المراقبة والقياس الكمي للسلوك التزاوج في غابة الصنوبر نيماتودا، Bursaphelenchus xylophilus

Summary

يتم تقديم بروتوكول للتحقيق في سلوك التزاوج للديدان الخيطية من خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus. السمات السلوكية ل B. xylophilus موصوفة في عملية التزاوج.

Abstract

وهناك طريقة لمراقبة وقياس سلوك التزاوج من الديدان الخيطية خشب الصنوبر، Bursaphelenchus xylophilus، وقد تم تأسيسها تحت مجهر تشريحي. لتحسين كفاءة التزاوج باء Xylophilus وزيادة فرص الملاحظة التزاوج، كان الكبار البكر مثقف وتستخدم للتحقيق. وقد تم الحصول على البيض عن طريق الحفاظ على الديدان في الماء والسماح للإناث لوضع البيض لمدة 10 دقيقة. وقد تزامن الأحداث في المرحلة الثانية (J2) التي يحتضنها البيض لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية في الظلام، والتي تم الحصول عليها في وقت مبكر J4 من زراعة وJ2 مع العفن الرمادي، السنجابية المعنقدة، لمدة 52 ساعة أخرى. عند هذه النقطة الزمن، يمكن أن معظم الديدان الخيطية J4 تمييزها بوضوح عن كونه ذكرا أو أنثى باستخدام التشكل التناسلية. تم جمع الذكور والإناث J4 ومثقف بشكل منفصل في اثنين من أطباق بتري مختلفة لمدة 24 ساعة للحصول على الديدان الخيطية الكبار البكر. تم إقران وذكر البكر وأنثى العذراء في قطرة من واتإيه في البئر شريحة مقعرة. وقد تم تصوير سلوك التزاوج مع جهاز تسجيل الفيديو تحت مجهر تشريحي. وكانت الفترة كلها من عملية التزاوج 82.8 ± 3.91 دقيقة (يعني ± SE) ويمكن تقسيمها إلى 4 مراحل مختلفة: البحث، والاتصال، جماع، والعالقة. وكانت الدقائق المتوسطة لمدة 21.8 ± 2.0، 28.0 ± 1.9، 25.8 ± 0.7 و 7.2 ± 0.5، على التوالي. وقد وصفت إحدى عشرة السلوكيات الفرعية: المبحرة، تقترب، ويواجه، لمس، التطويق، وتحديد مكان، ربط، والقذف، وفصل، هدوء، والتجوال. ومن المثير للاهتمام، وقد لوحظ المنافسة داخل جنسية واضحة عندما تم تجميعها أنثى واحدة مع 3 ذكور أو ذكر واحد مع 3 إناث. هذا البروتوكول هو مفيد وقيم، وليس فقط في التحقيق في سلوك التزاوج باء xylophilus، ولكن أيضا في العمل كمرجع للدراسات علم السلوك من الديدان الخيطية أخرى.

Introduction

الديدان الخيطية من خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle ، هي واحدة من أكثر الأنواع الغازية تدميرا ، مما يتسبب في ذبول أشجار الصنوبر وموتها في نهاية المطاف. يعتقد أن هذه الديدان الخيطية المسببة للأمراض موطنها الولايات المتحدة الأمريكية ، ولكن تم نقلها إلى العديد من البلدان ، بما في ذلك الصين واليابان وكوريا الجنوبية والبرتغال. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عنه أيضا في إسبانيا ، مما أدى إلى مقتل ملايين أشجار الصنوبر بخسائر اقتصادية فادحة وتهديد إنتاج الغابات والاستقرار البيئي^1-5.

بمجرد إصابة شجرة الصنوبر المضيفة بالديدان الخيطية من خشب الصنوبر ، يتم نشر آلاف الملايين من النسل بسرعة داخل الجذع. هذا يسبب خلل نسيج الخشب ، مما يؤدي إلى الذبول وفي النهاية موت الشجرة المضيفة⁶. ومع ذلك ، لا توجد حاليا طريقة فعالة للسيطرة على هذا المرض. قد يلعب سلوك التزاوج دورا مهما في الخصوبة العالية لهذه الديدان^{الخيطية 7}. لذلك قمنا بالتحقيق في سلوك التزاوج ل B. xylophilus في المختبر ، في محاولة لإيجاد طريقة فعالة لإزعاج تزاوجها وتقليل خصوبتها.

يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم الطرق التفصيلية لكيفية الحصول على البالغين البكرية البالغين وكيفية مراقبة وتحليل سلوك التزاوج باستخدام مسجل فيديو ومجسم مجهر. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول كمرجع للدراسات السلوكية للديدان الخيطية الأخرى.

Protocol

1. اكتساب العذراء الديدان الخيطية الكبار

1. غابة الصنوبر عزل النيماتودا والظروف والثقافة
   ملاحظة: إن B. xylophilus عزل تم استخراج Nxy61 أصلا من massoniana صنوبر المريضة في منطقة نينغبو بمقاطعة تشجيانغ في الصين.
   1. إعداد البطاطس سكر العنب آجار (PDA، انظر الجدول من المواد) لوحات لزراعة عفن رمادي.
   2. للتلقيح، لكمة قطعة من حصير الفطرية بقطر 10 مم من حصيرة ب السنجابية ووضعها في منتصف لوحة PDA جديدة. ثقافة السنجابية B. لمدة 5 د عند 25 درجة مئوية في الظلام.
   3. ثقافة النيماتودا غابة الصنوبر في طبق بتري استعداد تحتوي B. السنجابية عند 25 درجة مئوية في الظلام.
2. اكتساب B. xylophilus البيض
   1. وضع أنبوب المطاط فرضت دون قمع وعقد قمع مستعد في رف لتجميعجهاز قمع بيرمان. وضع طبقتين من ورق الترشيح بدلا من الشاش في الفم من القمع.
   2. نقل الثقافات الفطرية لإعداد قمع ويضاف الماء حتى يتم مغمورة حصيرة الفطرية. الانتظار 2 ساعة، وسوف يخرج الديدان من ثقافة فطرية، عبر ورقة الترشيح، ويستقر في أدنى جزء من قمع بيرمان.
   3. جمع أول زوجين من قطرات من الماء من أسفل أنبوب في أنبوب 15 مل وجمع الديدان الخيطية عن طريق الإفراج عن ببطء المشبك على الأنبوب.
   4. أجهزة الطرد المركزي المجموعات المذكورة أعلاه في 3000 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
   5. إزالة الطبقة العليا من المياه مع ماصة و resuspend مع 1 مل من معقم مزدوج المقطر (دد) H ₂ O.
   6. مع ماصة، ونقل إعادة تعليق أعلاه إلى زجاج جديد طبق بتري (6 سم القطر). إضافة 3 مل من معقم د د H ₂ O إلى طبق بيتري للتأكد من أن الديدان الخيطية هي قادرة على السباحة بحرية.
   7. حفاظ على الديدان الخيطية في الزجاجق طبق بيتري لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية في الظلام. سيتم وضع البيض من قبل الإناث الحوامل. بسبب سطح بروتين سكري، وسوف البيض التمسك السفلي من الزجاج طبق بيتري.
   8. إزالة الماء والديدان بعناية، من دون إزعاج البيض. إضافة 3 مل من معقم د د H ₂ O على الزجاج طبق بيتري على الفور لمنع البيض من الجفاف.
   9. كرر الخطوة 1.2.8 3X لإزالة جميع اليرقات والكبار، والحصول على البيض النقية. إضافة اضافي 2 مل (5 مل في المجموع) من المعقم د د H ₂ O إلى طبق بيتري.
3. الاستحواذ على الأحداث الرابعة من مرحلة (اليرقات J4)
   1. يفقس البيض التي تم جمعها لمدة 24 ساعة في الظلام عند 25 درجة مئوية للحصول على J2 اليرقات.
   2. نقل اليرقات J2 مع ماصة إلى 15 مل أنبوب، الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 2 دقيقة، وإزالة الطبقة العليا من المياه.
   3. Resuspend واليرقات J2 مع 200 ميكرولتر من العقيمة د د H ₂ O، ومن ثم نقلها إلىلوحة PDA يحتوي B. السنجابية.
   4. ثقافة اليرقات J2 لمدة 52 ساعة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية في الظلام. عند هذه النقطة الزمن، وتطورت معظم اليرقات J2 في مرحلة مبكرة من J4 اليرقات.
4. الحصول على الديدان الخيطية الكبار البكر
   1. إعداد إبرة لالتقاط الديدان الخيطية عن طريق رسم الزجاج الشعرية بعد تسخينه على موقد الكحول.
      ملاحظة: غيض من هذه الإبرة الشعرية تحتاج عادة لتكون 50 ميكرون في القطر، ما يقرب من العرض الجسم من الديدان الخيطية الكبار، بحيث يمكن استخدامه كأداة لالتقاط الديدان الخيطية واحدة.
   2. تجميع قمع بيرمان واستخراج الديدان الخيطية من الثقافات الفطرية لمدة 2 ساعة، كما هو موضح في الخطوات 1.2.1 - 1.2.3.
   3. نقل J4 مع الماء في طبق بيتري نظيفة.
   4. مراقبة الديدان الخيطية تحت مجهر تشريحي والتمييز بين الذكور والإناث من قبل التشكل الأعضاء التناسلية، كما وصفها ماميا وKiyohara ⁸ (الشكل 1 ). التقاط الديدان الخيطية من الجنس المطلوب مع إبرة الشعرية الجاهزة وتحويلها إلى لوحة الفطرية الثقافة المناسبة للذكور أو الإناث.
      ملاحظة: هناك أكثر من الإناث أكثر من الذكور، مع نسبة الإناث في 60-70٪. الفرج الإناث مختلف كليا من الشوكة الذكور. بالمقارنة مع البالغين، والشوكة أو الفرج في مرحلة مبكرة J4 أصغر، لكنها ما زالت قائمة يمكن بسهولة رأيت وتميزا. الديدان الخيطية يتحرك دائما في الماء، مما يزيد في بعض الأحيان صعوبة في التمييز الذكور والإناث.
   5. ثقافة اليرقات J4 لمدة 24 ساعة أخرى في درجة حرارة 25 درجة مئوية في الظلام.
      ملاحظة: يجب على جميع النيماتودا تتطور إلى البالغين، ولكن لأنها unmated، أنها تعتبر البالغين البكر.
   6. تجميع اثنين بيرمان مداخل واستخراج البالغين البكر من الثقافات الفطرية لمدة 2 ساعة، كما هو موضح في الخطوات 1.2.1 - 1.2.3، ونقل الذكور البالغين البكر والإناث إلى قسمين، أطباق بتري نظيفة منفصلة.

