يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

دراسة الجمعية proteasome ومع المؤتلف Archaeal جسيم بروتيني وNondenaturing الصفحة: حالة لنهج موحد

6.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54860

⸱

ديسمبر 17, 2016

 , 
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

في هذه المقالة

ملخص

يستخدم هذا البروتوكول كل من coexpression الوحيدات وحدة فرعية postlysis خلط لإجراء فحص أكثر دقة التجمع proteasome والمؤتلف.

الملخص

تم العثور على جسيم بروتيني في جميع مجالات الحياة. أنها توفر الطريق الرئيسي لتدهور البروتين داخل الخلايا في حقيقيات النوى، ولكن ليس من المفهوم جمعيتهم تماما. كل جسيم بروتيني تحتوي على الجسيمات محفوظ الهيكلية الأساسية (CP)، أو 20S proteasome و، تحتوي على اثنين heptameric حلقات فرعية β تقع بين اثنين من حلقات α فرعية heptameric. Archaeal 20S جسيم بروتيني أبسط إنشائي مقارنة مع نظرائهم حقيقية النواة، ولكن كلا منهما متشاركين في آلية تجميع المشتركة. وبالتالي، فإن archaeal 20S جسيم بروتيني لتكون نماذج هامة لتجميع proteasome وحقيقية النواة. على وجه التحديد، قد حقق التعبير المؤتلف من 20S archaeal جسيم بروتيني جانب nondenaturing هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) العديد من الأفكار الهامة في نشوء حيوي proteasome و. هنا، نحن نناقش وسيلة لتحسين بناء على استراتيجية المعتادة من coexpression من α proteasome وarchaeal وبيتا مفارز قبل nondenaturiنانوغرام PAGE. علينا أن نبرهن على الرغم من سرعة وكفاءة، واتباع نهج coexpression وحده يستطيع ان يشتاق سيطة التجمع الرئيسية. في حالة proteasome و، coexpression قد لا تسمح الكشف عن نصف proteasome و، والمتوسطة التي تحتوي كاملة α-حلقة واحدة وكاملة β-حلقة واحدة. ومع ذلك، تم الكشف عن هذا المتوسط ​​بسهولة عبر المحللة الاختلاط. نقترح أن الجمع بين coexpression مع المحللة خلط ينتج نهج أكثر شمولا في تحليل التجمع، ومع ذلك لا تزال nonintensive العمل. قد يكون هذا النهج مفيدا لدراسة المجمعات multiprotein المؤتلف أخرى.

المقدمة

المجمعات Multiprotein تنفذ العديد من الأنشطة الخلوية الحيوية 1. بالنسبة لكثير من هذه المجمعات، يعرف الكثير عن هيكل وظيفة من حول جمعيتهم 2،3. وproteasome وهو واحد من هذا القبيل معقدة ويوجد في جميع مجالات الحياة. في حقيقيات النوى، وهذا الجهاز الجزيئية هي في صميم النظام proteasome و/ اليوبيكويتين (يو بي إس)، ويوفر الطريق الرئيسي لتدهور البروتين داخل الخلايا 4. وتتألف proteasome وحقيقيات النوى (ويشار إلى أن proteasome و26S) اثنين من المجالس الفرعية رئيسيين: proteasome و20S، أو كور الجسيمات (CP) 5، والتي يمكن أن توج على واحد أو كلا الطرفين من الجسيمات التنظيمي 19S (RP) 6.

