مقالة منهجية

إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي، اختبار مزدوج قراءات من بين الخلايا مضادات الميكروبات آخر وحقيقية النواة السمية لخلايا

DOI:

10.3791/54841

⸱

نوفمبر 16, 2016

 ,  , 
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تم تطوير اختبار عالي الإنتاجية في الوقت الفعلي لتحديد (1) مضادات الميكروبات المخترقة للخلايا حقيقية النواة والتي تستهدف مسببات الأمراض البكتيرية داخل الخلايا ، و (2) تقييم السمية الخلوية للخلايا حقيقية النواة. تم بعد ذلك دمج تباين في نفس التكنولوجيا مع تقنية الاستغناء الرقمي لتمكين دراسات تآزر سهلة وعالية الدقة واستجابة للجرعة وثنائية وثلاثية الأبعاد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد المعايير التقليدية للنشاط مضادات الميكروبات داخل الخلايا والسمية لخلايا حقيقية النواة على المقايسات نقطة النهاية. وتتطلب هذه المقايسات نقطة النهاية العديد من الخطوات التجريبية الإضافية قبل قراءات، مثل تحلل الخلية، مستعمرة تشكيل وحدة المصير، أو إضافة كاشف. عند تنفيذ الآلاف من المقايسات، على سبيل المثال، أثناء فحص عالية الإنتاجية، وجهد المصب المطلوبة لهذه الأنواع من المقايسات لا بأس بها. لذلك، لتسهيل عالية الإنتاجية اكتشاف مضادات الميكروبات، قمنا بتطوير فحص في الوقت الحقيقي لتحديد وقت واحد مثبطات نمو البكتيريا داخل الخلايا وتقييم السمية لخلايا حقيقية النواة. على وجه التحديد، وتمكين الوقت الحقيقي للكشف عن نمو البكتيريا داخل الخلايا عن طريق وضع علامة السلالات البكتيرية فحص إما مع الاوبرون البكتيرية لوكس (1 شارع الجيل فحص) أو صحفيين ببروتين (2 الثانية جيل، فحص متعامد). وغير سامة، وخلية غشاء impermeant، النووي صبغ ملزم حمضوأضاف خلال العدوى الأولية الضامة. وتستبعد هذه الأصباغ من خلايا قابلة للحياة. ومع ذلك، تفقد الخلايا المضيفة غير قابلة للحياة سلامة الغشاء تسمح بدخول ووضع العلامات الفلورية من الحامض النووي (حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين). والجدير بالذكر أن الحمض النووي ملزمة يرتبط مع زيادة كبيرة في العائد الكم الفلورسنت التي توفر قراءات الحل القائم على وفاة الخلية المضيفة. وقد استخدمنا هذا الاختبار المشترك لأداء شاشة عالية الإنتاجية في شكل صفيحة، وتقييم نمو الخلايا والسمية الخلوية بواسطة المجهر. والجدير بالذكر، أن مضادات الميكروبات تظهر التآزر التي التأثير المشترك لاثنين أو أكثر من مضادات الجراثيم عند تطبيقها معا أكبر مما كانت عليه عندما تطبق بشكل منفصل. اختبار لفي المختبر التآزر ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا عادة مهمة هائلة كما يجب تقييم التباديل اندماجي من المضادات الحيوية بتركيزات مختلفة. ومع ذلك، وجدنا أن لدينا فحص في الوقت الحقيقي جنبا إلى جنب مع الآلي، والاستغناء عن التكنولوجيا الرقمية صermitted اختبار التآزر سطحي. باستخدام هذه الأساليب، كنا قادرين على مسح منهجي عمل لعدد كبير من مضادات الجراثيم وحده، والجمع ضد مسببات المرض داخل الخلايا، البكتيريا المستروحة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مسببات الأمراض التي تنمو أو يقيمون مؤقتا في حجرات داخل الخلايا صعبة للقضاء على علاجيا. إلزام أو إلزام نسبيا مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل البكتيريا المستروحة، الكوكسيلا البورنيتية، البروسيلا النيابة. ، الفرنسيسيلة التولارية، والمتفطرة النيابة. غالبا ما تتطلب دورات من العلاج المضادة للميكروبات لفترات طويلة للعلاج والتي قد تتراوح من أشهر إلى سنوات حتى. وعلاوة على ذلك، يمكن لمسببات الأمراض خارج الخلية تحتل عابر منافذ داخل الخلايا، وبهذه الطريقة الهروب إجازته الدورات العادية العلاج المضادة للميكروبات وتظهر في وقت لاحق لبدء جولات جديدة من العدوى الخبيثة. المكورات العنقودية الذهبية (1) وuropathogenic المعوية 2،3 الالتهابات مثالين المعترف بها على نحو متزايد. ولذلك، فإن الهدف الأساسي اكتشاف المخدرات هو تحديد مضادات الميكروبات الرواية التي تخترق المقصورات داخل الخلايا. العلاج الأمثل للقضاء بسرعةالكائنات الحية داخل الخلايا ومنع تطور المقاومة من خلال التعرض للميكروبات دون كابح أمر مرغوب فيه خاصة.

تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير تقنية فحص الإنتاجية العالية لتحديد مضادات الميكروبات، داخل الخلايا توغل تستهدف نمو الخلايا من مسببات المرض نموذج، البكتيريا المستروحة. وتشير 4 الملاحظات السريرية السابقة أن معيار اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات لم تتنبأ بدقة في الجسم الحي الكفاءة العلاجية ضد هذا الكائن الحي. 5 على وجه التحديد، وكان هذا بسبب فئات رئيسية من مضادات الميكروبات مثل β-اكتام وأمينوجليكوزيدات، على الرغم من فعالية عالية ضد نمت axenically البكتيريا، لا تخترق بدرجة كافية في حجرات داخل الخلايا حيث تتواجد البكتيريا. اقترح 5،6 الأدلة في وقت لاحق أن المقايسات نمو الخلايا فنيا أكثر تعقيدا توقعت فعال الفعالية السريرية. 7 لسوء الحظ، كانت هذه المقايسات النهاية شاقة للغاية المقايسات، والتي تتطلب الضامة المصابة، وتعامل مع مضادات الميكروبات، أن هي lysed في أوقات مختلفة من النقاط لتشكيل مستعمرة حدة التعداد. هذه المقايسات ليست عملية للقيام على نطاق واسع وغير مناسبة لاكتشاف الأدوية الإنتاجية العالية.

لذلك، قمنا بتطوير تكنولوجيا لتحديد الوقت الحقيقي لنمو البكتيريا داخل الخلايا. 6 وقد تحقق ذلك من خلال استخدام السلالة البكتيرية المعدلة من خلال دمج إما بكتيري وسيفيراز الاوبرون 8 (أول فحص جيل، وصفت سابقا) 4 أو الفلورسنت البروتين 9 صحفيين (الجيل الثاني، فحص متعامد، وصفت هنا) في كروموسوم البكتيريا. وبهذه الطريقة، الانارة أو إشارة الفلورسنت توفر بديل، في الوقت الحقيقي قراءات من عدد البكتيريا.

ومع ذلك، هذه الصفات لا تعالج المحير رئيسيا في infectio داخل الخلاياالمقايسات ن، والآثار بعيدا عن الهدف في الخلايا المضيفة. على وجه الخصوص، وفاة الخلية المضيفة يحد بطبيعتها نمو الخلايا وتؤدي إلى تحديد هوية كاذبة من تأثير مضاد للميكروبات. كما العديد من المركبات في المكتبات الفحص هي أن الخلايا حقيقية النواة السامة، هذه ايجابيات كاذبة تطغى مضادات الجراثيم الحقيقية، مما يستلزم عددا كبيرا من المتابعة، المقايسات نقطة النهاية السمية الخلوية للقرار.

وبالتالي، كان من اهتمام كبير لتكون قادرة على تقييم بقاء الخلية حقيقية النواة ونمو الخلايا في وقت واحد. والجدير بالذكر، سمة من سمات الخلايا حقيقية النواة غير قابلة للحياة هي فقدان النزاهة غشاء الخلية. ولذا قد تحقيقات أن اختبار نفاذية غشاء الخلية أن تستخدم لتقييم قابلية الخلية. وتتميز نحن سابقا قدرة سلسلة من خلية مزعومة غشاء impermeant، فلوري، والأصباغ الحمض النووي ملزم للوصول إلى وصمة عار الحامض النووي من الخلايا الميتة. (4) في الحمض النووي ملزم النووي، هذه الأصباغ عرض زيادة كبيرة في quantuم العائد الفلورسنت مما أدى إلى زيادة إشارة على حل الخلفية مضان. على هذا النحو، وفرت هذه الأصباغ قراءات كمية من موت الخلايا حقيقية النواة. 4 والجدير بالذكر أن وجدنا أن عددا منهم كان غير سامة أنفسهم خلال فترة طويلة شارك في الحضانة مع الضامة J774. عندما تضاف أثناء الإصابة الأولية، قدموا في الوقت الحقيقي، قراءات الفلورسنت من موت الخلايا حقيقية النواة التي يمكن أن يقاس على مقياس التألق صفيحة أو احظ مجهريا.

