مقالة منهجية

بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

DOI:

10.3791/54863

⸱

نوفمبر 29, 2016

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل من الفلورسنت فحوصات التنقل التحول الكهربي (fEMSA) باستخدام النقاء SOX-2 البروتينات مع الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت المسمى صبغ تحقيقات الحمض النووي كدراسة حالة لمعالجة مسألة البيولوجي المهم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكهربي فحوصات التنقل العالي (EMSA) هي أداة مفيدة لتوصيف التفاعلات بين البروتينات وتسلسل الحمض النووي المستهدفة. وكان النشاط الإشعاعي الطريقة السائدة لوضع العلامات الحمض النووي في EMSAs. ومع ذلك، فقد دفعت التطورات الحديثة في مجال الأصباغ الفلورية وطرق مسح استخدام العلامات الفلورية من الحمض النووي كبديل للنشاط الإشعاعي للمزايا سهولة التعامل، وتوفير الوقت وتقليل التكاليف، وتحسين السلامة. وقد استخدمنا مؤخرا EMSA فلوري (fEMSA) لمعالجة مسألة البيولوجي المهم بنجاح. يوفر تحليل fEMSA لدينا البصيرة الميكانيكية في تأثير طفرة مغلطة، G73E، في الحفظ جدا HMG عامل النسخ SOX-2 على حاسة الشم تنويع نوع الخلايا العصبية. وجدنا أن متحولة SOX-2 البروتين G73E يغير النشاط ملزم DNA محددة، وبالتالي التسبب في حاسة الشم التحول هوية الخلايا العصبية. هنا، نقدم على الوجه الأمثل، وفعالة من حيث التكلفة خطوة بخطوة بروتوكوللfEMSA باستخدام الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ يحتوي على LIM-4 / SOX-2 المجاورة المواقع المستهدفة والنقاء SOX-2 البروتينات (WT ومتحولة SOX-2 البروتينات G73E) كمثال البيولوجي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم EMSAs لتحليل التفاعلات بين الحمض النووي والبروتينات باستخدام الأصلي إس دي إس بايج (PAGE) لحل خليط من البروتين من الفائدة وتحقيق الحمض النووي المسمى تحتوي على المواقع المستهدفة المحتملة من البروتين 1. مسبار الحمض النووي ملزمة مع البروتين سوف يهاجرون أبطأ مقارنة مع التحقيق الذي تجريه الحمض النووي الحرة، وبالتالي فهو متخلف في الهجرة من خلال مصفوفة بولي أكريلاميد. وقد Radiolabeling من الحمض النووي بنسبة 32 P الطريقة السائدة للكشف في EMSAs. على الرغم من أن تطبيق radiolabeling في بحوث الكيمياء الحيوية كان مفيدا، يتم استخدام طرق وضع العلامات الحمض النووي بديل مع حساسية مقارنة نظرا لمخاطر الصحة والسلامة المرتبطة التعامل مع النشاط الإشعاعي. وتشمل هذه الطرق البديلة الاقتران من الحمض النووي مع البيوتين 2 أو digoxigenin (DIG) 3 (وكلاهما ثم يتم الكشف عنها بواسطة أنظمة chemiluminescent)، SYBR تلطيخ الأخضر من المواد الهلامية PAGE 4،أو الكشف المباشر لتقارن صبغ الحمض النووي الفلورسنت عن طريق مسح 5،6 هلام.

تتطلب المواد الهلامية حلها من EMSAs باستخدام اختبار الحمض النووي DNA المسمى بالإشعاع معالجة postrun من خلال أفلام تصوير الإشعاع الذاتي أو نظام phosphorimager للكشف عن الإشارات المشعة 1،7. المواد الهلامية من EMSAs باستخدام biotin- 2 أو DIG مترافق تحقيقات 3 الحمض النووي يجب أن تتم معالجة ونقل على غشاء مناسبة ومن ثم الكشف عن طريق التوهج 6. SYBR تلطيخ الأخضر من هلام يتطلب postrun تلطيخ جل وماسح ضوئي الفلورسنت 4. منذ مطلوبة خطوات المعالجة هلام postrun لEMSAs باستخدام تقنيات وضع العلامات الحمض النووي هذه، وهلام حل يمكن يعاير مرة واحدة فقط. في المقابل، تحقيقات الحمض النووي المسمى مع fluorophores يمكن الكشف مباشرة في هلام داخل ألواح الزجاج عن طريق الماسح الضوئي. ولذلك، فإن تفاعلات الحمض النووي والبروتينات يمكن رصدها ويعاير عدة مرات في نقاط زمنية مختلفة خلال الفترة السابقة، والتييقلل كثيرا من الوقت والتكلفة. تقارن صبغ الحمض النووي الفلورسنت التي استخدمت لEMSAs تشمل و Cy3 6،8، 6،8 Cy5، فلوريسئين 9، والأصباغ الفلورية الأشعة تحت الحمراء 4-6.