وproteasome و20S هو الأنزيم البروتيني مجزأة كبير. ويحفظ لها هيكل رباعي على الاطلاق في جميع مجالات الحياة، ويتألف من كومة من أربع حلقات سبعة membered تحتوي على نوعين من الوحدات الفرعية المرتبطة هيكليا، α. وبيتا 5،7،8. في حقيقيات النوى، وتتألف اثنين من حلقات الخارجي لكل من سبع مفارز α متميزة واثنين من الحلقات الداخلية وتضم كل من سبع مفارز β متميزة. يقيم نشاط بروتين في غضون ثلاث مفارز β. على النقيض من ذلك، حلقات CP من العتيقة والبكتيريا وتتألف عادة من نوع واحد فقط من α ونوع واحد من الوحيدات بيتا. وقد وفرت جسيم بروتيني Archaeal نظام نموذجا هاما لدراسة التجمع proteasome وعلى حد سواء بسبب بساطتها التركيبية وعلى تقاسم آلية تجميع مشتركة مع نظرائهم حقيقية النواة من 9-13. وباختصار، مفارز ألفا التجمع في حلقات α أولا، التي تكون بمثابة سقالة على الذي بيتا مفارز تجميع. الناتج-جسيم بروتيني نصف (α 7 β 7) dimerize، مما أدى إلى تجميعها بشكل كامل CP (α 7 β 7 β 7 α 7). خلال dimerization، وpropeptides تقديم على مفارز بيتاتتم إزالة autocatalytically، وفضح threonines N-محطة الحفاز. استخدام جسيم بروتيني archaeal لنموذج التجمع في كثير من الأحيان يستفيد من إنتاج المؤتلف بروتينات proteasome وarchaeal في القولونية. هذا هو نهج جدير بالاهتمام لأنه تمكن مفارز إلى أن يتم إنتاجها في توليفات مختلفة، على حد سواء WT والإصدارات متحولة، في كائن المضيف الذي لا ينتج جسيم بروتيني الخاصة بها.

رصد التجمع من المجمعات متعددة البروتين يتطلب كيميائيا نوع من طريقة تجزئة الذي يفصل بين المجمعات تجميعها بشكل كامل من وسيطة التجمع والسلائف. وقد ثبت نظرا لقدرتها الفائقة حل، nondenaturing إس دي إس بايج (PAGE) لتكون مفيدة بشكل خاص في تجزئة من مختلف المجمعات multiprotein كبيرة 14-17. أصبح الجمع بين المؤتلف إنتاج proteasome وarchaeal و PAGE nondenaturing طريقة فعالة في dissectinز proteasome والتجمع 9،11،12،18. ومع ذلك، فإن الطريقة المعتادة التي يتم تطبيق هذا النهج (أي عن طريق coexpression المؤتلف من α و β مفارز) لديه عيب المهم. ردود الفعل الجمعية هي التعاونية وبقوة 3-يعتمد التركيز. وبالنظر إلى أن تركيز البروتين داخل الخلايا عالية جدا 19، وذلك بسبب الآثار حجم المستبعدة، ردود فعل التجمع المضي قدما بسرعة في الجسم الحي. وبالتالي فإنه من الممكن أن يغيب سيطة التجمع المهمة عندما يتم coexpressed α و β مفارز.

هنا، فإننا نقول للنهج المشترك في الدراسة التجمع proteasome وباستخدام المؤتلف مفارز proteasome وarchaeal. في هذا النهج، والعاملين على حد سواء أساليب خلط coexpression والمحللة. يسمح السابق للتحليل السريع للتجميع بسبب coexpression أقل كثافة اليد العاملة. هذا الأخير يعتمد على التعبير منفصل من α و β مفارز، تليها خلط. على الرغم من هذا requiالدقة أكثر قليلا من الجهد من coexpression، هو أكثر من كاف للتعويض عن القدرة على الكشف عن وسيطة التي غاب خلال coexpression. معا، يمكن أن هاتين الطريقتين توفير صورة أكثر اكتمالا التجمع proteasome و.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التعبير الجرثومي.

وصفت البلازميدات التعبير المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول رقم 1: ملاحظة. ووصف الحلول، وسائل الإعلام، والمخازن المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 2. ووصف استنساخ الجينات proteasome وحدة فرعية archaeal وتوليد البلازميدات التعبير في أماكن أخرى 18،20. وباختصار، البلازميدات لcoexpression المؤتلف من مفارز توظف استراتيجية الاوبرون bicistronic التي تساعد في الحصول على مستويات التعبير مقارنة مفارز الفردية 18،20. وكانت المعلمات التعبير الواردة أدناه مصممة تجريبيا لتكون الأمثل لمفارز proteasome وفي هذه الدراسة. قد يكون من الضروري لتحسين التعبير عن المسوخ proteasome وغيرها، لجسيم بروتيني من أنواع archaeal أخرى، أو للمجمعات البروتين المؤتلف الأخرى (انظر مناقشة).