لذلك، من خلال الجمع بين استخدام مراسل البكتيرية وغير سامة، غشاء impermeant، والأصباغ الحمض النووي ملزم، كنا قادرين على تطوير بسيط، غير مدمرة، في الوقت الحقيقي فحص لقياس كل الحمولة الجرثومية وحقيقية النواة السمية لخلايا في وقت واحد. وقد سمح هذا الاختبار لنا على الشاشة في 384 بئر شكل لوحة ~ 10،000 bioactives المعروفة بما في ذلك ~ 250 مضادات الميكروبات و> 240،000 جزيئات صغيرة مع النشاط uncharacterized وظيفيا عن القدرة على كبح نمو الخلايا منالبكتيريا المستروحة، بينما في الوقت نفسه توليد بيانات الخلية سمية الخلايا حقيقية النواة لكل مجمع. وكان 6 تحليلنا لمضادات الميكروبات المعروفة ضد نمو الخلايا من البكتيريا استكشاف أشمل من هذا النوع حتى الآن. 6

وبناء على كفاءة التنسيق فحص لدينا، ونحن أيضا استكشاف في وقت لاحق من الآثار المحتملة المستمرة للمضادات الحيوية المعروفة عند استخدامها في الجمع. واحد من الاختبارات التآزر الأكثر شيوعا، ما يسمى فحص اللوحة، يتم تنفيذ standardly من خلال تقييم الآثار اندماجي من التخفيفات المسلسل شقين اثنين أو أكثر من مضادات الميكروبات. 10 وفي هذه المقايسات، ويعرف التآزر من خلال رصد تأثير أكبر عندما يتم تطبيق اثنين أو أكثر من مضادات الميكروبات معا من مجموع آثار كل تطبيق على حدة. وتجدر الإشارة، حتى الآن، ركز فقط وأجري اختبار التآزر انتقائية ضد الخلايا المستروحة البكتيريا بسبب المجهود الكبير تشارك في المقايسات نقطة النهاية التقليدية مضروبا في التباديل اندماجي المطلوبة.

لتسهيل اختبار التآزر، التي قطعناها على أنفسنا استخدام ما لدينا في الوقت الحقيقي نمو الخلايا / حقيقيات النوى فحص السمية الخلوية في تركيبة مع الآلية التكنولوجيا الاستغناء الرقمية (6). هذا أتمتة يسمح لنا الاستغناء التخفيفات المسلسل من المركبات الذائبة في DMSO أو محلول مائي منفردة أو مجتمعة في شكل 384 أيضا. 11 وعلاوة على ذلك، فإن مثل هذه قوية تكنولوجيا معالجة السائل يسمح لنا لأداء بسهولة دقة أعلى، مربع الجذر لطفلين (بدلا من المعيار، دقة أقل، ومضاعفة) مجموعات تخفيف لتحقيق مستويات أعلى من الدقة في منطقتنا ثنائي الأبعاد، الشطرنج التآزر تحليل. وكان هذا القرار قيمة خاصة في معالجة الشواغل في مجال التآزر حول استنساخ عند استخدام شقين التخفيف سلسلة 12. وأخيرا، كان لدينا فحص الكمي وأيضا ذرefore قياس التدرج من كبت. ونتيجة لذلك، استولت على فحص مجمل المعلومات المثبطة، التعبير عنه في isobolograms isocontour التي isocontours ربط تركيزات اندماجي مع مستويات مماثلة من تثبيط النمو. 6 سمحت هذه الاستراتيجية التآمر تصور اندماجي منحنيات الاستجابة للجرعة. لتوضيح منهجية لدينا، ونحن تصف بروتوكول لدينا لأداء هذه المقايسات وتظهر نتائج ممثلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. في الوقت الحقيقي بين الخلايا النمو وخلية حقيقية النواة السمسة الفحص

