يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ومنصة للفحوصات مكافحة بيوفيلم مناسبة لاستكشاف المكتبات مركب طبيعي

17.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54829

⸱

ديسمبر 27, 2016

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

في هذه المقالة

ملخص

تظهر عدوى الأغشية الحيوية < p class = 'jove_content'> تحملا عاليا للعلاج الكيميائي. لا يوجد اختبار واحد يلتقط تعقيد الأغشية الحيوية. بدلا من ذلك ، هناك حاجة إلى فحوصات تكميلية. نقدم منصة فحص (تم تطويرها من أجل المكورات العنقودية الذهبية) تجمع بين فحوصات الجدوى والكتلة الحيوية ومصفوفة الأغشية الحيوية. يسمح باكتشاف الأدوية المضادة للأغشية الحيوية ، بما في ذلك تقييم تأثيرات العلاج الكيميائي طويلة الأجل.

الملخص

وتعتبر الأغشية الحيوية باعتبارها واحدة من أكثر الموضوعات الصعبة المتمثلة في الطب الحيوي الحديث، وأنها هي المسؤولة عن أكثر من 80٪ من حالات العدوى للمضادات الحيوية متسامحة يحتمل. وقد عرض الأغشية الحيوية والتسامح عالية بشكل استثنائي للعلاج الكيميائي، والتي يعتقد أن تكون سياقاتها. على سبيل المثال، توفر مصفوفة حاجز مادي أن يقلل من تغلغل المضادات الحيوية في بيوفيلم. أيضا، وخلايا داخل الأغشية الحيوية متنوعة ظاهريا. على الأرجح، تنشأ بيوفيلم مرونة من مزيج من هذه وغيرها من الآليات، غير معروف حتى الآن. وقد وضعت كل من المضادات الحيوية الموجودة حاليا ضد خلايا واحدة (العوالق) البكتيريا. لذلك، حتى الآن، ذخيرة محدود جدا من جزيئات موجودة التي يمكن أن تعمل بشكل انتقائي على الأغشية الحيوية ناضجة. وقد أدى هذا الوضع تحولا تدريجيا في اكتشاف المخدرات، الذي تم حث البحث عن معاداة الأغشية الحيوية لتحتل مكانا أكثر بروزا. تحديا إضافيا هو أن هناكعدد من أساليب موحدة للبحوث بيوفيلم، وخاصة تلك التي يمكن أن تستخدم لفحص-إنتاجية كبيرة من المكتبات الكيميائية محدودة للغاية. هنا، يتم تقديم منصة لمكافحة بيوفيلم تجريبية لفحص الكيميائي. تلطيخ ويستخدم ثلاثة فحوصات لقياس قابلية بيوفيلم (مع تلطيخ ريسازورين)، إجمالي الكتلة الحيوية (مع تلطيخ الكريستال البنفسجي)، ومصفوفة بيوفيلم (باستخدام راصة جنين القمح، استنادا WGA مضان للبولي N -acetyl الجلوكوزامين، PNAG ، جزء). وقد وضعت جميع المقايسات باستخدام المكورات العنقودية الذهبية حيث تكون البكتيريا نموذج. وقدم أمثلة لكيفية منصة يمكن استخدامها لغربلة أولية فضلا عن التوصيف الوظيفي ليضرب المضادة للبيوفيلم التي تم تحديدها. يسمح هذا التسلسل التجريبي كذلك إلى تصنيف يضرب استنادا إلى نهاية نقاط قياس. كما يوفر معلومات عن طريقة عملها، وخصوصا على المدى الطويل مقابل آثار العلاج الكيميائي على المدى القصير. وبالتالي، فمن أدفا جداntageous لسرعة تحديد المركبات ضرب عالية الجودة التي يمكن أن تكون نقطة لانطلاق لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية.