  1. تحويل التعبير البلازميد من الاهتمام إلى المختص كيميائيا القولونية BL21 (DE3) الخلايا.
  2. إضافة 1-2 ميكرولتر من البلازميد (عادة 50-100 نانوغرام) لقسامة من الخلايا DE3 التي تم إذابة حديثا على الجليد، والاستمرار في احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  3. الصدمة الحرارية الخلايا في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 45 ق والعودة إلى أنبوب الجليد لadditionl 2 دقيقة.
  4. إضافة 1 مل من LB المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (150 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة.
  5. انتشار 100-200 ميكرولتر من الخليط التحول إلى LB-اساسه لوحات (لوحات تحتوي على وسائل الاعلام LB الصلبة، على أن تستكمل مع كانامايسين (جميع البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة المقاومة ترميز لهذا المضاد الحيوي)). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية O / N.
  6. صباح اليوم التالي، تلقيح مستعمرة واحدة من لوحة LB-كان إلى 3 مل من وسائل الاعلام LB-اساسه السائل في أنبوب ثقافة الزجاج. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (150 دورة في الدقيقة) لحوالي 2،5-3 ساعة، أو حتى لوحظ تعكر.
  7. قياس الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر (OD 600) في معمل. تمييع عبادة خليةلدى عودتهم مع كمية مناسبة من وسائل الاعلام LB-كان prewarmed إلى OD 600 من 0.4 في الحجم النهائي من 6 مل. استئناف اهتزاز في 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
  8. حمل تعبير البروتين في الثقافات السائلة بإضافة IPTG من محلول المخزون إلى تركيز النهائي من 1 ملم. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (150 دورة في الدقيقة) لحوالي 6-7 ساعات.
  9. حصاد الثقافات الخلية البكتيرية في مجملها إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
  10. إضافة 1.5 مل من ثقافة إلى أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي في 10000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  11. تجاهل طاف وإضافة 1.5 مل أخرى من نفس الثقافة لبيليه. أجهزة الطرد المركزي في 10000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  12. يتم حصاد كرر الخطوة 1.11 حتى ثقافة كاملة في أنبوب microcentrifuge.
  13. تخزين الكريات الناجم في -80 درجة مئوية حتى تحلل.

2. بكتيريا تحلل والمحللة خلط.

ملاحظة: للالعينات المدروسة عبر coexpression، اتبع القسم 2.1 (والأقسام الفرعية الخاصة به). للعينات التي تتطلب المحللة الاختلاط، اتبع القسم 2.2 (والأقسام الفرعية الخاصة به). تحليل TSP (المجموع، القابلة للذوبان، بيليه) التي يتم تضمينها في البروتوكول هو مفيد في تحسين تعبير البروتين التي يمكن أن تساعد في ضمان المبالغ التي متساوية تقريبا من α و β يتم الجمع بين خلال المحللة خلط (انظر مناقشة) مفارز. كما يوفر رقابة هامة إذا لم تكن كما هو متوقع النتائج المصب (أي أنه يتحقق من أن أعرب عن البروتين وقابل للذوبان). وبالتالي، فإننا نوصي بشدة بما في ذلك تحليل TSP في البداية. مرة واحدة وقد تم تحقيق بروتوكول الأمثل لمزيج فرعية معين، لا يتطلب تحليل TSP بدقة وهذا هو السبب وصفته اختياري أدناه.