يتطلب تنظيم النسخي تفاعلات البروتين الحمض النووي من عوامل النسخ والجينات المستهدفة. التنسيق بين هذه التفاعلات يولد أنواع الخلايا المتنوعة من سلف مشترك خلال تطوير الحيوانية. حددت شاشة الوراثية إلى الأمام مشاركات طفرة مغلطة، G73E، في مجال الحمض النووي ملزم HMG الحفظ جدا من انواع معينة عامل ايليجانس النسخ SOX-2. نتائج طفرة في التحول هوية خلية من الخلايا العصبية الشمية AWB في الائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية الشمية عند مستويات الجزيئية، الصرفية، والوظيفية 5،10. SOX-2 ينظم بشكل مختلف تمايز محطة من AWB والائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية من خلال التفاعل مع العوامل شريك النسخ التي تعتمد على السياق وخاص بهالمواقع المستهدفة الحمض النووي 5،10. SOX-2 شركاء مع LIM-4 (LHX) في محطة AWB تمايز الخلايا العصبية، في حين أن وتظهر فحوصات مراسل وسيفيراز SOX-2 شركاء مع CEH-36 (OTX / OTD) في محطة الائتلاف المناهض للحرب تمايز الخلايا العصبية التي SOX-2 و SOX-2 متحولة البروتينات G73E لها تفاعلات تعاونية مع العوامل المساعدة النسخي LIM-4 و CEH-36 لتنشيط المروج أعرب في البنك الوطني المصري والائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية. ومع ذلك، SOX-2 ومتحولة SOX-2 G73E عرض خصائص تفعيل التفاضلية من المروج. للتحقيق في الأساس الجزيئي للأنشطة الحمض النووي التفاضلية ملزمة من SOX-2 و SOX-2 G73E، أجريت fEMSAs مع هذه البروتينات والمواقع المستهدفة المحتملة.

أولا، اتخذ نهجا المعلوماتية الحيوية لتحديد الحمض النووي بيولوجيا تسلسل ملزمة داخل منطقة المروج 1 كيلوبايت المستخدمة في فحص وسيفيراز. وبما أن العديد من SOX-2 مواقع الربط المحتملة الحالية في جميع أنحاء المروج، ركزناعلى مواقع SOX-2 تنبأ ملزمة المتاخمة للالمفترض CEH-36 أو LIM-4 مواقع الربط والحفاظ تطويريا بين الأنواع الخيطية المختلفة. تم حذف هذه المتتاليات أو تحور، واختبار في وقت لاحق في الجسم الحي لنشاطهم في التعبير عن الجينات المحورة مراسل GFP في AWB أو AWC الخلايا العصبية. من خلال هذا النهج، حددنا المحتملة LIM-4 / SOX-2 و CEH-36-2 SOX المجاورة المواقع المستهدفة / المطلوبة على وجه التحديد للتعبير عن GFP في البنك الوطني المصري والائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية، على التوالي 5. نحن التحقيق في الاختلافات المحتملة في الحمض النووي ملزم من SOX-2 و SOX-2 G73E باستخدام fEMSA مع تحديد LIM-4 / SOX-2 و CEH-36 / SOX-2 المواقع المستهدفة المجاورة. وأظهر تحليل EMSA في أن SOX-2 G73E لا يلزم التحقيق الحمض النووي الذي يحتوي على المتاخمة المواقع المستهدفة LIM-4 / SOX-2 (مطلوب للتعبير الجينات في AWB) بكفاءة كما WT SOX-2 فعلت. وكان مع ذلك، SOX-2 و SOX-2 G73E لا فرق في ربط التحقيق الحمض النووي الذي يحتوي على CEH-36 / SOX-2 (أ)djacent الموقع المستهدف (مطلوب للتعبير الجينات في الائتلاف المناهض للحرب) 5،10. يحلل لنا fEMSA تقديم رؤية الميكانيكية في طبيعة G73E طفرة SOX-2 في التأثير على نشاط محدد ملزم الحمض النووي لهوية الخلية تحول النمط الظاهري AWB إلى الائتلاف المناهض للحرب. هنا، نحن تصف بروتوكول الأمثل من fEMSA باستخدام 6xHis-SOX-2 النقاء أو 6xHis-SOX-2 G73E جنبا إلى جنب مع الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء تحقيقات الحمض النووي المسمى صبغ يحتوي على المتاخمة المواقع المستهدفة LIM-4 / SOX-2 كدراسة حالة لمعالجة سؤال البيولوجي المهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: EMSAs باستخدام اختبار الحمض النووي DNA fluorescently المسمى أو غيرها من الحمض النووي المسمى أشكال تقاسم نفس البروتوكولات للبروتين أو استخراج الخلايا إعداد، رد فعل البروتين الحمض النووي ملزم، وإعداد جيل PAGE وتشغيل (الشكل 1A). الفروق الرئيسية هي الإجراءات DNA وضع العلامات، وبعد التشغيل خطوات المعالجة هلام، وطرق الكشف.