  1. إعداد خلايا المضيف (خلايا J774A.1)
    1. ثقافة J774A.1 المصحف العضلة الخلايا الشبيهة بلعم معلق في RPMI 1640 بنسبة 9٪ تستكمل الحديد العجل المصل. في البداية مرور في قوارير زراعة الأنسجة. بعد الخلايا أصبحت متكدسة في 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة في 15 مل من المتوسط، وتقسيم عن طريق كشط والتخفيف إلى 65 مل مع نفس النوع من المتوسط، منها 15 مل يتم إرجاعها إلى قارورة زراعة الأنسجة و50 مل يتم نقل إلى 250 مل البكتيرية قارورة شاكر.
    2. لزيادتها والثقافة معلق في 250 مل و / أو 1000 قوارير البكتيرية مل شغل إلى المجلد الخامس واحد مع متوسط ​​زراعة الأنسجة. تهوية عن طريق تحديد سرعة دوران في حوالي 120 لفة في الدقيقة. لنمو مستمر، في احتضان بالضبط 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
    3. خلايا الحصاد عندما تصل الكثافة في حدود 2.5 × 10 6 خلايا/ مل إلى 5 × 10 6 خلية / مل. ضمان نسبة الخلايا الميتة (يعاير بسهولة عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق) لا تتجاوز 25٪، والخلايا الميتة سيزيد من الضوضاء في الخلفية في فحوصات السمية الخلوية.
    4. لوحة بيضاء، زراعة الأنسجة المعالجة، 384 جيدا microplates في 5 × 10 4 خلايا J774A.1 في 30 ميكرولتر المتوسطة زراعة الأنسجة لكل بئر. احتضان بين عشية وضحاها microplates لتحقيق 90٪ التقاء في يوم من التجربة.
  2. إعداد الفلورسنت أو نيون البكتيريا المستروحة
    1. مرور L. المستروحة (LP02 :: :: flaA لوكس 8) البكتيريا على المتوسط المناسب، أي مخزنة الفحم خلاصة الخميرة (BCYE) متوسطة. في حالة استخدام سلالة العوز الغذائي الثيميدين، تكملة المتوسطة مع 100 ميكروغرام / مل الثيميدين. إعداد بقع من البكتيريا للتجارب عن طريق نشر الكائنات غزيرا على طبق من ذهب BCYE جديدة واحتضان يوم واحد (إذا كان من ممر لوحة السابق) أو 2-3 أيام (إذا كان من الأوراق المالية المجمدة) للحصول على متكدسةنمو.
      1. إعداد لوحات BCYE عن طريق إذابة 10 جم خلاصة الخميرة، و 10 غرام N - (2-acetamido) حمض -2-aminoethanesulfonic، 0.35 ز ك 2 هبو 4، و 1 غرام أحادي القاعدة البوتاسيوم α كيتوغلوتارات في 950 مل من الماء منزوع الأيونات. ضبط درجة الحموضة إلى 6.9 مع هيدروكسيد البوتاسيوم (≥2.5 مل من 11.9 حل الرحى).
      2. إضافة 15 غراما أجار و 2 ز الفحم المنشط. وجلب إلى 1 L الحجم النهائي. إضافة شريط مغناطيسي وجهاز التعقيم. متوسطة بارد إلى 55 درجة مئوية وإضافة حلول فلتر تعقيم تحتوي على 0.4 غرام L-السيستين و 0.42 غرام الأمونيوم الحديد (III) سترات المذاب في الماء منزوع الأيونات. استخدام مغناطيس لوحة ضجة لمزيج قبل صب لوحات بيتري.
      3. لاختبار نمو المستروحة L. في متوسط النمو ممحوضة، وإعداد ACES وخلاصة الخميرة مرق (آي) عن طريق الجمع بين كل الكواشف الكيميائية المستخدمة لBCYE باستثناء الفحم وأجار. فلتر تعقيم واستخدام على الفور، أو تجميد للتجارب لاحقة.
    2. الكائنات resuspend في سالي الأنسجة مستنبت المستخدمة لخلايا J774A.1 مع 100 ميكروغرام / مل مكملات الثيميدين حسب الاقتضاء.
  3. العدوى بلعم
    1. إضافة مركبات اختبار الفائدة (مركبات الفحص، والضوابط الإيجابية والسلبية لتثبيط نمو البكتيريا وتحلل الخلايا حقيقية النواة). يفضل حل حلول السهم عند ≥500x في DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل) أو محلول مائي للسماح للتخفيف كاف من السيارة.
      1. على الرغم من أن الحلول الأسهم يمكن تخزينها المجمدة، وتجنب تجميد أذاب دورات للمركبات عطوب ومضادات الميكروبات.
    2. تمييع البكتيريا الانارة لاستهداف من 2.5 × 10 6 كفو (مستعمرة تشكيل وحدة) / م والبكتيريا المسمى مراسل الفلورسنت إلى 1.0 × 10 7 خلية / مل في مستنبت النسيج وإضافة غير سامة، غشاء impermeant، الحمضية نوكليك مناسبا صبغة ملزمة في 2.5x و تركيز الفحص النهائي.
    3. إضافة 20 ميكرولتر من الخليط إلى كل ثقافة J774A.1 جيدا، وحجم الفحص النهائي50 ميكرولتر، تركيز البكتيريا النهائي 1 × 10 6 خلية / مل (لوكس الاوبرون مراسل) أو 4 × 10 10 6 خلية / مل (الفلورسنت مراسل البروتين).
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام في 5٪ CO 2 في 100٪ الرطوبة النسبية لمنع الآثار حافة التبخر.
  4. فحص قراءات
    1. قراءة نمو البكتيريا وسمية الخلايا حقيقية النواة على luminometer صفيحة ومقياس التألق بما يتناسب مع صحفيين المستخدمة.
      1. لتجنب الآثار الحافة المرتبطة درجة الحرارة، وتتوازن حراريا microplates قبل القراءة التلألؤ من وضع في طبقة واحدة على مقاعد البدلاء المختبر مع الأغطية مواربا لحوالي 20 دقيقة (أو في خزانة السلامة البيولوجية مع الأغطية قبالة لحوالي 10 دقيقة).
    2. العودة microplates إلى الحاضنة إذا هو المطلوب في الوقت الحقيقي قراءات في نقطة زمنية لاحقة.