المقدمة

يمكن للبكتيريا التبديل بين اثنين من أنماط الحياة المختلفة جدا، العوالق واطئة، منها بيوفيلم هو المثال الأكثر شيوعا. في الأغشية الحيوية، والبكتيريا تشكل المجتمعات تنظيما جزءا لا يتجزأ من الذات المنتجة مصفوفة 1. هذه المصفوفة الذات المنتجة هي الحاجز بين البكتيريا والبيئة الخارجية، وأنه يحمي الخلايا الميكروبية، وحفظ لهم على مقربة. تكوين مصفوفة بيوفيلم يختلف بين وحتى داخل الأنواع، ولكنها تتكون في معظمها من شبكة محكمة من عديدات سكر شحمية، والحمض النووي خارج الخلية، والبروتينات. تخدم مصفوفة بمثابة حاجز مادي يحول دون دخول عوامل ضارة، ولكنه يحمي أيضا بيوفيلم من الجفاف وتمنع المواد المغذية من الهرب الخلية 2.

وتعتبر الأغشية الحيوية باعتبارها واحدة من أكثر الموضوعات الصعبة المتمثلة في الطب الحيوي الحديث، وأنها هي المسؤولة يزعم لأكثر من 80٪ من حالات العدوى للمضادات الحيوية متسامحة 3. أنها يمكن التخلصوضع والتسامح عالية بطبيعتها ضد التهديدات الخارجية: الرطوبة والضغط الاسموزي، إجهاد 4، الحرارة، الأشعة فوق البنفسجية 5 والمطهرات والعوامل المضادة للجراثيم، والمضيف نظام المناعة 1. على سبيل المثال، فقد تبين أن تركيز عامل مضاد للميكروبات المطلوبة اللازمة لقتل بيوفيلم إلى أن تكون أعلى ما يصل إلى 1،000 مرات في مقارنة إلى ما هو مطلوب لقتل البكتيريا العوالق. يبدو أن تفسير لهذا التسامح العالي ليكون سياقاتها. وتقدم المصفوفة حاجز مادي أن يقلل من تغلغل المضادات الحيوية في بيوفيلم. أيضا، وخلايا داخل الأغشية الحيوية متنوعة ظاهريا. انتقالهم بين الدول الأيض المختلفة بسبب الانحدار الحالية من الأكسجين والمغذيات، والأيض بين الأجزاء الداخلية والخارجية للبيوفيلم 6. وبالتالي، في بعض المناطق بيوفيلم، مثل القلب، ويحرمون البكتيريا من الأوكسجين والمواد المغذية والعيش في أقل نشاطا أيضي أو حالة سبات تماما 7. ويشار إلى خلايا نائمة تماما إلى الخلايا كما persister، وأنها ليست عرضة للعلاجات المضادة للميكروبات التقليدية 8. وبالتالي، فمن المرجح أن بيوفيلم مرونة تنشأ من مجموعة من الآليات المقترحة حاليا وغيرها، غير معروف حتى الآن. المكورات النيابة. لا تزال من بين البكتيريا إيجابية الجرام الأكثر إشكالية، مما تسبب شديدة، غالبا ما ترتبط بيوفيلم، الالتهابات 4. ويشار إلى أن ما يصل إلى 99٪ من كل البكتيريا ترتبط داخل الأغشية الحيوية، مما يجعل من نمط الحياة البكتيرية الغالبة 3. ومع ذلك، فقد وضعت كل من المضادات الحيوية الموجودة حاليا ضد وحيدة الخلية (العوالق) البكتيريا. وحتى الآن، ذخيرة محدود جدا من جزيئات موجودة التي يمكن أن تعمل بشكل انتقائي على الأغشية الحيوية ناضجة. وقد أدى هذا الوضع تحولا تدريجيا في اكتشاف المخدرات، الذي تم حث البحث عن معاداة الأغشية الحيوية لتحتل مكانا أكثر بروزا.

