Method Article

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

DOI:

10.3791/54819

⸱

December 14th, 2016

 ,  ,  , 
1Physiology and Experimental Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Clinical Microbiology, Royal College of Surgeons in Ireland, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Pediatrics, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تصور تطور الأغشية الحيوية بعد التعرض لعوامل المضيف باستخدام نموذج غرفة الشريحة. يسمح هذا النموذج بالتصور المباشر لتطوير الأغشية الحيوية بالإضافة إلى تحليل معلمات الأغشية الحيوية باستخدام برامج الكمبيوتر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون الأغشية الحيوية من مجموعة من البكتيريا المغطى في مصفوفة يفرز النفس. أنها تلعب دورا هاما في التلوث الصناعي وكذلك في تطوير واستمرار العديد من الأمراض المتصلة بالصحة. تحدث أحد الأغشية الحيوية صفها وصفا جيدا ودرس في الأمراض التي تصيب البشر في عدوى الالتهاب الرئوي المزمن من مرضى التليف الكيسي. عند دراسة الأغشية الحيوية في سياق المضيف، يمكن أن العديد من العوامل تؤثر تشكيل بيوفيلم والتنمية. من أجل تحديد مدى العوامل المضيفة قد تؤثر على تشكيل بيوفيلم والتنمية، استخدمنا طريقة ساترة تشامبيريد ثابت للنمو الأغشية الحيوية في وجود عوامل المستمدة من المضيفة في شكل supernatants البلغم. هي المصنفة البكتيريا في غرف ومعرضة للالرواشح البلغم. وبعد 48 ساعة من النمو، هي ملطخة الأغشية الحيوية مع بيوفيلم مجموعة الجدوى التجارية قبل الفحص المجهري متحد البؤر والتحليل. وبعد الحصول على الصور، والخصائص بيوفيلم يمكن تقييم استخدام منصات البرمجيات المختلفة.هذا الأسلوب يسمح لنا تصور الخصائص الأساسية للنمو بيوفيلم في وجود مواد مختلفة بما في ذلك المضادات الحيوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأغشية الحيوية البكتيرية هي مجموعات من الكائنات الحية الدقيقة التي تعلق على بعضها البعض، والمغطى في مصفوفة يفرز النفس. 1،2 كلاسيكي، إلا أنها تمثل البكتيريا تعلق بدنيا لسطح اللاأحيائي أو الحيوية شكلت في ظل ظروف التدفق. وقد تبين أيضا الأغشية الحيوية للنمو في ظروف ثابتة (غياب تدفق) والقاصي من السطوح، مثل في واجهة الهواء السائل من الحمامات الحرارية أو pellicles شكلت في أنابيب الاختبار. منذ فترة طويلة التعرف على هذه الأغشية الحيوية في البيئة وهم اذى رئيسيا في العمليات الصناعية، كما أنها يمكن أن تشكل في خزانات المياه أو في الأنابيب، مما أدى إلى biofouling والتآكل والعقبات. 3،4

الأغشية الحيوية هي أيضا حاسمة في مرافق الرعاية الصحية، كما ثبت أن تشارك في العدوى المرتبطة القسطرة، والالتهابات الرئوية في مرضى التليف الكيسي، وكذلك في التهابات أخرى عديدة. 5،6 واحدة من السمات المميزة لالتهابات بيوفيلم هي ديمجعدة قابلية البكتيريا للمضادات الحيوية وضعاف إزالة من قبل النظام المناعي الفطري. 7-9 درست معظم جيدا، والسيناريوهات ذات الصلة سريريا تنطوي عدوى القائم على بيوفيلم يحدث في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF)، المصابين المزمنين مع الأغشية الحيوية الزنجارية الزائفة. الزائفة الزنجارية يمكن أن يخضع لعدد من التغييرات خلال إنشاء عدوى مزمنة تجعل من الصعب جدا لعلاج. يمكن 10،11 الأغشية الحيوية تفعيل تفاضلي المناعة الفطرية ودفع الالتهاب. 12-14 وهذه الالتهابات تؤدي إلى زيادة معدلات الاعتلال والوفيات في مرضى التليف الكيسي، فمن الأهمية بمكان أن نفهم العوامل التي يمكن أن تؤثر على التنمية بيوفيلم في هذا السياق.