   2. رصد وتسجيل الفيديو من سلوك التزاوج

   1. إعداد عدة شرائح مقعرة وإضافة 200 ميكرولتر من العقيمة د د H ₂ O لكل من آبارهم.
   2. التقاط استعداد البكر الذكور البالغين أو والإناث مع إبرة الشعرية ووضع الديدان الخيطية واحد فقط في الماء من كل شريحة مقعرة.
   3. إبقاء البالغين البكر داخل البئر لمدة 1 ساعة للسماح لهم التكيف مع البيئة المائية الجديدة.
   4. زوج من الذكور والإناث البكر عن طريق نقل واحد منهم من بئر واحد إلى آخر باستخدام ماصة.
   5. مراقبة سلوك التزاوج من 1♀ + 1♂ الجمع في الشريحة المقعرة تحت مجهر تشريحي.
   6. لتحليل كفاءة التزاوج من البالغين البكر، وحساب نسبة نجاح التزاوج (R) ومقارنتها مع أن من الأزواج الكبار تم اختيارها عشوائيا. حساب R كنسبة مئوية من مكررات حيث لوحظ الجماع مقارنة مع العدد الإجمالي للمكررات دراستها.
   7. لتحقيق خيار التزاوج والمنافسة intrasexual، مجموعة ومراقبة الديدان الخيطية العذراء اثنين من مجموعات مختلفة: 1♀ + 3♂ و3♀ + 1♂.
   8. من أجل جمع البيانات للتحليل الكمي والكيفي، تصوير سلوك التزاوج باستخدام المجهر الفيديو. عادة، يتم الانتهاء من عملية التزاوج كلها، من الوقت الذي يتم وضعها النيماتودا في بئر الشريحة المقعرة لحظة عندما تتحرك بعيدا بعد الجماع، في غضون 2 ساعة. ولذلك، تسجيل عملية التزاوج مستمر لمدة 2 ساعة على الأقل كما مكررة واحدة. كاملة لا يقل عن 30 مكرر مجموع لكل تركيبة.
      ملاحظة: إضافة أكثر عقيمة ي H ₂ O (عادة 50 ميكرولتر) كل 0.5 ساعة إلى البئر لتعويض التبخر أثناء عملية التسجيل.

