Method Article

إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي، اختبار مزدوج قراءات من بين الخلايا مضادات الميكروبات آخر وحقيقية النواة السمية لخلايا

DOI:

10.3791/54841

⸱

November 16th, 2016

 ,  , 
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تم تطوير اختبار عالي الإنتاجية في الوقت الفعلي لتحديد (1) مضادات الميكروبات المخترقة للخلايا حقيقية النواة والتي تستهدف مسببات الأمراض البكتيرية داخل الخلايا ، و (2) تقييم السمية الخلوية للخلايا حقيقية النواة. تم بعد ذلك دمج تباين في نفس التكنولوجيا مع تقنية الاستغناء الرقمي لتمكين دراسات تآزر سهلة وعالية الدقة واستجابة للجرعة وثنائية وثلاثية الأبعاد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد المعايير التقليدية للنشاط مضادات الميكروبات داخل الخلايا والسمية لخلايا حقيقية النواة على المقايسات نقطة النهاية. وتتطلب هذه المقايسات نقطة النهاية العديد من الخطوات التجريبية الإضافية قبل قراءات، مثل تحلل الخلية، مستعمرة تشكيل وحدة المصير، أو إضافة كاشف. عند تنفيذ الآلاف من المقايسات، على سبيل المثال، أثناء فحص عالية الإنتاجية، وجهد المصب المطلوبة لهذه الأنواع من المقايسات لا بأس بها. لذلك، لتسهيل عالية الإنتاجية اكتشاف مضادات الميكروبات، قمنا بتطوير فحص في الوقت الحقيقي لتحديد وقت واحد مثبطات نمو البكتيريا داخل الخلايا وتقييم السمية لخلايا حقيقية النواة. على وجه التحديد، وتمكين الوقت الحقيقي للكشف عن نمو البكتيريا داخل الخلايا عن طريق وضع علامة السلالات البكتيرية فحص إما مع الاوبرون البكتيرية لوكس (1 شارع الجيل فحص) أو صحفيين ببروتين (2 الثانية جيل، فحص متعامد). وغير سامة، وخلية غشاء impermeant، النووي صبغ ملزم حمضوأضاف خلال العدوى الأولية الضامة. وتستبعد هذه الأصباغ من خلايا قابلة للحياة. ومع ذلك، تفقد الخلايا المضيفة غير قابلة للحياة سلامة الغشاء تسمح بدخول ووضع العلامات الفلورية من الحامض النووي (حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين). والجدير بالذكر أن الحمض النووي ملزمة يرتبط مع زيادة كبيرة في العائد الكم الفلورسنت التي توفر قراءات الحل القائم على وفاة الخلية المضيفة. وقد استخدمنا هذا الاختبار المشترك لأداء شاشة عالية الإنتاجية في شكل صفيحة، وتقييم نمو الخلايا والسمية الخلوية بواسطة المجهر. والجدير بالذكر، أن مضادات الميكروبات تظهر التآزر التي التأثير المشترك لاثنين أو أكثر من مضادات الجراثيم عند تطبيقها معا أكبر مما كانت عليه عندما تطبق بشكل منفصل. اختبار لفي المختبر التآزر ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا عادة مهمة هائلة كما يجب تقييم التباديل اندماجي من المضادات الحيوية بتركيزات مختلفة. ومع ذلك، وجدنا أن لدينا فحص في الوقت الحقيقي جنبا إلى جنب مع الآلي، والاستغناء عن التكنولوجيا الرقمية صermitted اختبار التآزر سطحي. باستخدام هذه الأساليب، كنا قادرين على مسح منهجي عمل لعدد كبير من مضادات الجراثيم وحده، والجمع ضد مسببات المرض داخل الخلايا، البكتيريا المستروحة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مسببات الأمراض التي تنمو أو يقيمون مؤقتا في حجرات داخل الخلايا صعبة للقضاء على علاجيا. إلزام أو إلزام نسبيا مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل البكتيريا المستروحة، الكوكسيلا البورنيتية، البروسيلا النيابة. ، الفرنسيسيلة التولارية، والمتفطرة النيابة. غالبا ما تتطلب دورات من العلاج المضادة للميكروبات لفترات طويلة للعلاج والتي قد تتراوح من أشهر إلى سنوات حتى. وعلاوة على ذلك، يمكن لمسببات الأمراض خارج الخلية تحتل عابر منافذ داخل الخلايا، وبهذه الطريقة الهروب إجازته الدورات العادية العلاج المضادة للميكروبات وتظهر في وقت لاحق لبدء جولات جديدة من العدوى الخبيثة. المكورات العنقودية ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. في الوقت الحقيقي بين الخلايا النمو وخلية حقيقية النواة السمسة الفحص