وتشير دراسة حديثة إلى أن العوامل المضيفة هي الحاسمة في تشكيل المجاميع بيوفيلم الزائفة الزنجارية. وتساهم 15 هذه الأغشية الحيوية لتقليل التعرض للمضادات الحيوية وآليات دفاع المضيف. وبريسيالامتحانات التنافسية الوطنية من العوامل المستمدة من المضيفة، كالإيلاستاز العدلة، فضلا عن المنتجات يفرز من الكائنات الدقيقة الموجودة في CF الرئة، لديها القدرة على تعديل إلى حد كبير تشكيل بيوفيلم والتنمية. 16 وبالإضافة إلى ذلك، الأغشية الحيوية تتفاعل مع المضيف لتعديل تعبير عن العديد من الممرات وبدء الالتهاب. في حين أساليب إنتاجية عالية، مثل معيار فحص الكريستال البنفسجي، يمكن أن توفر بعض المعلومات فيما يتعلق بعملية بيوفيلم، والتصور للبيوفيلم ردا على هذه العوامل توفر مزيد من المعلومات المتعمقة.

في هذه المخطوطة وصفنا طريقة لاستخدام عوامل من البلغم من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي لدراسة تطوير الأغشية الحيوية في المختبر. وتسمح هذه الطريقة لتصور السريع الأغشية الحيوية تتعرض لعوامل المضيف البلغم التي تحتوي على استخدام عدة قابلية بيوفيلم التجارية. هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد بصريا التغييرات التي تحدث أثناء نمو بيوفيلم في وجود exogenoلنا المنتجات، ويمثل طريقة تحسين لتحليل التغيرات في التنمية بيوفيلم في ظل ظروف مختلفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لاحظ أن بحوث أخلاقيات المجلس (جندي كونفدرالي) مطلوب لجمع وتخزين عينات البلغم من البشر. تمت الموافقة على هذه الدراسات من قبل مستشفى المرضى الأطفال REB # 1000019444.

1. إعداد عينات البلغم CF

  1. جمع عينة البلغم من المرضى خلال الزيارات الروتينية للعيادة التليف الكيسي والحفاظ على الجليد.
  2. نقل عينة البلغم على الجليد في غضون الساعة الأولى من جمع، إلى مختبر للأبحاث، إلى الخضوع لمعالجة.

2. معالجة البلغم

  1. سجل حجم عينة البلغم الحصول عليها. إضافة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 2x حجم العينة (أي 2 أجزاء PBS، 1 جزء العينة).
  2. خلط العينة بشكل جيد مع ماصة نقل. دوامة العينة على أعلى الإعداد لمدة 1 دقيقة لخلط تماما.
  3. قسامة 1 مل من الخليط المذكور أعلاه في عدد 1.5 مل أنابيب microcentrifuge المناسبة وتدور باستمرار في 5000 x ج ل20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  4. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف وتجاهل بيليه.
  5. فلتر تعقيم طاف من خلال مرشح 0.22 ميكرون وجمع في أنبوب microcentrifuge نظيفة.
    ملاحظة: يتم اختبار العقم من الترشيح من قبل الطلاء على LB أجار وبتلقيح السائلة وسائل الإعلام.
  6. تخزين طاف البلغم في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
    ملاحظة: البلغم من يمكن أيضا تجميع المرضى متعددة بعد الترشيح.
  7. قبل استخدامها، وتمييع البلغم الترشيح 1/10 ت / ت (100 ميكرولتر من البلغم، 900 ميكرولتر من وسائل الاعلام) في وسائل الإعلام المرجوة.
    ملاحظة: هنا، تم استخدام مرق استذابة القياسية (LB) وسائل الاعلام.