   3. جمع البيانات

   1. عرض جميع مقاطع الفيديو بدقة على شاشة الكمبيوتر وتوصيف سلوكيات الفرعية نوعيا.
   2. قياس مدة عشر التزاوج باستخدامه وظيفة الإطار حسب الإطار من مسجل الفيديو. طرح الوقت بدءا من نقطة النهاية يدويا.
   3. لمزيج 1♀ + 1♂، تحليل كل تسجيل الفيديو وقياس مدة من الأحداث التالية:
      1. قياس مدة من البحث (أي وقت من عند إدخال الإناث والذكور في البئر من الشريحة المقعرة لحظة التي يواجهونها والاتصال بعضها البعض).
      2. قياس مدة الاتصال (أي وقت من أول اتصال لحظة عندما يتم وضع الذكور على وجه التحديد في الفرج الأنثى للجماع الأول).
      3. قياس مدة جماع (أي الوقت من عند الذكور يتم وضع على وجه التحديد في الفرج الأنثى حتى تنزلق من جسم الأنثى بعد القذف). ملاحظة: يمكن لبعض الديدان الخيطية التزاوج عدة مرات في 2 ساعة. في مثل هذه الحالات، وقياس مدة الجماع من الجماع الأول إلى نهاية لاسر واحد، بما في ذلك الوقت بين بين.
      4. قياس مدة العالقة (أي فترة ما بعد الجماع حتى السباحة الذكور والإناث بعيدا عن بعضها البعض وتفصل بينها مسافة أكثر من طول الجسم النيماتودا "(في الغالب 1 مم)).
   4. عد من وتيرة الجماع ومدة كل الجماع ومتوسط مدة كل copulations في 2 ساعة لكل من مجموعات مختلفة (أي 1♀ + 1♂، 3♀ + 1♂، و1♀ + 3♂).
   5. حساب نسبة نجاح التزاوج لأول اتصال (P) لمجموعات مختلفة مثل نسبة نجاح التزاوج بعد الاتصال الأول الذي يجرى على الفور ودون أي انقطاع. في مرحلة الاتصال، يمكن ملاحظة عدة اتصالات قبل الجماع الفعلي.
      1. عندما تكون المسافة بين شخصين هي أكثر من طول الجسم، والنظر في جهة اتصال واحدة لتكون أكثر. لتكرار واحد، سجل P إلى 100٪ عند الجماع طلاحظ الصورة على الفور بعد أول اتصال، دون انقطاع، أو ما يعادل 0.00٪ إذا لم يلاحظ أي الجماع أو إذا كان هناك الجماع ولكن بعد يومين أو مزيد من الاتصالات.
         ملاحظة: كان هناك 30 مكررات لكل تركيبة هو موضح هنا.

Results

وكان معدل نجاح التزاوج (R) من البالغين البكر 86.67٪ في المتوسط، وهو أعلى بكثير من البالغين تم اختيارها عشوائيا: 13.33 ± 4.65٪ (F = 1301.71، مدافع = 1، P = 0.0001) (الشكل 2). وتشير هذه النتيجة أنه من الأسهل لمراقبة سلوك التزاوج باء xylophilus مع الكبار البكر من وبالغين مختارين عشوائيا.

عندما يقترن ذكر واحد...

Discussion

الاختبارات السلوكية تشكل جانبا أساسيا من البيئة الكيميائية، بيولوجيا الأعصاب وعلم الأحياء الجزيئية، وعلم الوراثة. الديدان الخيطية، وبخاصة C. ايليجانس، وتستخدم على نطاق واسع للدراسات في هذه المجالات. وقد تم التحقيق في سلوك التزاوج من جيم ايليجانس سابقا ^10-11. ومع ذلك، B. xylophilus هو كثير البيض ومختلفة من C. ايليجانس خنثوي، وعملية التزاوج لله عدة مظاهر سلوكية ^9. مؤخرا، تم الإبلاغ عن سلوك التزاوج من Bursaphelenchus okina...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus< / em> عزل Nxy61< / em>			مستخرج من Pinus massoniana< / em> في منطقة نينغبو في الصين
سلالة			التي تم الحصول عليها من أكاديمية الغابات الصينية
Baermann قمع أنابيب	الصقر Sengong
أجهزة	Sengong
	Sengong
ماصة	Sengong
معقمة DD H2< / sub>O			معقمة بضغط مرتفع من البخار عند 121 درجة ؛ ج لمدة 30 دقيقة.
أطباق بتري	Sengong
المساعد الشخصي الرقمي متوسط	Huankai Bio.	021050
حاضنة	Sengong
التدفق الصفحي	Sengong
الزجاج الشعري	Sengong
مجسم	Leica	LED5000 RL
مجهر ستيريو مقلوب	Zeiss	A1
الشرائح المقعرة	Sengong