Method Article

بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

DOI:

10.3791/54863

⸱

November 29th, 2016

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل من الفلورسنت فحوصات التنقل التحول الكهربي (fEMSA) باستخدام النقاء SOX-2 البروتينات مع الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت المسمى صبغ تحقيقات الحمض النووي كدراسة حالة لمعالجة مسألة البيولوجي المهم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكهربي فحوصات التنقل العالي (EMSA) هي أداة مفيدة لتوصيف التفاعلات بين البروتينات وتسلسل الحمض النووي المستهدفة. وكان النشاط الإشعاعي الطريقة السائدة لوضع العلامات الحمض النووي في EMSAs. ومع ذلك، فقد دفعت التطورات الحديثة في مجال الأصباغ الفلورية وطرق مسح استخدام العلامات الفلورية من الحمض النووي كبديل للنشاط الإشعاعي للمزايا سهولة التعامل، وتوفير الوقت وتقليل التكاليف، وتحسين السلامة. وقد استخدمنا مؤخرا EMSA فلوري (fEMSA) لمعالجة مسألة البيولوجي المهم بنجاح. يوفر تحليل fEMSA لدينا البصيرة الميكانيكية في تأثير طفرة مغلطة، G73E، في الحفظ جدا HMG عامل النسخ SOX-2 على حاسة الشم تنويع نوع الخلايا العصبية. وجدنا أن متحولة SOX-2 البروتين G73E يغير النشاط ملزم DNA محددة، وبالتالي التسبب في حاسة الشم التحول هوية الخلايا العصبية. هنا، نقدم على الوجه الأمثل، وفعالة من حيث التكلفة خطوة بخطوة بروتوكوللfEMSA باستخدام الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ يحتوي على LIM-4 / SOX-2 المجاورة المواقع المستهدفة والنقاء SOX-2 البروتينات (WT ومتحولة SOX-2 البروتينات G73E) كمثال البيولوجي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم EMSAs لتحليل التفاعلات بين الحمض النووي والبروتينات باستخدام الأصلي إس دي إس بايج (PAGE) لحل خليط من البروتين من الفائدة وتحقيق الحمض النووي المسمى تحتوي على المواقع المستهدفة المحتملة من البروتين 1. مسبار الحمض النووي ملزمة مع البروتين سوف يهاجرون أبطأ مقارنة مع التحقيق الذي تجريه الحمض النووي الحرة، وبالتالي فهو متخلف في الهجرة من خلال مصفوفة بولي أكريلاميد. وقد Radiolabeling من الحمض النووي بنسبة 32 P الطريقة السائدة للكشف في EMSAs. على الرغم من أن تطبيق radiolabeling في بحوث الكيمياء الحيوية كان مفيدا، يتم استخدام طرق وضع العلامات الحمض النووي بديل مع حساسية مقارنة نظرا لمخاطر الصحة والسلامة الم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: EMSAs باستخدام اختبار الحمض النووي DNA fluorescently المسمى أو غيرها من الحمض النووي المسمى أشكال تقاسم نفس البروتوكولات للبروتين أو استخراج الخلايا إعداد، رد فعل البروتين الحمض النووي ملزم، وإعداد جيل PAGE وتشغيل (الشكل 1A). الفروق الرئيسية هي الإجراءات DNA وضع العلامات، وبعد التشغيل خطوات المعالجة هلام، وطرق الكشف.

1. إعداد جل

  1. إعداد 5٪ هلام بولي أكريلاميد الأصلية التي تحتوي على TBE 0.5X (45 ملي تريس، بورات، 1 ملم EDTA) و 2.5٪ الجلسرين، وذلك باستخدام نظام هلام بروتي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البرتقال G صبغ تحميل (6X: 0.12 غرام البرتقال G في 100 مل من 30٪ الجلسرين) ويمكن أن يضاف إلى رد فعل ملزم قبل التحميل لتصور سير الكهربائي. سوف يتم الكشف عن الأصباغ التحميل الأخرى بما في ذلك برموفينول الأزرق خلال المسح الضوئي وبالتالي تتداخل مع تحليل الصور (الشكل 1B).