تحليل 2. البيانات

  1. تطبيع البيانات ليخدع الإيجابية والسلبيةمفاتيح التحكم لحساب المئة أو أضعاف لتثبيط نمو البكتيريا داخل الخلايا وفي المئة السمية الخلوية للخلايا حقيقية النواة.
  2. لتقييم فحص متانة، وحساب الفصل إحصائية بين الضوابط الإيجابية والسلبية على حد سواء تثبيط نمو البكتيريا والسمية الخلوية باستخدام Z-عامل (Z ') تحليل حيث Z' = 1-3 (σ ص + σ ن) / | ميكرون ص + ميكرون ن |. في هذه المعادلة، σ p و σ ن هي الانحرافات المعيارية للآبار المراقبة الإيجابية والسلبية، على التوالي؛ μ p و ميكرون ن هي القيم المتوسطة لآبار الإيجابية والسلبية السيطرة على التوالي.
    1. لفحوصات الكشف الإنتاجية العالية، وحساب القياسية ض عشرات (أو بديل آخر، المقاييس الإحصائية الكمية) لتقييم آثار المركبات اختبار الفائدة. بدلا من ذلك، وحساب بسيطة للحد أضعاف أو تسجيل أضعاف الحد كما يحتمل أن تكون من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية قياس تأثير حجم للبكتيريا تكرار هندسيا.