  1. تحلل الخلايا البكتيرية وإعداد كسور القابلة للذوبان.
    1. ذوبان الجليد بيليه الخلية التي يسببها على الجليد لمدة 5 دقائق. Resuspend وبيليه في 600 ميكرولتر من تحلل العازلة.
    2. المؤتمر الوطني العراقيأوباتي تعليق على 30 درجة مئوية مع اهتزاز (150 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة لتوليد الكلي المحللة الخام.
      ملاحظة: الخطوة التالية والفرعي الذي يلي اختيارية.
    3. إزالة اثنين من 25 مكل من إجمالي المحللة الخام إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge منفصلة وإجراء تحليل TSP على النحو التالي.
      1. إلى واحد من اثنين 25 للمكل، إضافة عينة العازلة 5X SDS إلى تركيز النهائي من 1X. تسمية الأنبوب مع "تي" ل "الكلي المحللة الخام".
      2. احتضان "T" العينة على 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد تماما البروتينات.
      3. وفي الوقت نفسه، واتخاذ الثانية قسامة 25 ميكرولتر وأجهزة الطرد المركزي أنه في 10000 × ز لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه الصغير، وتحويلها إلى 1.5 أنبوب جديد مل microcentrifuge. تسمية هذا الأنبوب الجديد "S" ل "جزء القابلة للذوبان".
      4. إلى الباهي بيليه الصغير اليسارالثاني في الخطوة السابقة، إضافة 25 ميكرولتر من تحلل العازلة ودوامة ل resuspend. تسمية هذا الأنبوب "P" ل "جزء بيليه".
      5. إضافة 6 عينة العازلة ميكرولتر من 5X SDS إلى "S" وأنابيب "P" واحتضان عند 100 درجة مئوية كما هو موضح أعلاه.
        ملاحظة: إذا لن يتم استخدام عينات TSP ذلك اليوم لتحليل التعبير، فإنها قد تكون مجمدة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. إذابة مرة واحدة، لا بد من reincubated عند 100 درجة مئوية، كما هو موضح أعلاه، مباشرة قبل التحميل على 12٪ و / أو 15٪ القياسية هلام SDS-PAGE.
    4. بينما يتم تحليل TSP خارج، الطرد المركزي المتبقية 550 ميكرولتر من إجمالي المحللة الخام (أو كامل 600 ميكرولتر من إجمالي المحللة الخام إذا لم يتم إجراء تحليل TSP الخروج) في 10000 × ز لمدة 10 دقيقة. جمع طاف في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge الطازجة. هذا هو المحللة للذوبان التي سيتم استخدامها لتنقية.
  2. المحللة الاختلاط.
    1. تنفيذ تحلل كما هو موضح في الخطوات 2.1.1 و 2.1.2 أعلاه.
    2. مزيج 600 ميكرولتر من إجمالي المحللة الخام من البكتيريا التعبير الوحيدات α المطلوب مع 600 ميكرولتر من إجمالي المحللة الخام من البكتيريا التعبير الوحيدات بيتا المطلوب. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز ببطء لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري لتحسين فترة حضانة لتحقيق أقصى قدر من التجمع خلال المحللة خلط (انظر مناقشة). الوقت ودرجة الحرارة عرض هنا هي الأمثل للبروتينات المؤتلف في هذه الدراسة، وحددت أماكن أخرى 18.
    3. أجهزة الطرد المركزي في المحللة مختلطة في 10000 × ز لمدة 10 دقيقة لفصل المواد القابلة للذوبان من بيليه غير قابلة للذوبان. طاف لنقل 1.5 أنبوب جديد مل microcentrifuge. استخدام هذا المحللة للذوبان المختلطة لتنقية البروتين.

3. البروتين تنقية عبر يجمد الكوبالت الانجذاب الراتنج(أنا سيارة).