من منهجيهمنظور كال، تحديات إضافية موجودة، كما لم توضع إلا لعدد محدود من وسائل بيوفيلم من قبل منظمات وضع المعايير، وخاصة تلك التي تنطبق على فحص عالية الإنتاجية من المكتبات الكيميائية. وتستند جميع المقايسات الموحدة (مع استثناء واحد فقط) على المفاعلات بيوفيلم، وهذه الأساليب تتطلب كميات عاملة كبيرة وكميات كبيرة من المركبات لفحصها، والتي عادة ما تكون غير متوفرة أثناء مرحلة الفحص المبكر 9-12. وموحد فحص الفرز ينطبق إلا الحالية هو ما يسمى جهاز كالجاري بيوفيلم، والتي وضعت المتوفرة تجاريا الحد الأدنى بيوفيلم القضاء على تركيز (MBEC) نظام 13-15. ومع ذلك، فإن الحد من هذا الاختبار هو أن الأغشية الحيوية تزرع على أوتاد، وليس كل الأنواع البكتيرية أو حتى سلالات داخل نفس النوع قادرون على تشكيل الأغشية الحيوية على هذا الجهاز. وعلاوة على ذلك، الأساليب التي يمكن تطبيقها بشكل خاص لاستكشاف المركبات الطبيعيةبحاجة. وكانت منتجات الطبيعية مصدرا رئيسيا للابتكار في اكتشاف الأدوية المضادة للميكروبات خلال القرن الماضي 16. أنها يمكن أن توفر مركبات جديدة لمكافحة بيوفيلم مع آليات فريدة من الإجراءات التي يمكن أيضا أن تكون فعالة ضد خلايا persister. وهكذا، واستكشاف المكتبات الطبيعية ومستوحاة بشكل طبيعي لديها فرص كبيرة لإنتاج الخيوط واعدة وفريدة من نوعها لمكافحة بيوفيلم.

هنا، نقدم تفاصيل التجريبية من منصة المقايسات التي تم تطويرها لفحص المواد الكيميائية من المركبات المضادة للبيوفيلم باستخدام ثلاثة فحوصات لقياس الآثار المترتبة على قدرتها على البقاء، إجمالي الكتلة الحيوية، ومصفوفة الأغشية الحيوية المكورات العنقودية الذهبية. الفحص الأول يقيس قابلية بيوفيلم، ويستند على تلطيخ ريسازورين. ريسازورين هو وصمة عار الأكسدة التي هي الأزرق وغير الفلورسنت في حالته تتأكسد وتتحول إلى اللون الوردي، resorufin الفلورسنت للغاية عندما خفضت من النشاط الأيضي للبكتيريا. وهو م بسيط جدا وسريعethod مناسبة للعروض الأولية 17-20. الفحص الثاني، على أساس الكريستال البنفسجي تلطيخ، ويقيس مجموع كتلة بيوفيلم. الكريستال البنفسجي هو وصمة عار استخداما لدراسة البكتيريا والبكتيريا في الأغشية الحيوية 19،21-23. ويستند هذا الفحص على الكواشف غير مكلفة ولها بسيطة القراءة الامتصاصية نقطة النهاية. وأخيرا، وفحص ثالث يستهدف مادة البوليمر (EPS) -matrix خارج الخلية من بيوفيلم عبر راصة جنين القمح (WGA)، الذي يربط خصيصا لبولي N مخلفات -acetyl الجلوكوزامين (PNAG) الموجودة في مصفوفة من الأغشية الحيوية العنقوديات 24. ويضاف إلى WGA مع fluorophore التي يمكن الكشف عنها باستخدام القراء كثافة مضان 25. نقدم هنا المنطق وتفاصيل منصة وضعنا، بما في ذلك أمثلة من التطبيقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تزايد البكتيريا

  1. قبل ثقافة البكتيريا بين عشية وضحاها في مرق الصويا زيتية (TSB) عند 37 درجة مئوية مع 220 دورة في الدقيقة تهتز (16-18 ساعة).
  2. تمييع ما قبل الثقافة 100-1،000 مرات (اعتمادا على معدل نمو البكتيريا، وهنا، يتم استخدام 1000 مرات للبكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) في TSB الطازجة وتركها تنمو عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة للوصول إلى النمو المتسارع (البصرية كثافة في 595 نانومتر (OD 595) بين 0.2 و 0.6).
    ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب تحسين سلالة معينة.