3. غرف الطريقة ساترة لتشكيل بيوفيلم

  1. تنمو عزل البكتيريا من بين عشية وضحاها الاهتمام في وسائل الإعلام المطلوب عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
    ملاحظة: استخدمت عدد من البكتيريا المختلفة، بما في ذلك السريرية عزلات الزائفة الزنجارية، المكورات العنقودية الذهبية،بيركولديريا مجمع الشرهة وxylosoxidans المنتصلة. اختيار وسائل الاعلام يعتمد على سلالات وشروط الفائدة، ولكن وسائل الاعلام LB يمكن استخدامها لإجراء التجارب الأولية.
  2. من الثقافة بين عشية وضحاها، ضع 40 ميكرولتر من ثقافة إلى 4 مل من وسائل الإعلام الجديدة وتنمو لمدة 3-4 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) للحصول على الثقافة مع الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) ما يقرب من 0.5 -0.6.
  3. تمييع الثقافة من الخطوة 3.2 إلى 1/5 في وسائل الإعلام المطلوب مع 10٪ البلغم الترشيح أو بدون الترشيح البلغم (كما المراقبة). تركيز الآخرين من الترشيح البلغم يمكن اختبار (أي 50٪ أو 100٪).
  4. استخدام 200 ميكرولتر من التخفيف البذور آبار غرف الشرائح.
  5. تسمح للبكتيريا ان نعلق لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية دون أن تهتز.
  6. بعد 4 ساعات، وإزالة وسائل الإعلام وبلطف يغسل بيوفيلم مع وسائل الإعلام الجديدة 1X. استبدال 200 ميكرولتر وسائل الإعلام الجديدة.
    ملاحظة: لدراسة آثار البلغم على بيوفيلم، وFRESوينبغي أن تتضمن وسائل الاعلام ح البلغم طاف.
  7. تسمح الأغشية الحيوية لتنمو لكمية من الوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية دون أن تهتز، لتحل محل وسائل الاعلام كل 12 ساعة، دون غسل حتى الوقت للفحص المجهري.
    ملاحظة: لدراسة تأثير supernatants البلغم على القابلية للمضادات الحيوية بيوفيلم، تتم إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام بعد 24 ساعة من نمو بيوفيلم ويتم الاحتفاظ بها في وسائل الإعلام حتى تلطيخ والتصوير الأغشية الحيوية.

4. تلطيخ الأغشية الحيوية ومتحد البؤر المجهري

  1. وعقب المطلوب الوقت نمو (24-48 ساعة يعمل بشكل أفضل)، وإزالة وسائل الإعلام من الآبار الغرفة وغسل بلطف كل غرفة مرتين مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة.
  2. تحضير خليط تلطيخ للبيوفيلم عن طريق خلط 1 ميكرولتر من كل صبغ (المنصوص عليها في عدة الجدوى) لكل مل من محلول الحاجة. جعل الصبغة في محلول مائي أو وسائل الإعلام.
    ينصح المياه من قبل الشركة المصنعة: ملاحظة.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من خليط الصبغة لكل بئر من covergla غرفSS ويحضن في درجة حرارة الغرفة، في الظلام لمدة 45 دقيقة.
  4. إزالة خليط تلطيخ من الغرف وغسل كل بئر مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها مع المياه العذبة أو وسائل الإعلام.
  5. المضي قدما في التصور الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

