بشكل متقطع والثقافات حوالي 20-30٪ متكدسة في هذا الوقت. في يوم 8 والثقافات ما بين 50-60٪ متموجة. بعض المناطق من الثقافات لديها بقع كبيرة من الخلايا. مناطق أخرى من الثقافات لديها نمو متفرق من الخلايا. بعض الخلايا داخل بقع تأخذ على ظهور "مربع يشبه". في اليوم 12 والثقافات هي عند أو فوق 80٪ متموجة (حوالي 90٪ متكدسة في الصورة هو موضح هنا). خلية هم في مرحلة سجل النمو في هذا الوقت وبين أيام 12-14 هو الوقت الأمثل لاستخدام الخلايا الدبقية لإجراء التجارب. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

7. دراسة مضمون دبقية باستخدام خلايا من آبار إضافية (خطوة 4.3) عن طريق القياسية مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) بروتوكول تلطيخ ¹¹ باستخدام مزيج من مكافحة فأر-CD45 و CD11b الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس المضادة. ويتم تحديد الخلايا CD45 ⁺ CD11b ⁺ كما الخلايا الدبقية الصغيرة.

النتائج

وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لإعداد الخلايا الدبقية مختلطة من كل من الفئران والجرذان. يجب أن يكون إجمالي متوسط ​​عدد الخلايا في بئر في لوحة ال 12 أيضا على D 12 بعد بدء للثقافة مستقرة نسبيا، مع حوالي 100،000 الخلايا لكل بئر عندما يتم اشتقاق الخلايا من النخاع الشوكي الماوس. الخلايا الدبقية التي تم الحصول عليها من هذه الطريقة يمكن أن تستخدم في التجارب التي تم تصميمها لدراسة الردود الحبل الدبقية العمود الفقري الكبار على إدارة المواد وكلاء المصالح

المناقشة

ومن الأهمية بمكان تنفيذ جميع الخطوات، بما في ذلك وسائل الإعلام تغيير جدول بطريقة متسقة من أجل الحصول على نتائج استنساخه بين التجارب. الخطوات التالية هي الحاسمة ولا سيما في الحصول على نوعية ممتازة الكبار الدبقية مختلطة.

عملية الهضم الأنزيمي هو جانب هام من هذا البروتوكول. ومن الأهمية بمكان أن قطعة نسيج يتم هضمها بشكل جيد من أجل الحصول على تعليق خلية واحدة. ومع ذلك، فإن الإفراط في الهضم يؤدي إلى خلايا أقل بكثير. يحت...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
دولبيكو تعديل النسر s media (DMEM) مع 4.5 جم / لتر جلوكوز	Lonza	12-709F	وسائط cDMEM هي وسائط استزراع قياسية ومستخدمة على نطاق واسع. يمكن للباحثين الأفراد تحديد مكان شراء DMEM وجميع المكونات الأخرى المستخدمة في صنع وسائط cDMEM.
L-Glutamine (100x)	Lonza	17-605E	L-glutamine هو مكون قياسي يستخدم على نطاق واسع لوسائط الاستزراع المختلفة. يمكن للباحثين الأفراد أن يقرروا مكان شراء L-glutamine.
محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطريات (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	هذا مزيج من البنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين المصمم ليحتوي على 10,000 وحدة / مل من البنسلين G و 10 مجم / مل من كبريتات الستربتومايسين و 25 ميكرو ؛ جم / مل أمفوتريسين ب. يمكن للباحثين الأفراد تحديد مكان شراء المكونات الفردية.
2-mercaptoethanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا والبيولوجيا الجزيئية والرحلان الكهربائي.
نظام تفكك غراء	شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية	LK003150	يمكن شراء المكونات الفردية لهذه المجموعة بشكل منفصل.
يباع Percoll	GE Health Care	17-0891-01	Percoll كمحلول معقم. يمكن إعادة تعقيم Percoll غير المخفف إذا لزم الأمر.
حاضنة خط المختبر / شاكر	بارستيد / مختبر خط	MaxQ4000   ؛	هذه هي الحاضنة / شاكر لدينا حاليا. يمكن استخدام أنواع أخرى من الهزازات بدلا من ذلك.
عديدات السكاريد الدهنية ، السالمونيلا مينيسوتا < / م > Re595	Sigma-Aldrich	L-9764	يمكن أن تحفز سلالات أخرى من LPS أيضا استجابات دبقية. ومع ذلك ، قد يختلف حجم الردود.
الماوس IL-6 DuoSet ELISA	R & D Systems	DY406	يمكن لكل باحث فردي اختيار مجموعة ELISA التي يفضلها.
الماوس TNF-alpha DuoSet ELISA	R & D Systems	DY410	يمكن لكل باحث فردي اختيار مجموعة ELISA التي يفضلها.
الماوس IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA	R& D Systems	DY466	يمكن لكل باحث فردي اختيار مجموعة ELISA التي يفضلها.
الفأر MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia مجموعة	BD Biosciences	555260	يمكن لكل باحث فردي تحديد مجموعة ELISA التي يفضلها.
كيموكين الفأر Q-Plex	Quansys Biosciences	120251MS	لم يكن هذا المنتج متاحا للفحص الداخلي في ذلك الوقت. بدلا من ذلك ، أرسلنا عينات إلى الشركة المصنعة لتحليلها.
يمكن استخدام APC-anti-mouse CD45 (استنساخ 30-F11)	eBioscience	17-0451	جسم مضاد من نفس الاستنساخ ولكن من بائعين آخرين.
يمكن استخدام FITC-anti-mouse CD11b (استنساخ M1 / 70)	eBioscience	11-0112	جسم مضاد من نفس الاستنساخ ولكن من بائعين آخرين.
التدفق الخلوي Accuri C6	BD Biosciences	BD Accuri C6 & nbsp ؛	يمكن لكل باحث على حدة استخدام أي مقياس تدفق خلوي يفضله.
برنامج FlowJo	Tree Star، Inc.	FlowJo7.6.5	يمكن لكل باحث على حدة استخدام أي برنامج تحليل يفضله.

مقياس