3. واحد ومتعدد الأبعاد (أي، التآزر) الجرعة والاستجابة اختبار وبيانات التفسير

  1. إعداد الضامة والبكتيريا كما هو موضح في قسم البروتوكول 1.
  2. فقط قبل الإصابة أو حضانة ممحوضة، إضافة مضادات الميكروبات من الفائدة التجريبية في المسلسل، ومضاعفة سلسلة التخفيف، وذلك بهدف الممتدة في نهاية عالية التركيز من شأنها أن تزيل تماما النمو (أي التركيز المثبط الأدنى أو MIC) وعلى انخفاض إنهاء الاعتقال التي لم تظهر اي نشاط واضح.
  3. استخدام نظام مناولة السائل الآلية لتسهيل واحدة بين الجرعة والاستجابة واندماجي إعداد اختبار التآزر من خلال المباشرة، بالإضافة الآلي من التخفيفات المضادة للميكروبات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. النظر في استخدام التخفيفات-مضاعفة الفرعية، على سبيل المثال،841 / 54841eq1.jpg "/> - أضعاف سلسلة التخفيف، وفحص يعيد إلى زيادة دقة واستنساخ البيانات.
  5. للعدوى بلعم، وتمييع البكتيريا الانارة لاستهداف من 2.5 × 10 6 كفو (مستعمرة تشكيل وحدة) / مل في مستنبت الأنسجة. إضافة 20 ميكرولتر من الخليط إلى كل ثقافة J774A.1 جيدا، وحجم الفحص النهائي 50 ميكرولتر، تركيز البكتيريا النهائي 1 × 10 6 خلية / مل. واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في الرطوبة النسبية 100٪.
    1. لاختبار نمو ممحوضة، وتمييع البكتيريا الانارة لتركيز النهائي من 1 × 10 6 خلية / مل في آي المتوسطة، إضافة 50 ميكرولتر من كل بئر من 384 لوحة جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في الرطوبة النسبية 100٪.
  6. حساب مؤشر تركيز مثبط كسور لمجموعات مضادة للميكروبات التي تمنع نمو البكتيريا. لكل دواء في الجمع بين (أ، ب،.. ن) أن يؤدي إلى تثبيط كامل أو> 99٪ من البكتيريا زrowth، وحساب تركيز مثبط كسور الفردية (FIC أ، ب، ن...) على النحو التالي: اللجنة المالية و= تركيز مركب "أ" مقسوما على تركيز مثبط الحد الأدنى من "أ" في حد ذاته. . باستخدام نفس الصيغة، وحساب اللجنة المالية ب، وما إلى ذلك ثم حساب مؤشر FIC اندماجي أو figure-protocol-1 اللجنة المالية = اللجنة المالية واللجنة المالية + ب +. . .FIC ن لكل تركيبة المثبطة.
    1. استخدام مؤشر اندماجي أن ينحرف أبعد من 1.0 إلى تقييم التآزر. النظر في قطع من ≤0.5 كمؤشر المحافظ من تأثير متناغم و≥4، لها تأثير مضاد. 12
    2. isobolograms المؤامرة، isobolograms isocontour، و / أو isosurface isobolograms 6 رسوما بيانية كما بديلة من آثار اندماجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صفيحة فحص نمو الخلايا

البيانية الشكل 1 الخطوات الفحص. الخطوات الآلي يظهر لا يمكن أن يؤديها يدويا. ومع ذلك، ومما يسهل الإنتاجية إلى حد كبير باستخدام أنظمة مناولة السائل.

