دراسة الجمعية proteasome ومع المؤتلف Archaeal جسيم بروتيني وNondenaturing الصفحة: حالة لنهج موحد

ملخص

يستخدم هذا البروتوكول كل من coexpression الوحيدات وحدة فرعية postlysis خلط لإجراء فحص أكثر دقة التجمع proteasome والمؤتلف.

الملخص

تم العثور على جسيم بروتيني في جميع مجالات الحياة. أنها توفر الطريق الرئيسي لتدهور البروتين داخل الخلايا في حقيقيات النوى، ولكن ليس من المفهوم جمعيتهم تماما. كل جسيم بروتيني تحتوي على الجسيمات محفوظ الهيكلية الأساسية (CP)، أو 20S proteasome و، تحتوي على اثنين heptameric حلقات فرعية β تقع بين اثنين من حلقات α فرعية heptameric. Archaeal 20S جسيم بروتيني أبسط إنشائي مقارنة مع نظرائهم حقيقية النواة، ولكن كلا منهما متشاركين في آلية تجميع المشتركة. وبالتالي، فإن archaeal 20S جسيم بروتيني لتكون نماذج هامة لتجميع proteasome وحقيقية النواة. على وجه التحديد، قد حقق التعبير المؤتلف من 20S archaeal جسيم بروتيني جانب nondenaturing هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) العديد من الأفكار الهامة في نشوء حيوي proteasome و. هنا، نحن نناقش وسيلة لتحسين بناء على استراتيجية المعتادة من coexpression من α proteasome وarchaeal وبيتا مفارز قبل nondenaturiنانوغرام PAGE. علينا أن نبرهن على الرغم من سرعة وكفاءة، واتباع نهج coexpression وحده يستطيع ان يشتاق سيطة التجمع الرئيسية. في حالة proteasome و، coexpression قد لا تسمح الكشف عن نصف proteasome و، والمتوسطة التي تحتوي كاملة α-حلقة واحدة وكاملة β-حلقة واحدة. ومع ذلك، تم الكشف عن هذا المتوسط ​​بسهولة عبر المحللة الاختلاط. نقترح أن الجمع بين coexpression مع المحللة خلط ينتج نهج أكثر شمولا في تحليل التجمع، ومع ذلك لا تزال nonintensive العمل. قد يكون هذا النهج مفيدا لدراسة المجمعات multiprotein المؤتلف أخرى.

المقدمة

المجمعات Multiprotein تنفذ العديد من الأنشطة الخلوية الحيوية ^1. بالنسبة لكثير من هذه المجمعات، يعرف الكثير عن هيكل وظيفة من حول جمعيتهم ^2،3. وproteasome وهو واحد من هذا القبيل معقدة ويوجد في جميع مجالات الحياة. في حقيقيات النوى، وهذا الجهاز الجزيئية هي في صميم النظام proteasome و/ اليوبيكويتين (يو بي إس)، ويوفر الطريق الرئيسي لتدهور البروتين داخل الخلايا ^4. وتتألف proteasome وحقيقيات النوى (ويشار إلى أن proteasome و26S) اثنين من المجالس الفرعية رئيسيين: proteasome و20S، أو كور الجسيمات (CP) ^5، والتي يمكن أن توج على واحد أو كلا الطرفين من الجسيمات التنظيمي 19S (RP) ^6.

البروتوكول

1. التعبير الجرثومي.

وصفت البلازميدات التعبير المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول رقم 1: ملاحظة. ووصف الحلول، وسائل الإعلام، والمخازن المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 2. ووصف استنساخ الجينات proteasome وحدة فرعية archaeal وتوليد البلازميدات التعبير في أماكن أخرى ^18،20. وباختصار، البلازميدات لcoexpression المؤتلف من مفارز توظف استراتيجية الاوبرون bicistronic التي تساعد في الحصول على مستويات التعبير مقارنة مفارز الفردية ^18،20. وكانت المعلمات التعبير الواردة أدناه مصممة تجريب....