  1. إعداد خلايا المضيف (خلايا J774A.1)
    1. ثقافة J774A.1 المصحف العضلة الخلايا الشبيهة بلعم معلق في RPMI 1640 بنسبة 9٪ تستكمل الحديد العجل المصل. في البداية مرور في قوارير زراعة الأنسجة. بعد الخلايا أصبحت متكدسة في 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة في 15 مل من المتوسط، وتقسيم عن طريق كشط والتخفيف إلى 65 مل مع نفس النوع من المتوسط، منها 15 مل يتم إرجاعها إلى قارورة زراعة ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صفيحة فحص نمو الخلايا

البيانية الشكل 1 الخطوات الفحص. الخطوات الآلي يظهر لا يمكن أن يؤديها يدويا. ومع ذلك، ومما يسهل الإنتاجية إلى حد كبير باستخدام أنظمة مناولة السائل.

ويبين الشكل 2 النتائج تمثيلية من 384 بئر صفيح.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا فحوصات في الوقت الحقيقي للكشف في وقت واحد من نمو البكتيريا داخل الخلايا والسمية لخلايا المضيف. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. أولا، لأداء فحص قوي، يجب أن يكون هناك ما يكفي من الفصل الطيفي بين قراءات البكتيرية والسمية الخلوية. هذا الفصل هو جوهري لمجموعات من الصحفيين الاوبرون وسيفيراز والأصباغ الحمض النووي ملزم الفلورسنت. ومع ذلك، استنادا إلى تجربتنا (الجدول 1-3، الشكل 2)، واستخدام مزدوج، قراءات الفلورسنت يتطلب إشارات فلوري متدا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد دراسة نشرت في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم جائزة R01AI099122 إلى JEK المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية لل الصحة. ونود أن نشكر جنيفر سميث، ديفيد روبل، سو تشيانغ، دوغ الفيضانات، شون جونستون، جنيفر Nale، ستيوارت Rudnicki، بول يان، ريتشارد سيو، وراشيل واردن من مرفق فحص ICCB-لونجوود و / أو مختبر الفحص الوطني ل للمراكز الإقليمية لنيو إنجلاند للتميز في الدفاع البيولوجي والأمراض المعدية (بدعم من U54AI057159) للمساعدة في التنمية وأداء المقايسات فحص عالية الإنتاجية الناشئة. كما نود أن نشكر كينيث سميث لتعليقات مفيدة....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
J774A.1 الخلاياالأمريكية نوع الثقافة مجموعةTIB-67الخلية المضيفة
ACESسيجما ألدريتشA9758   ؛لصنع مستخلص الخميرة الفحم المخزنة وأجار ووسط مستخلص الخميرة المخزنة
مستخلص الخميرة ،210929Becton-Dickinson / Difcoالترشيح لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ووسط مستخلص الخميرة المخزنة ؛ قد تتسبب الدرجات المنخفضة في ضعف النمو و / أو تغيير حساسية الفيلقية لمثبطات النمو
حمض ألفا كيتوجلوتاريك ، ملح أحادي البوتاسيومسيجما ألدريتشK2000لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ومستخلص الخميرة المخزنة متوسط
بيروفات الصوديومSigma-AldrichP5280لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ومستخلص الخميرة المخزنة متوسط
فوسفات البوتاسيوم ، ثنائي القاعدةThermo Fisher ScientificP288-500لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ومستخلص الخميرة المخزنة متوسط