2. تشكيل بيوفيلم: قبل وبعد التعرض

  1. تمييع نمت باطراد الثقافة 100 مرة (وهذا يساوي تقريبا 10 6 وحدات تشكيل مستعمرة في الملليمتر الواحد (كفو / مل)).
  2. بروتوكول قبل التعرض
    1. للحصول على عينات ضابطة، إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف لكل بئر من معقمة لوحة 96-microwell.
    2. إضافة 4 ميكرولتر من مركب اختبار أو عنصر تحكمالمضادات الحيوية (حل 50X الأسهم) و 196 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف لكل بئر.
    3. احتضان ذلك عند 37 درجة مئوية على شاكر لوحة في 200 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة.
      ملاحظة: هنا نستخدم شاكر مع مدار 2 مم.
  3. بروتوكول بعد التعرض
    1. لجميع العينات، إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف لكل بئر من معقمة لوحة 96-microwell.
    2. احتضان ذلك عند 37 درجة مئوية على شاكر لوحة في 200 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة.
      ملاحظة: هنا نستخدم شاكر مع مدار 2 مم.
    3. إزالة حل العوالق بأكمله بعناية، دون لمس بيوفيلم، وذلك باستخدام ماصة الأقنية.
    4. إضافة 4 ميكرولتر من مركب اختبار أو مضاد حيوي التحكم (50X حل سهم) و 196 ميكرولتر مكتب تقييس الاتصالات لكل بئر.
    5. احتضان ذلك عند 37 درجة مئوية على شاكر لوحة في 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة إضافية.
      ملاحظة: هنا نستخدم شاكر مع مدار 2 مم.

3. ريسازورين تلطيخ Protocoل لتقييم قابلية الأغشية الحيوية

  1. يعد حل الأسهم من 0.1 ملغ / مل ريسازورين (0.4 ملم) في برنامج تلفزيوني العقيمة. الحفاظ على هذا المخزون العقيمة، وحمايتها من التعرض للضوء، وعند 4 درجات مئوية.
  2. تمييع الأسهم ريسازورين 01:50 في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتحقيق تركيز النهائي من 20 ميكرومتر.
  3. نقل الحل العوالق كامل (ترك الأغشية الحيوية في الآبار) بعناية، دون لمس الأغشية الحيوية أو خلق فقاعات الهواء، لوحة منفصلة، ​​نظيفة 96-جيدا باستخدام ماصة الأقنية.
  4. غسل الأغشية الحيوية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة وذلك بإضافة 200 ميكرولتر لكل بئر، وإزالته بعناية باستخدام ماصة الأقنية.
  5. إضافة 200 ميكرولتر من ريسازورين المخفف لكل بئر من لوحة بيوفيلم باستخدام ماصة الأقنية.
  6. احتضان في الظلام، في درجة حرارة الغرفة (RT)، و 200 دورة في الدقيقة، والهز لحوالي 20 دقيقة حتى الضوابط بيوفيلم غير المعالجة هي بالتساوي الوردي.
  7. قياس مضان فيλ مريض بالحب = 560 نانومتر، وλ م = 590 نانومتر مع قارئ لوحة (رأس القراءة).

4. كريستال البنفسج بروتوكول تلطيخ عن الكتلة الحيوية الكمي من الأغشية الحيوية باستخدام نفس اللوحة كما في الخطوة 3

  1. إزالة وصمة عار ريسازورين بعناية من الآبار باستخدام ماصة الأقنية.
  2. إصلاح الأغشية الحيوية مع 200 ميكرولتر من الميثانول لمدة 15 دقيقة.
  3. السماح لوحة الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 190 ميكرولتر من 0.02٪ (المجلد / المجلد، مخففة في منزوع الأيونات الماء) حل الكريستال البنفسجي، بعناية باستخدام ماصة الأقنية. تجنب لمس الجانبين من الآبار مع وصمة عار في حين pipetting لومنع تشكيل فقاعات الهواء من خلال عدم الضغط على ماصة لاستكمال ضربة المغادرة.
  5. احتضان لمدة 5 دقائق على RT.
  6. إزالة وصمة عار بعناية، وذلك باستخدام ماصة الأقنية.
  7. يغسل مرتين مع الماء منزوع الأيونات (200 ميكرولتر في كل مرة).
  8. السماح الآبار تجف لمدة 5 دقائق على RT وحل وصمة عار المتبقيةفي 96٪ من الإيثانول أو حامض الخليك 33٪.
  9. احتضان لمدة 1 ساعة على RT وقراءة الامتصاصية في 595 نانومتر.