  1. تتوازن الراتنج.
    1. تماما resuspend والراتنج التي كتبها قلب الزجاجة ونقل 50 ميكرولتر من الطين إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 2 دقيقة لراتنج بيليه. نضح بعناية طاف.
      ملاحظة: نقوم طموح ماصة باستخدام الأزرق 1 مل ماصة لإزالة الجزء الأكبر من السائل. ويستخدم 2 ميكرولتر الأبيض نصيحة لمراقبة دقيقة من إزالة طاف المتبقية، وترك طبقة رقيقة جدا من السائل الذي يغطي الخرز.
    2. إضافة 1 مل من ألف الاحتياطي مزيج بلطف ل resuspend الراتنج وأجهزة الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 2 دقيقة لتكوير الراتنج. نضح بعناية طاف وكرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى.
  2. تطبيق المحللة للذوبان التي تم الحصول عليها سابقا في القسم 2.1 أو 2.2 إلى الراتنج معايرتها. احتضان الأنبوب مع دوران طيف في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. أنبوب الطرد المركزي في 700 × ز </ م> لمدة 5 دقائق وبعناية نضح طاف.
  3. غسل الراتنج على النحو التالي لإزالة البروتينات ملزمة nonspecifically.
    1. الراتنج و resuspend مع 1 مل من الاحتياطي ألف واحتضان مع هزاز لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. أنبوب الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 5 دقائق، ونضح بعناية طاف. كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى.
    2. الراتنج و resuspend مع 1 مل من الاحتياطي ب (الاحتياطي برصيد 5 ملي إيميدازول)، واحتضان مع هزاز لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أنبوب الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 5 دقائق، ونضح بعناية طاف. كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى.
    3. الراتنج و resuspend مع 1 مل من الاحتياطي C (الاحتياطي برصيد 10 ملي إيميدازول)، واحتضان مع هزاز لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أنبوب الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 5 دقائق، ونضح بعناية طاف.
  4. أزل البروتين عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من الاحتياطي E (الاحتياطي ومع 200 ملي إيميدازول) رس الراتنج. احتضان مع هزاز لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. نقل طاف التي تحتوي على البروتين النقي إلى 1.5 أنبوب جديد للطرد المركزي مل.
  6. تحلية البروتين المنقى بواسطة الطرد المركزي التسلسلي على النحو التالي.
    1. 400 ميكرولتر من البروتين النقي، إضافة 100 ميكرولتر العازلة ألف (وهذا يقلل من تركيز إيميدازول من 200 ملم إلى 160 ملم). تطبيق البروتين النقي إلى 0.5 مل مرشحات ultracentrifugal مع 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع. أجهزة الطرد المركزي في 14000 × ز لمدة 5 دقائق.
    2. تجاهل الترشيح وإضافة 400 ميكرولتر عازلة لتمييع retentate وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تواصل دورات الطرد المركزي / تخفيف حتى يسقط تركيز ايميدازول أقل من 4 ملم. على سبيل المثال، إذا كان كل الطرد المركزي يركز 500 ميكرولتر الى ~ 70 ميكرولتر (أو ما يقرب من 7 مرات)، ثم دورتين سوف يقلل من بدء 160 ملي تركيز ايميدازول (7 × 7 = 49 أضعاف) لapproximately 3.3 ملم.
    3. قياس تركيز البروتين من العينة المحلاة باستخدام مقايسة BCA 21.
      مطلوب تحلية للحد من مستويات إيميدازول أقل من الحد التسامح للمقايسة BCA، كما هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة: مذكرة. لدينا مختبر يفضل فحص BCA لأنها حساسة، لديها مجموعة ديناميكية كبيرة، ويسلك أقل بكثير الاختلاف البروتين إلى بروتين. ومع ذلك، أساليب أخرى لتحديد تركيز البروتين يمكن أن تكون بديلا للمقايسة BCA. والمفتاح هو أن يكون على بينة من مزايا كل طريقة والقيود.
  7. إضافة 5X العازلة عينة الأصلي إلى تركيز النهائي من 1X، والشروع في الكهربائي. بدلا من ذلك، عينات مخزن في -20 درجة مئوية لتحليلها لاحقا.

4. Nondenaturing إس دي إس بايج (PAGE).

تحذير: مادة الأكريلاميد Unpolymerized هو عصبي. ارتداء الرابطة الواقية المناسبةص.