ويبين الشكل 2 النتائج تمثيلية من 384 بئر صفيح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا فحوصات في الوقت الحقيقي للكشف في وقت واحد من نمو البكتيريا داخل الخلايا والسمية لخلايا المضيف. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. أولا، لأداء فحص قوي، يجب أن يكون هناك ما يكفي من الفصل الطيفي بين قراءات البكتيرية والسمية الخلوية. هذا الفصل هو جوهري لمجموعات من الصحفيين الاوبرون وسيفيراز والأصباغ الحمض النووي ملزم الفلورسنت. ومع ذلك، استنادا إلى تجربتنا (الجدول 1-3، الشكل 2)، واستخدام مزدوج، قراءات الفلورسنت يتطلب إشارات فلوري متدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد دراسة نشرت في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم جائزة R01AI099122 إلى JEK المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية لل الصحة. ونود أن نشكر جنيفر سميث، ديفيد روبل، سو تشيانغ، دوغ الفيضانات، شون جونستون، جنيفر Nale، ستيوارت Rudnicki، بول يان، ريتشارد سيو، وراشيل واردن من مرفق فحص ICCB-لونجوود و / أو مختبر الفحص الوطني ل للمراكز الإقليمية لنيو إنجلاند للتميز في الدفاع البيولوجي والأمراض المعدية (بدعم من U54AI057159) للمساعدة في التنمية وأداء المقايسات فحص عالية الإنتاجية الناشئة. كما نود أن نشكر كينيث سميث لتعليقات مفيدة على المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
J774A.1 الخلاياالأمريكية نوع الثقافة مجموعةTIB-67الخلية المضيفة
ACESسيجما ألدريتشA9758   ؛لصنع مستخلص الخميرة الفحم المخزنة وأجار ووسط مستخلص الخميرة المخزنة
مستخلص الخميرة ،210929Becton-Dickinson / Difcoالترشيح لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ووسط مستخلص الخميرة المخزنة ؛ قد تتسبب الدرجات المنخفضة في ضعف النمو و / أو تغيير حساسية الفيلقية لمثبطات النمو
حمض ألفا كيتوجلوتاريك ، ملح أحادي البوتاسيومسيجما ألدريتشK2000لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ومستخلص الخميرة المخزنة متوسط
بيروفات الصوديومSigma-AldrichP5280لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ومستخلص الخميرة المخزنة متوسط
فوسفات البوتاسيوم ، ثنائي القاعدةThermo Fisher ScientificP288-500لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ومستخلص الخميرة المخزنة متوسط
L-cysteineSigma-AldrichC-7755لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ووسط
مستخلص الخميرة المخزنةحديد الأمونيوم (III) ستراتSigma-AldrichF5879لصنع أجار مستخلص خميرة الفحم المخزن ووسط مستخلص الخميرة المخزنة ؛ يمكن استخدام بيروفوسفات الحديديك بدلا من ذلك ولكن من الصعب وزنها بدقة
محلول هيدروكسيد البوتاسيوم ، مركزThermo Fisher ScientificSP236-500لصنع أجار مستخلص خميرة الفحم المخزن ومستخلص الخميرة المخزنة وسط
ماء منزوع الأزهارN / AN / Aلصنع مستخلص الخميرة الفحم المخزنة وأجار ووسط مستخلص الخميرة المخزنة
الثايميدين (درجة زراعة الأنسجة)Sigma-AldrichT1895لتكملة كل من RPMI 1640 ومستخلص الخميرة المخزنة أجار / متوسط & [مدش] ؛ يمكن استخدام الثايميدين منخفض الدرجة لهذا الأخير ، ولكنه قد يتسبب في ضعف نمو الخلايا و / أو موت الخلايا في RPMI 1640
RPMI 1640 ، الصيغة القياسيةCorning via Thermo Fisher Scientific10-040-CVلزراعة خلايا J774A.1 قبل الطلاء ؛ يتضمن 2 ملي مولار L-glutamine
RPMI 1640 يفتقر إلى الفينول الأحمرCorning عبر Thermo Fisher Scientific17-105-CVللطلاء بخلايا J774A.1 في 384 صحنا جيدا (غير مناسب للنمو قبل الطلاء) ؛ يفتقر أيضا إلى L-glutamine & [مدش] ؛ مكمل ل 2 ملي مولار قبل استخدام
L-glutamine ، 200 ملي مولار في 0.85٪ كلوريد الصوديوم (درجة زراعة الأنسجة)HyClone عبر Thermo Fisher ScientificSH30034.02لمكملة RPMI 1640 التي تفتقر إلى L-glutamine ، إلى 2 ملي مولار التركيز
النهائي مصل العجل المكمل بالحديدالجوزاء المنتجات الحيوية100-510لمكملة RPMI 1640 ، إلى 9.1٪ تركيز نهائي
محلول التربان الأزرقSigma-AldrichT8154للتلوين لتحديد موت الخلايا J774A.1 أثناء حساب كثافة الخلية
SYTOX Green ، محلول 5 ملي مولار في DMSOThermo Fisher ScientificS7020لتلوين J774A.1 تحديد موت الخلايا عن طريق قراءة التألق أو الفحص المجهري epifluorescence (بالاقتران مع بكتيريا الفلورسنت البرتقالية والحمراء أو الحمراء البعيدة). استخدم بتركيز نهائي 125 نانومتر.
حاضنة زراعة الخلاياThermo Fisher Scientific13-255-26لحضانة خلايا J774A.1 (قبل وبعد الإصابة) ؛ يمكن استخدامها أيضا لحضانة البكتيريا ، أو يمكن استخدام حاضنة الغلاف الجوي القياسية بدلا من ذلك)
شاكر مداريBellCo Glass7744-01010لهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة ؛ يناسب داخل حاضنة زراعة الخلايا ؛ يتضمن قاعدة شاكر 7744-01000 وصينية 7740-01010 (هذه متوفرة أيضا بشكل منفصل)