1. إعداد جل

  1. إعداد 5٪ هلام بولي أكريلاميد الأصلية التي تحتوي على TBE 0.5X (45 ملي تريس، بورات، 1 ملم EDTA) و 2.5٪ الجلسرين، وذلك باستخدام نظام هلام بروتين صغير (8.3 سم عرض × 7.3 سم طول × 0.75 مم سمك).
    1. لإعداد 30 مل من محلول هلام لمدة 4 المواد الهلامية، وخلط 5 مل من 30٪ مادة الأكريلاميد / مكرر (37.5: 1)، 3 مل من 5X TBE (0.45 M تريس، بورات، 10 ملي EDTA)، و 1.5 مل من 50٪ الجلسرين، 300 ميكرولتر من 10٪ الأمونيوم بيرسلفات، 15 ميكرولتر من TEMED، و 20.2 مل من ده 2 O تماما.
      ملاحظة: الأكريلاميد هو ضار وسام، والتعامل مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
  2. يلقي حل الجل فورا. بعد البلمرة، والتفاف المواد الهلامية في التفاف واضح من البلاستيك قبل مبلل مع TBE 0.5X وتخزينها في 4 درجات مئوية.

2. إعداد تحقيقات المسمى صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

ملاحظة: حافظ على أليغنوكليوتيد] وصفت صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء بعيدا عن الضوء قدر الإمكان أثناء التحضير والتخزين، والتجارب.

  1. تصميم والنظام أليغنوكليوتيد].
    1. تصميم النوكليوتيد طويلة ل~ 51 السائدة.
      ملاحظة: تسلسل قليل النوكليوتيد طويلة من LIM-4 / SOX-2 التحقيق هو TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. [أليغنوكليوتيد طويلة لا تتطلب PAGE أو تنقية HPLC.
    2. تصميم [أليغنوكليوتيد قصيرة التكميلية لل~ 14 السائدة مع الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء تعديل صبغ في 'محطة 5 (5'Dye) ودرجة حرارة انصهار فوق 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تسلسل قليل النوكليوتيد قصيرة من LIM-4 / SOX-2 التحقيق هو 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. الحد الأدنى للنطاق توليف [أليغنوكليوتيد قصيرة وصفت 5'Dye هو 100 نانومتر. ولذلك، فإن أليغنوكليوتيد تتطلب تنقية HPLC.
  2. [أليغنوكليوتيد resuspend في المخزن 1X تريس، EDTA (TE: 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) لتركيز النهائي من 100 ميكرومتر.
  3. يصلب القصيرة (5'Dye) وأليغنوكليوتيد] طويلة.
    1. مزيج 0.6 ميكرولتر من 5'Dye القصير بنسبة ضئيلة (100 ميكرون)، 1.2 ميكرولتر من بنسبة ضئيلة طويلة (100 ميكرومتر)، و 28.2 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم، تريس، EDTA عازلة (STE: 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) في أنبوب 1.5 مل.
    2. وضع أنبوب في الماء المغلي لمدة 5 دقائق. إيقاف مصدر الحرارة ويترك الماء مع oligos صلب بارد O / N في الظلام.
  4. ملء يتدلى 5 'من صلب 5'Dye القصير / oligos طويلة مع البلمرة Klenow الحمض النووي لجعل مزدوجة تحقيقات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل.
    1. إعداد رد فعل عن طريق خلط30 ميكرولتر من oligos صلب قصيرة / طويلة مع العلامة 5'Dye، 8.5 ميكرولتر من 10X Klenow العازلة، 1.7 ميكرولتر من 10 ملي dNTPs، 1.7 ميكرولتر من Klenow (3 '-> 5' exo-) (5 ش / ميكرولتر)، و 43.1 ميكرولتر من ده 2 O في 0.2 مل أنبوب PCR.
    2. احتضان 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جهاز PCR.
    3. إضافة 3.4 ميكرولتر 0.5 M EDTA لوقف التفاعل وتعطيل الحرارة عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في جهاز PCR.
  5. تمييع شغل في المسابير (0.7 ميكرومتر) في STE لتركيز النهائي من 0.1 ميكرومتر.
  6. متجر oligos في -20 درجة مئوية في الظلام حتى جاهزة للاستخدام. قد يتم تخزين Oligos لمدة تصل إلى سنة في هذه الحالة.
    ملاحظة: لتوليد تحقيقات الحمض النووي مع مواقع متحولة ملزمة، وصلب الإصدارات متحولة من أليغنوكليوتيد] طويلة مع [أليغنوكليوتيد قصيرة وصفت 5'Dye، تليها التعبئة في ل5 يتدلى "مع Klenow. وقد تبين أن التحقيق مع واحدة حبلا المسمى مع فلوري الأشعة تحت الحمراءصبغ لديها فقط 30٪ كثافة من التحقيق مع كل من خيوط المسمى مع الصبغة. إذا احتاج كثافة إشارة إلى تعزيز، وصفت oligos طويلة من كل من خيوط مع الأصباغ الفلورية الأشعة تحت الحمراء في 5 "ترميني وصلب لجعل الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء تحقيقات المسمى صبغ.