  1. تحضير هلام PAGE nondenaturing على النحو التالي.
    1. إعداد كاسيت جل للالصب باستخدام لوحات زجاجية نظيفة والصب الموقف. وضع صانع التدرج على رأس محرك مغناطيسي صغير ووضع بقضيب صغير في كل غرفة.
    2. باستخدام 40٪ (ث / ت) مادة الأكريلاميد و 2٪ (ث / ت) الحلول الأسهم bisacrylamide، وإعداد 5٪ و 10٪ (ث / ت) الحلول هلام الأكريلاميد في منطقة عازلة حل الأصلي. تأكد من أن نسبة من إجمالي الأكريلاميد إلى bisacrylamide هي 37.5: 1. البرد على الجليد قبل صب.
      ملاحظة: نظام nondenaturing صفحة المستخدم هنا هو مطابق للنظام SDS-PAGE Laemmli، مع SDS حذف 22.
    3. إضافة الأمونيوم بيرسلفات (من 10٪ (ث ت) حل / الأسهم على استعداد في الماء) لحلول الأكريلاميد لبدء البلمرة. تركيز النهائي من الأمونيوم بيرسلفات 0.1٪ (ث / ت).
    4. صب حلول مادة الأكريلاميد في مجلسي صانع التدرج. مع ب منفذ أنابيب إدراجهاإلى صف لوحات من كاسيت هلام، وتفعيل محرك مغناطيسي وفتح الصمامات صانع التدرج. صب 5-10٪ هلام nondenaturing التدرج.
    5. مرة واحدة صب، تراكب الجل مع طبقة رقيقة من كحولالأيسوبروبيل والسماح للهلام لتتبلمر لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الوقت، وإعداد الطازجة 5٪ محلول هلام الأكريلاميد في المخزن حل الأصلي. بعد غروب هلام، صب قبالة كحولالأيسوبروبيل وشطف الجزء العلوي من هلام مع الماء منزوع الأيونات من زجاجة بخ.
    6. إلى حل هلام 5٪ أعدت أعلاه، إضافة الأمونيوم بيرسلفات (تماما كما هو موضح في 4.1.3) وتصب على رأس جل بلمرة حتى لوحات الزجاج مليئة. إدراج هلام المشط. السماح للهلام مضافين إلى تتبلمر لمدة 30 دقيقة إضافية.
    7. مرة واحدة هلام هو بلمرة، تجميع جل كاسيت في جهاز الكهربائي. بدلا من ذلك، تخزين هلام في 4 درجة مئوية، ملفوفة في مناشف ورقية مبللة والاغطية البلاستيكية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  2. مرة واحدة يتم تجميعها nondenaturing هلام PAGE إلى كهربائيجهاز trophoresis، وملء خزان مع 1X عازلة تشغيل الأصلي أعدت طازجة من مخزون احتياطي التشغيل الأصلي 10X.
  3. تحميل 10 ميكروغرام من البروتين النقي، التي تم الحصول عليها في نهاية الباب 3، في كل بئر باستخدام حقنة زجاجية.
  4. تحميل 2 ميكرولتر من ارتفاع الوزن الجزيئي الأصلي مستوى البروتين (المخفف في 1X العازلة تشغيل الأم) في واحدة من الآبار.
  5. تشغيل هلام في 55 V و 4 درجات مئوية حتى تدير الجبهة صبغ قبالة هلام (حوالي 4-4،5 ح).
  6. بالإضافة إلى هلام nondenaturing وتحليل aliquots من البروتين النقي من قبل القياسية SDS-PAGE 22.
    1. مزيج قسامات (10 ميكروغرام) من عينات البروتين المنقى، التي تم الحصول عليها في نهاية الباب 3، مع العازلة 5X SDS عينة لتركيز النهائي من 1X.
    2. احتضان عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتحميل على معيار 12٪ و / أو المواد الهلامية 15٪ SDS-PAGE 22.
    3. تشغيل في 80V لمدة 20 دقيقة وبعد ذلك في 120 V حتى تدير الجبهة صبغ قبالة هلام (وهذا هو تقريبا الوظيفةitional 75 دقيقة عن مادة هلامية بنسبة 12٪، و 120 دقيقة لهلام 15٪).

آخر 5. تصور وتلطيخ البروتين.

  1. بعد الكهربائي، وألواح الزجاج منفصلة بعناية ونقل هلام nondenaturing إلى علبة الجل تحتوي على 50 مل من الماء منزوع الأيونات. شطف الجل مع هزاز لطيف لمدة 5 دقائق. تجاهل المياه وكرر هذه الخطوة يغسل ثلاث مرات.
  2. أداء الركيزة تراكب الفحص على النحو التالي.
    1. إضافة 1 مل من تطوير العازلة التي تحتوي على الفلورة الببتيد الركيزة SUC-LLVY-AMC وتنتشر بشكل موحد على هلام. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: قضيب من الزجاج أو إفراز مادة هلامية (إسفين صغيرة من البلاستيك يستخدم لوحات الزجاج منفصلة) يمكن استخدامها لنشر السائل على هلام.
    2. نقل بعناية الهلام على نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية من نظام التصوير جل ومراقبة مضان بسبب الركيزة الببتيد المشقوق. صورة قياسية. نقل بعناية با هلامالمسيخ إلى علبة هلام.
    3. شطف الجل مرتين مع 50 مل من الماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق مع هزاز لطيف.
    4. وصمة عار الجل مع 10 مل من الغروية كاشف coomassie وصمة عار لمدة 60 دقيقة مع هزاز لطيف. هلام يزيل اللون مع 50 مل من الماء حتى الخلفية يصبح واضحا. تنطبق هذه الخطوة تلطيخ على المواد الهلامية SDS-PAGE القياسية أيضا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يبدأ proteasome والتجمع (الشكل 1) عند الجمع بين مفارز ألفا إلى حلقات شكل 9. ويمكن توضيح ذلك عندما يتم التعبير ألفا مفارز من archaeon المكورة الميثانية maripaludis S2 في كولاي كما C-عضال hexahistidine الموسومة (له الموسومة) المشتقات (الجدول 1). عندما تمت تنقية المؤتلف α-له البروتين ICAR وتحليلها بواسطة nondenaturing PAGE، لوحظت شريطين (الشكل 2A، حارة 1). لقد أثبتنا سابقا أن هذه تتوافق مع خواتم واحدة α (...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

علينا أن نبرهن صالح نهج موحد لتحليل التجمع proteasome والتي nondenaturing PAGE باستخدام جسيم بروتيني archaeal المؤتلف. على 9،11 الأسلوب المعتاد لcoexpression البكتيرية مفارز proteasome ويسمح للتحليل السريع ولكن قد لا تكشف عن وسيطة التجمع الرئيسية. نقترح الجمع بين coexpression مع المحللة خلط لتطوير صورة أوسع للأحداث التجمع.