قوارير شاكر (250 مل)ChemGlass Life SciencesCLS-2038-04لحضانة الخلايا J774A.1 قبل الإصابة
بشاكر المشابك للقوارير (250 مل)BellCo7744-16250لهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة
قوارير شاكر (1,000 مل)ChemGlass Life SciencesCLS-2038-07لاهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة
بشاكر المشابك للقوارير (1,000 مل)BellCo Glass7744-16100لهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة
أغطية إسفنجية رغوية للقوارير (250 مل -1,000 مل)ChemGlass Life SciencesCLS-1490-038لهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة ؛ يقلل من خطر التلوث بالنسبة للأغطية المعدنية القياسية
MultiDrop Combi مضخة تمعجية متعددة القنوات قابلة للبرمجةThermo Fisher Scientific5840300للاستغناء عن خلايا J774A.1 ، معلق متوسط وبكتيري يحتوي على فلوروفورات إلى أعداد كبيرة من 384 أطباق بئر
مشعب التجويف القياسي CombiThermo Fisher Scientific24072670حجم الاستغناء الافتراضي 20 &# 956 ؛ ل غير كاف للتعويض عن الاستقرار و [مدش] ؛ زيادة إلى 80 &# 956; ل
أطباق بيضاء 384 جيدة معالجة لزراعة الأنسجةCorning3570لقراءة اللمعان والفلورة ؛ كتالوج Greiner # 781080 تم اختباره أيضا بنجاح
DMSO (درجة زراعة الأنسجة ، في أمبولات مختومة)Sigma-AldrichD2650لإذابة مركبات التحكم والاختبار الإيجابية
AzithromycinSigma-AldrichPHR1088التحكم الإيجابي بالمضادات الحيوية
Saponin (من لحاء Quillaja)Sigma-AldrichS-4521التحكم الإيجابي في السمية
الماصةمتعددة القنواتThermo Fisher ScientificFinnpipetteلنقل كميات ثابتة من مركبات التحكم الإيجابية ؛ يجب أن تحتوي الماصة على توزيع رقمي مع حواجز لتمكين الاستغناء المتكرر عن حجم
ثابت روبوت نقل دبوس إبسونEpson / ICCB-L(معدات مخصصة)لنقل كميات ثابتة من مركبات الاختبار من مصفوفات المكتبة نظام
الاستغناء الرقميHewlett-Packard عبر TecanD300لنقل كميات متغيرة من مركبات الاختبار تتراوح من 11 بيكوليتر إلى 10 ميكرو ؛ ل
خراطيش T8 + لنظام الاستغناء الرقمي D300Hewlett-Packard عبر TecanT8 +لتوزيع مركبات الاختبار
مجهر epifluorescence مع كاميرا رقمية متصلة بالكمبيوترNikonTiلتصوير الخلايا الحية ؛ يمكن لأي مجهر فلوري قياسي أن يحل محل ، مع تباين الطور أو بصريات DIC ، القادرة على التصوير الأخضر (الفلورسين) والبرتقالي والأحمر إلى الأحمر (تكساس الأحمر) والأحمر البعيد (Cy5) ، مع زيت 100X الهدف للحصول على أعلى دقة
أطباق زراعة الأنسجة ذات القاع الزجاجيMatTek CorporationP35G-1.5-20-Cلتصوير الخلايا الحية. تسمح أطباق مثل MatTek بالتصور المجهري عند تكبير 600X أو 1,000X من خلال استخدام مجهر epifluorescent مقلوب أو مجهر متحد البؤر. يبلغ قطر هذه الأطباق المحددة 3.5 سم ، وقطرها الداخلي 3.3 سم ، مع زلات غطاء بقطر 20 مم # 1.5 يتم إدخالها في القيعان.
يمكن استخدام Photoshop CS6أو AdobeAdobe Photoshop أو البرامج المماثلة لتلوين الصور الفاتحة والفلورسنت والدمج
Mathematica 10Wolfamلتوليد مخططات متساوية المحيط ثنائية الأبعاد ومتساوي السطح ثلاثي الأبعاد.
فائقة زجاج .

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
  2. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
  3. Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
  4. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
  5. Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
  6. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
  7. Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones? Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
  8. Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
  9. Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
  10. Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).
  11. Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
  12. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  15. Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
  17. Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
  18. Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
  19. Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
  20. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
  21. Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).
  22. Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
  23. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
  24. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
  25. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
  26. Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Lux

مقالات ذات صلة