L-cysteineSigma-AldrichC-7755لصنع مستخلص خميرة الفحم المخزن أجار ووسط
مستخلص الخميرة المخزنةحديد الأمونيوم (III) ستراتSigma-AldrichF5879لصنع أجار مستخلص خميرة الفحم المخزن ووسط مستخلص الخميرة المخزنة ؛ يمكن استخدام بيروفوسفات الحديديك بدلا من ذلك ولكن من الصعب وزنها بدقة
محلول هيدروكسيد البوتاسيوم ، مركزThermo Fisher ScientificSP236-500لصنع أجار مستخلص خميرة الفحم المخزن ومستخلص الخميرة المخزنة وسط
ماء منزوع الأزهارN / AN / Aلصنع مستخلص الخميرة الفحم المخزنة وأجار ووسط مستخلص الخميرة المخزنة
الثايميدين (درجة زراعة الأنسجة)Sigma-AldrichT1895لتكملة كل من RPMI 1640 ومستخلص الخميرة المخزنة أجار / متوسط & [مدش] ؛ يمكن استخدام الثايميدين منخفض الدرجة لهذا الأخير ، ولكنه قد يتسبب في ضعف نمو الخلايا و / أو موت الخلايا في RPMI 1640
RPMI 1640 ، الصيغة القياسيةCorning via Thermo Fisher Scientific10-040-CVلزراعة خلايا J774A.1 قبل الطلاء ؛ يتضمن 2 ملي مولار L-glutamine
RPMI 1640 يفتقر إلى الفينول الأحمرCorning عبر Thermo Fisher Scientific17-105-CVللطلاء بخلايا J774A.1 في 384 صحنا جيدا (غير مناسب للنمو قبل الطلاء) ؛ يفتقر أيضا إلى L-glutamine & [مدش] ؛ مكمل ل 2 ملي مولار قبل استخدام
L-glutamine ، 200 ملي مولار في 0.85٪ كلوريد الصوديوم (درجة زراعة الأنسجة)HyClone عبر Thermo Fisher ScientificSH30034.02لمكملة RPMI 1640 التي تفتقر إلى L-glutamine ، إلى 2 ملي مولار التركيز
النهائي مصل العجل المكمل بالحديدالجوزاء المنتجات الحيوية100-510لمكملة RPMI 1640 ، إلى 9.1٪ تركيز نهائي
محلول التربان الأزرقSigma-AldrichT8154للتلوين لتحديد موت الخلايا J774A.1 أثناء حساب كثافة الخلية
SYTOX Green ، محلول 5 ملي مولار في DMSOThermo Fisher ScientificS7020لتلوين J774A.1 تحديد موت الخلايا عن طريق قراءة التألق أو الفحص المجهري epifluorescence (بالاقتران مع بكتيريا الفلورسنت البرتقالية والحمراء أو الحمراء البعيدة). استخدم بتركيز نهائي 125 نانومتر.
حاضنة زراعة الخلاياThermo Fisher Scientific13-255-26لحضانة خلايا J774A.1 (قبل وبعد الإصابة) ؛ يمكن استخدامها أيضا لحضانة البكتيريا ، أو يمكن استخدام حاضنة الغلاف الجوي القياسية بدلا من ذلك)
شاكر مداريBellCo Glass7744-01010لهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة ؛ يناسب داخل حاضنة زراعة الخلايا ؛ يتضمن قاعدة شاكر 7744-01000 وصينية 7740-01010 (هذه متوفرة أيضا بشكل منفصل)
قوارير شاكر (250 مل)ChemGlass Life SciencesCLS-2038-04لحضانة الخلايا J774A.1 قبل الإصابة
بشاكر المشابك للقوارير (250 مل)BellCo7744-16250لهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة
قوارير شاكر (1,000 مل)ChemGlass Life SciencesCLS-2038-07لاهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة
بشاكر المشابك للقوارير (1,000 مل)BellCo Glass7744-16100لهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة
أغطية إسفنجية رغوية للقوارير (250 مل -1,000 مل)ChemGlass Life SciencesCLS-1490-038لهز حضانة خلايا J774A.1 قبل الإصابة ؛ يقلل من خطر التلوث بالنسبة للأغطية المعدنية القياسية
MultiDrop Combi مضخة تمعجية متعددة القنوات قابلة للبرمجةThermo Fisher Scientific5840300للاستغناء عن خلايا J774A.1 ، معلق متوسط وبكتيري يحتوي على فلوروفورات إلى أعداد كبيرة من 384 أطباق بئر
مشعب التجويف القياسي CombiThermo Fisher Scientific24072670حجم الاستغناء الافتراضي 20 &# 956 ؛ ل غير كاف للتعويض عن الاستقرار و [مدش] ؛ زيادة إلى 80 &# 956; ل
أطباق بيضاء 384 جيدة معالجة لزراعة الأنسجةCorning3570لقراءة اللمعان والفلورة ؛ كتالوج Greiner # 781080 تم اختباره أيضا بنجاح
DMSO (درجة زراعة الأنسجة ، في أمبولات مختومة)Sigma-AldrichD2650لإذابة مركبات التحكم والاختبار الإيجابية
AzithromycinSigma-AldrichPHR1088التحكم الإيجابي بالمضادات الحيوية
Saponin (من لحاء Quillaja)Sigma-AldrichS-4521التحكم الإيجابي في السمية
الماصةمتعددة القنواتThermo Fisher ScientificFinnpipetteلنقل كميات ثابتة من مركبات التحكم الإيجابية ؛ يجب أن تحتوي الماصة على توزيع رقمي مع حواجز لتمكين الاستغناء المتكرر عن حجم
ثابت روبوت نقل دبوس إبسونEpson / ICCB-L(معدات مخصصة)لنقل كميات ثابتة من مركبات الاختبار من مصفوفات المكتبة نظام
الاستغناء الرقميHewlett-Packard عبر TecanD300لنقل كميات متغيرة من مركبات الاختبار تتراوح من 11 بيكوليتر إلى 10 ميكرو ؛ ل
خراطيش T8 + لنظام الاستغناء الرقمي D300Hewlett-Packard عبر TecanT8 +لتوزيع مركبات الاختبار
مجهر epifluorescence مع كاميرا رقمية متصلة بالكمبيوترNikonTiلتصوير الخلايا الحية ؛ يمكن لأي مجهر فلوري قياسي أن يحل محل ، مع تباين الطور أو بصريات DIC ، القادرة على التصوير الأخضر (الفلورسين) والبرتقالي والأحمر إلى الأحمر (تكساس الأحمر) والأحمر البعيد (Cy5) ، مع زيت 100X الهدف للحصول على أعلى دقة
أطباق زراعة الأنسجة ذات القاع الزجاجيMatTek CorporationP35G-1.5-20-Cلتصوير الخلايا الحية. تسمح أطباق مثل MatTek بالتصور المجهري عند تكبير 600X أو 1,000X من خلال استخدام مجهر epifluorescent مقلوب أو مجهر متحد البؤر. يبلغ قطر هذه الأطباق المحددة 3.5 سم ، وقطرها الداخلي 3.3 سم ، مع زلات غطاء بقطر 20 مم # 1.5 يتم إدخالها في القيعان.
يمكن استخدام Photoshop CS6أو AdobeAdobe Photoshop أو البرامج المماثلة لتلوين الصور الفاتحة والفلورسنت والدمج
Mathematica 10Wolfamلتوليد مخططات متساوية المحيط ثنائية الأبعاد ومتساوي السطح ثلاثي الأبعاد.
فائقة زجاج .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
  2. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intra....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intracellular Antimicrobial ActivityEukaryotic Cell CytotoxicityReal time AssayHigh throughput ScreeningDual readout TestingBacterial Lux OperonFluorescent Protein ReportersNucleic Acid binding DyeAutomated Liquid HandlingSynergy Testing

Related Articles