في بعض الحالات من EMSAs، خاصة إذا تم استخدام مستخلص النووي الإعداد،.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fEMSAs تشكل أداة فعالة للتحقيق في التفاعلات البروتينية الحمض النووي، وتكون بديلا لوسم المشعة من الحمض النووي. والأصباغ الفلورية مثل الأصباغ الحمراء المتاحة تجاريا، وتوفير وسيلة أكثر أمانا وصديقة للبيئة مقارنة مع وضع العلامات الحمض النووي المشع. EMSAs باستخدام الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ لا تتطلب خطوات المعالجة هلام postrun، وبالتالي توفير الوقت والتكلفة مقارنة تقنيات الحمض النووي العلامات الأخرى. الوقت للكشف عن عصابات باستخدام EMSAs المشعة يمكن أن تتراوح م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل زمالة Alfred P. Sloan Research (إلى C.-F.C.) ومنحة NIH R01 (5R01GM098026-05 إلى C.-F.C.). نشكر ديفيد كرو على الوصول إلى نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء المتقدم.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1   ؛Bio-Rad1610158أكريلاميد ضار وسام.
6x- الجسم المضاد لعلامة الحاتمة (HIS. H8)ThermoFisherMA1-21315
الجسم المضاد M2 المضاد للعلم   ؛Sigma-AldrichF3165-.2MG
ألبومين مصل البقر (BSA) درجة البيولوجيا الجزيئيةنيو إنجلاند بيولابرزB9000S
5'IRDye700 علامة DNA Oligosتقنيات الحمض النووي المتكاملةالحمض النووييشار إليها باسم "5'Dye-Label أو الأشعة تحت الحمراء صبغة الحمض النووي oligos" في المخطوطة. ستقوم الشركة بتصنيع 5 'IRDye قليلة النوكليوتيدات المسماة بالحمض النووي. يتطلب 100   كحد أدنى ؛ مو تخليق مقياس M وتنقية HPLC.
Klenow Fragment (3 '- >5' exo-)New England BiolabsM0212S
LightShif Poly (dI-dC)ThermoFisher20148E
Mini-PROTEAN   ؛ خلية الرحلان الكهربائي العمودي بيو راد1658000FC يشار إلى هذا باسم "نظام هلام البروتين الصغير" في المخطوطة. يمكن استخدام أي نظام كهربائي طالما أنها ألواح زجاجية شفافة يقل حجمها عن 25 سم × 25 سم.
نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء Odyssey CLxLI-COR BiotechnologyOdyssey CLx نظام الأشعة تحت الحمراءيشار إلى هذا باسم "نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء المتقدمة" في المخطوطة.
نظام تصوير Odyssey Fc  LI-COR BiotechnologyOdyssey Fc يشارإلى هذا باسم "نظام التصوير الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القريبة في المقام الأول للبقع الغربية" في المخطوطة.
برنامج Image Studio (الإصدار 4.0)برنامج LI-COR BiotechnologyImage Studio يشار إلى هذا باسم "برنامج تصوير معين" في المخطوطة.
البرتقال GSigma-AldrichO3756-25G
6x صبغة0.25٪ برتقالية G ؛ 30٪ جلسرين
0.5x TBE45 ملي مولار تريس بورات ؛ 1 ملي مولار EDTA
1x TE10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 1 ملي مولار EDTA
1x STE100 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ؛ 1 ملي مولار EDTA
5x عازلةملزمة50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 50 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 200 ملي كيلوسنال ؛ 5 ملي مولار MgCl2; 5 ملي EDTA ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 5 ملي متر DTT ؛ 250 μ جم / مل BSA
المخصص نظام التصوير ثنائي الوضع تحميل برتقالية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Electrophoretic Mobility Shift AssayInfrared Fluorescent DyeProtein DNA InteractionNon radioactive ProbesNative Polyacrylamide GelOligonucleotide AnnealingDNA Binding ActivityPurified SOX 2 ProteinInfrared Imaging SystemSupershift Assay

Related Articles