وميزة هذا النهج المشترك هو أنه على الرغم من اشتراط التعبير منفصل من α وبيتا مفار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل في جزء من دعم البحوث أموال المنحة (RSFG) من جامعة إنديانا جامعة-بوردو، انديانابوليس، والجزء الآخر من جائزة من جمعية القلب الأمريكية 14GRNT20390154، إلى ARK

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول أكريلاميد (40٪)Biorad1610104الأكريلاميد غير المبلمر هو سم عصبي. ارتداء معدات الحماية المناسبة
Amicon ultra 0.5 مل مرشحات الطرد المركزيEMDMilliporeUFC501024
الأمونيوم بيرسولفاتSigmaA3678
ATPSigmaA7699
BCA مجموعة الفحصبيرس23225
بيساكريلاميد (2٪)Biorad1610142
Bromophenol BlueSigmaB8026
DNaseISigmaDN25
Dithiothreitol (DTT)Thermo FisherBP172
E. coli< / em> BL21 الخلايا المختصةEMD Millipore69450
GelCode BlueThermo Fisher24592كاشف وصمة عار coomassie الغروية للمواد الهلامية
نظام Gel doc EZBiorad1708270نظام توثيق هلام
Gel releasersBiorad1653320بلاستيك على شكل إسفين يستخدم لفصل ألواح الهلام ؛ مفيد لنشر السائل.
قضيب زجاجيثيرمو فيشر11-380B
جلسرينسيجما49767
جلايسينثيرمو فيشرBP3865
حقنة هاميلتونثيرمو فيشر14-813-38حقنة زجاجية لتحميل المواد الهلامية
HEPESUS BiologicalsH2010
HMW طقم معايرة أصليGE Healthcare170445-01معايير البروتين عالية الوزن الجزيئي
Hoefer SG30Thermo Fisher03-500-277صانع التدرج
ImidazoleUS Biologicals280671
IPTGUS BiologicalsI8500لتحريض تعبير البروتين
IsopropanolThermo FisherBP26181
كبريتات KanamycinUS BiologicalsK0010
LysozymeSigmaL6876
MgCl2< / sub>Fluka التحليلي630680
Mini Protean Tetra CellBiorad1658002EDUجهاز الرحلان الكهربائي للهلام
NaClThermo FisherS640-3
NaOHThermo FisherS318-1
Pefabloc SCRocheمثبط 11429876001البروتينات
pET42EMD Millipore70562Expression plasmid
Precision بالإضافة إلى جميع معيارBiorad1610373الأزرق للبروتين الجزيئي ل SDS-PAGE
مجموعة الطفرات السريعةAgilentتقنيات Agilent 200521
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)ثيرمو فيشرBP166
Suc-LLVY-AMCEnzo lifesciencesBML P802-0005الركيزة الفلورية
تالون المعادن تقارب الراتنجClontech635502الجمود الكوبالت تقارب راتنج
TEMEDSigmaT7024
تريسالولايات المتحدة البيولوجيةT8600
Triton-X100Sigma93426
TryptoneBacto BD211699
صينية عينة الأشعة فوق البنفسجيةBiorad1708271للتصوير بالأشعة فوق البنفسجية للمواد الهلامية مستخلص
الخميرةباكتو ديناربحريني 212720
القياسي

المراجع

  1. Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
  4. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  5. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
  6. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
  7. Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
  8. Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
  9. Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
  10. Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
  11. Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
  12. Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
  13. Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
  14. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
  15. Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
  16. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
  17. Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
  18. Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130(2015).
  19. Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
  20. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
  21. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  23. Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
  24. Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
  25. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

20S
دراسة الجمعية proteasome ومع المؤتلف Archaeal جسيم بروتيني وNondenaturing الصفحة: حالة لنهج موحد
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.