5. تصور الأغشية الحيوية مع متحد البؤر المجهري

  1. قراءة الأغشية الحيوية الملون في غرف مباشرة بعد تلطيخ (في حدود 1 ساعة). تقليل التأخير في التصور من الشرائح التي تلطيخ 1-2 غرف 8 جيدا في كل مرة.
  2. أداء التصوير باستخدام متحد البؤر المجهر مع الليزر لالإثارة وتصفية مجموعات لاقتناء.
    ملاحظة: هنا، والغزل نظام القرص متحد مع ليزر بورياليس الطيفية استخدمت لإثارة (الأخضر: 561 نانومتر: 491nm، الأحمر). واستخدمت الانبعاثات تصفية مجموعات من 515/40 و624/40 لتصور البقع من عدة قابلية بيوفيلم.
  3. التقاط صور باستخدام الهدف المياه 25X على المجهر متحد البؤر مع الكاميرا.
    4. استخدام Z-الأكوام لنموذج بيوفيلم. التقاط صور كل 0.5-1 ميكرون ابتداء من اول طائرة في التركيز على الإطار في التركيز الأخير من بيوفيلم (عادة تمتد 30-80 ميكرومتر لمدة 48 الأغشية الحيوية ساعة)
  4. يستغرق 3-5 صور من كل جانب.
    ملاحظة: وهكذا لمدة 8 ساترة غرف جيدا، سيتم إنشاء 24-40 الصور.
  5. حفظ الصور للتحليل.
    ملاحظة: يجب حفظ الصور كملفات OME-TIFF ليتم تحليلها باستخدام COMSTAT 18،19. تعليمات لتحليل الصور بيوفيلم يمكن العثور عليها في http://www.comstat.dk/. مرة واحدة يتم استيراد الصور والمعلمات مثل سمك متوسط ​​والكتلة الحيوية وتغطية السطح لكل قناة (الأحمر والأخضر) يمكن تحليلها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمثل التصميم الشامل للتجربة في الشكل 1. استخدام هذا البروتوكول يوفر طريقة مريحة لتصور التغيرات في الأغشية الحيوية نمت لفترات زمنية مختلفة (على سبيل المثال، 24، 48 أو 72 ساعة). الأهم من ذلك، إشارات خارجية، مثل البلغم الرواشح، ويمكن أن يضاف إلى تصور التغييرات في تطوير بيوفيلم. كما رأينا في الشكل 2، وجود 10٪ الرواشح البلغم يمكن تغيير بنية بيوفيلم (الشكل 2A، لوحات أقل). ويمكن تحليل 16

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطرق الموضحة في هذه الوثيقة تسمح لتصور الأغشية الحيوية البكتيرية التي تزرع في وجود المنتجات الخارجية. ليس من المستغرب أن إنتاج exoproducts له أهمية عند استخدام هذا النوع من النظام. على سبيل المثال، Dithiothreitol (DTT)، وغالبا ما تستخدم على عينات البلغم الإنسان لمساعدة تسييل العينات. ومع ذلك، فإن تأثير التلفزيون الرقمي الأرضي وحدها يمكن أن تقلل تنمية بيوفيلم وقدرتها على البقاء (لا تظهر البيانات). وهكذا، والضوابط المناسبة لجميع الشروط اللازمة. وعلاوة على ذلك، إضافة منتجات البلغم ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السل يعترف زمالة بحثية من التليف الكيسي كندا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lab-Tek II غطاء زجاجي ، # 1.5 بورسليكات ، 8 آبارThermo Sicher Scientific155409
Filmtracer Live / Dead Biofilm Viabilty KitThermo Fisher ScientificL10316
Blood agar platesThermo Fisher ScientificR10215تأكيد الجدوى عبر أعداد CFU أو اختيار مستعمرات للتلقيح
COMSTATAvailble عبر الإنترنتCOMSTAT هو برنامج لتحليل صور الأغشية الحيوية. متاح www.comstat.dk 
Millers LB BrothThermo Fisher Scientific12780-052الوسائط القياسية لنمو gowth / biofilm بين عشية وضحاها
مرشحات حقنة Millex-GVMilliporeSLGV013SLتصفية المواد الفوقية للبلغم
محلول ملحي مخزن (Dulbecco A)OxoidBR0014Gغسل غرف الأغشية الحيوية بعد إزالة الوسائط
Zeiss AxioVert 200MCarl Zeiss
هاماماتسو C9100-13 EM-CCDQS TECHNOLOGIES INC.
شركة Spectral BorealisQs Technologies Inc.
Perkin Elmer VolocityQS Technologies Inc.يمكن العثور على التعليمات الخاصة بهذا البرنامج على: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf
برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
  2. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  3. Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
  4. Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
  5. Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  6. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
  7. Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
  8. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  9. Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
  10. Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
  11. Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
  12. Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
  13. Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
  14. LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).
  15. Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
  16. Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
  17. Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
  18. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  19. Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms . Informatics and Mathematical Modelling. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).
  20. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chambered Coverglass ModelBiofilm DevelopmentSputum EffectsConfocal MicroscopyBiofilm Viability KitAntibiotic EfficacyBacterial SeedingPBS WashingComstat AnalysisBurkholderia Cepacia

Related Articles