5. تقييم تأثير مبيد للجراثيم على البكتيريا العوالق باستخدام لوحة عينة نفسها بالنسبة للالأغشية الحيوية

  1. قياس العكارة في 595 نيوتن متر من لوحة مع الحل العوالق من 3.3.
  2. وصمة عار على البكتيريا العوالق مع ريسازورين بإضافة 10 ميكرولتر من الأسهم ريسازورين لكل بئر. تخلط جيدا من قبل pipetting.
  3. احتضان في الظلام في RT لمدة 5 دقائق تقريبا، حتى علاج الضوابط هي بالتساوي الوردي.
  4. قياس مضان في λ مريض بالحب = 560 نانومتر، وλ م = 590 نانومتر.

6. جرثومة القمح الملزن تلطيخ لمصفوفة الكمي ومضان المجهر التصوير من الأغشية الحيوية

  1. مصفوفة الكمي
    1. إعداد محلول / مل 5 ميكروغرام من التحقيق WGA في برنامج تلفزيوني العقيمة.
    2. استخدام عينة جيش التحرير الشعبي الصيني الموازيالشركة المصرية للاتصالات لهذا تلطيخ. إزالة حل العوالق من الآبار ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة (200 ميكرولتر لكل بئر)، بعناية باستخدام ماصة الأقنية دون لمس الأغشية الحيوية.
    3. إضافة 200 ميكرولتر من حل WGA لكل بئر لتكون ملطخة.
    4. احتضان في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    5. إزالة وصمة عار غير منضم عن طريق غسل الآبار مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    6. السماح لوحة جافة لمدة 15 دقيقة في RT.
    7. حل وصمة عار المربوطة في حامض الخليك 33٪، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر.
    8. اغلاق الآبار مع قبعات الشريط ويصوتن لهم باستخدام sonicator حمام الماء لمدة 30 ثانية في RT و 40 كيلو هرتز.
    9. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة على RT.
    10. كرر الخطوة صوتنة. يمكن أن تبقى الآبار مختومة بين الخطوات صوتنة.
    11. قياس مضان في λ السابق = 495 نانومتر، وλ م = 520 نانومتر مع قارئ لوحة (رأس القراءة).
  2. تصور المصفوفة معالمجهر مضان
    1. استخدام نفس البروتوكول على النحو الوارد أعلاه حتى خطوة 6.1.6.
    2. بعد خطوة التجفيف، وتصور العينات باستخدام المجهر مضان، وذلك باستخدام فلتر FITC (أو مناسبة مرشح الإثارة الأخضر آخر).

7. تلطيخ خلايا قابلة للحياة والميت داخل الأغشية الحيوية للتصوير مع مضان المجهر والكمي لالإشارة لوالخضر إلى الأحمر نسبة (G / R)