النتائج

يبدأ proteasome والتجمع (الشكل 1) عند الجمع بين مفارز ألفا إلى حلقات شكل ^9. ويمكن توضيح ذلك عندما يتم التعبير ألفا مفارز من archaeon المكورة الميثانية maripaludis S2 في كولاي كما C-عضال hexahistidine الموسومة (له الموسومة) المشتقات (الجدول 1). عندما تمت تنقية المؤتلف α-له البروتين ICAR وتحليلها بواسطة nondenaturing PAGE، لوحظت شريطين (الشكل 2A، حارة 1). لقد أثبتنا سابقا أن هذه تتوافق مع خواتم واحدة α (.......

المناقشة

علينا أن نبرهن صالح نهج موحد لتحليل التجمع proteasome والتي nondenaturing PAGE باستخدام جسيم بروتيني archaeal المؤتلف. على ^9،11 الأسلوب المعتاد لcoexpression البكتيرية مفارز proteasome ويسمح للتحليل السريع ولكن قد لا تكشف عن وسيطة التجمع الرئيسية. نقترح الجمع بين coexpression مع المحللة خلط لتطوير صورة أوسع للأحداث التجمع.

وميزة هذا النهج المشترك هو أنه على الرغم من اشتراط التعبير منفصل من α وبيتا مفار.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
محلول أكريلاميد (40٪)	Biorad	1610104	الأكريلاميد غير المبلمر هو سم عصبي. ارتداء معدات الحماية المناسبة
Amicon ultra 0.5 مل مرشحات الطرد المركزي	EMDMillipore	UFC501024
الأمونيوم بيرسولفات	Sigma	A3678
ATP	Sigma	A7699
BCA مجموعة الفحص	بيرس	23225
بيساكريلاميد (2٪)	Biorad	1610142
Bromophenol Blue	Sigma	B8026
DNaseI	Sigma	DN25
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	BP172
E. coli< / em> BL21 الخلايا المختصة	EMD Millipore	69450
GelCode Blue	Thermo Fisher	24592	كاشف وصمة عار coomassie الغروية للمواد الهلامية
نظام Gel doc EZ	Biorad	1708270	نظام توثيق هلام
Gel releasers	Biorad	1653320	بلاستيك على شكل إسفين يستخدم لفصل ألواح الهلام ؛ مفيد لنشر السائل.
قضيب زجاجي	ثيرمو فيشر	11-380B
جلسرين	سيجما	49767
جلايسين	ثيرمو فيشر	BP3865
حقنة هاميلتون	ثيرمو فيشر	14-813-38	حقنة زجاجية لتحميل المواد الهلامية
HEPES	US Biologicals	H2010
HMW طقم معايرة أصلي	GE Healthcare	170445-01	معايير البروتين عالية الوزن الجزيئي
Hoefer SG30	Thermo Fisher	03-500-277	صانع التدرج
Imidazole	US Biologicals	280671
IPTG	US Biologicals	I8500	لتحريض تعبير البروتين
Isopropanol	Thermo Fisher	BP26181
كبريتات Kanamycin	US Biologicals	K0010
Lysozyme	Sigma	L6876
MgCl2< / sub>	Fluka التحليلي	630680
Mini Protean Tetra Cell	Biorad	1658002EDU	جهاز الرحلان الكهربائي للهلام
NaCl	Thermo Fisher	S640-3
NaOH	Thermo Fisher	S318-1
Pefabloc SC	Roche	مثبط 11429876001	البروتينات
pET42	EMD Millipore	70562	Expression plasmid
Precision بالإضافة إلى جميع معيار	Biorad	1610373	الأزرق للبروتين الجزيئي ل SDS-PAGE
مجموعة الطفرات السريعة	Agilent	تقنيات Agilent 200521
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)	ثيرمو فيشر	BP166
Suc-LLVY-AMC	Enzo lifesciences	BML P802-0005	الركيزة الفلورية
تالون المعادن تقارب الراتنج	Clontech	635502	الجمود الكوبالت تقارب راتنج
TEMED	Sigma	T7024
تريس	الولايات المتحدة البيولوجية	T8600
Triton-X100	Sigma	93426
Tryptone	Bacto BD	211699
صينية عينة الأشعة فوق البنفسجية	Biorad	1708271	للتصوير بالأشعة فوق البنفسجية للمواد الهلامية مستخلص
الخميرة	باكتو دينار	بحريني 212720

القياسي