  1. التصوير مع المجهر مضان
    1. يعد حل من كل مسبار (خلايا قابلة للحياة تلطيخ واحد وغيرها من الخلايا الميتة تلطيخ واحد)، وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
    2. إزالة حل العوالق من الآبار ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة (200 ميكرولتر لكل بئر) باستخدام ماصة الأقنية.
    3. إضافة 6 ميكرولتر من الحل تلطيخ لكل بئر.
    4. احتضان لوحة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
    5. قبل المجهر، وإزالة فائض السائل مanually باستخدام ماصة الأقنية.
    6. التقاط الصور باستخدام المجهر مضان، وذلك باستخدام مثلا مرشح FITC (لمخضر، خلايا قابلة للحياة) أو مرشح TRITC (مضان أحمر والخلايا الميتة).
  2. الكمي للإشارة كنسبة الأخضر إلى الأحمر ومضان (G / R)
    1. اتبع نفس البروتوكول كما هو الحال في الخطوات 7.1.1 و7.1.2.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من الحل تلطيخ لكل بئر واحتضان لهم لمدة 15 دقيقة في الظلام.
    3. قياس مضان مع قارئ لوحة في إثارة موجات / الانبعاثات 485/535 نانومتر و 485/635 لمضان الأخضر والأحمر على التوالي (القراءة العليا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في المنبر المقترح، وكمية من آثار على الجدوى، والكتلة الحيوية، ومصفوفة بيوفيلم. في تسلسل العمل (الشكل 1)، اتسخت واحدة لوحة عينة مع ريسازورين وفي وقت لاحق مع البنفسجي وضوح الشمس في وقت واحد لتقييم الآثار المترتبة على بقاء التجمعات البكتيرية وعلى إجمالي الكتلة الحيوية بيوفيلم. كلا المقايسات لا يمكن أن يؤديها على التوالي في نفس اللوحة لأنه ثبت في وقت سابق ان تلطيخ الأول مع ريسازورين لم يكن له تأثير ذو دلالة إحصائية على نتيجة الكريستال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ليس هناك طريقة واحدة يمكن أن تقيس وقت واحد تأثير مركب على الجدوى، والكتلة الحيوية، ومصفوفة بيوفيلم. لذلك، هناك حاجة للجمع بين فحوصات من أجل الكشف عن تأثير على النهاية ثلاثة، ويفضل أن يكون في مرحلة الفرز الأولية.

ريسازورين هو بروتوكول تلطيخ بسيط جدا تتألف فقط من إضافة التحقيق الأكسدة. ومع ذلك، ووضع فترة حضانة الأمثل للالأغشية الحيوية مع ريسازورين أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا الاختبار. في بعض السلالات البكتيرية، والح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

الكتاب أشكر الأستاذ بول كوس وLMPH، جامعة أنتويرب، بلجيكا لدعمه أثناء عملية التصوير في مختبره. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل أكاديمية مشاريع فنلندا (مشاريع 272266 و282981) وسفنسكا TEKNISKA Vetenskapsakademien ط فنلندا. واعترف المساهمات الفنية للماجستير Janni Kujala.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ResazurinSigma AldrichR7017
كريستال بنفسجيسيجما ألدريتشHT90132 
جرثومة القمح Agglutinin ، Alexa Fluor 488 ConsurgateThermo Fisher ScientificW11261
LIVE / DEAD BacLight< / em> المجسات الجزيئيةL7012SYTO 9 لتلوين الخلايا القابلة للحياة الأخضر ويوديد البروبيديوم لتلوين الخلايا الميتة
الفوسفات الأحمر المحلول الملحي
المخزن التربتون أجار الصوياLab M ، NeogenLAB011
مرق الصويا التريبتينLab M ، NeogenLAB004
F96 لوحة البئر البوليسترين المعقمة واضحة القاع المسطحالحراري فيشر العلمية161093
أغطية العلامة التجارية ، شرائط من 8Sigma AldrichBR781413-300EA
برانسون CPX سلسلة حمام بالموجات فوق الصوتيةSigma AldrichZ769428-1EA
MultipipetteThermo Fisher Scientific
Multidrop موزعThermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Coulter
قارئ Varioskan Flash MultiplateThermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC هاتف 25923

المراجع

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
  3. Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
  4. Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
  5. Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
  6. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
  7. Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
  8. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
  9. Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
  10. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
  11. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
  12. Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
  13. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  14. Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
  15. Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663(2016).
  16. Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
  17. Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
  18. Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
  19. Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
  20. Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
  21. Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
  22. Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
  23. Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
  24. Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
  25. Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
  26. Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
  27. Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
  28. Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
  29. Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
  30. Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
  31. Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
  32. Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
  33. Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
  34. Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
  35. Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
  36. Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
  37. Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

حيوية الغشاء الحيويصبغ الكريستال البنفسجيصبغ الريسازورينفلورة WGAالمكورات العنقودية الذهبيةفحص المركبات الطبيعيةتحليل مصفوفة الغشاء الحيويفحص المكتبة الكيميائيةالمجهر الفلوري
ومنصة للفحوصات مكافحة بيوفيلم مناسبة لاستكشاف المكتبات مركب طبيعي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.