3. إعداد ليس لها علامة / الباردة تحقيقات (المنافسين)

ملاحظة: تم صلب [أليغنوكليوتيد طويلة من تسلسل التكميلية (لونغ وLongR) لجعل تحقيقات غير المسماة لتحليل المنافسة مع الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء تحقيقات المسمى صبغ.

  1. مزيج 20 ميكرولتر من 100 ميكرومتر لونغ، 20 ميكرولتر من 100 ميكرومتر LongR أليغنوكليوتيد]، و 60 ميكرولتر من STE في أنبوب 1.5 مل.
  2. وضع أنبوب في الماء المغلي لمدة 5 دقائق، إيقاف مصدر الحرارة ويترك الماء مع oligos صلب بارد بين عشية وضحاها.

4. رد الفعل ملزم والكهربائي

  1. إعداد 1 مل من العازلة ملزمة 5X عن طريق خلط 50 ميكرولتر60، 1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5. 10 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم. 200 ميكرولتر من 1 M بوكل، 5 ميكرولتر من 1 M MgCl 2، 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8.0. 5 ميكرولتر من 1 M DTT. 25 ميكرولتر من 10 ملغ / مل جيش صرب البوسنة، و 695 ميكرولتر من ده 2 O.
    ملاحظة: 5X الاحتياطي ملزم يمكن aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية. وثمة نقطة أخرى للنظر هو أن عوامل النسخ المختلفة سيكون تعديلات مختلفة لالعازلة ملزمة.
  2. الحق قبل إعداد ردود الفعل ملزم، قبل تشغيل هلام بولي أكريلاميد الأصلي 5٪ في 0.5X TBE + 2.5٪ الجلسرين لإزالة كل آثار فوق كبريتات الأمونيوم في 80 V ل30 - 60 دقيقة، أو حتى التيار لم يعد يختلف مع الوقت.
  3. إعداد رد فعل ملزم في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
    1. خلط 4 ميكرولتر من العازلة ملزمة 5X، 80-200 نانوغرام المنقى البروتين (50٪ الجلسرين، أي SOX-2)، 1 ميكرولتر من 0.1 ميكرومتر التحقيق صبغ مترافق (اضرب النهائيentration: 5 نانومتر)، وده 2 O.
    2. اختياري: عندما يطلب من المنافسين التحقيق البارد، إضافة تركيزات مختلفة (2X، 10X، 25X، 50X، 100X، وما إلى ذلك) من تحقيقات الباردة.
    3. اختياري: عندما يكون التفاعل بين البروتينات ألف وباء (أي، SOX-2 وLIM-4) يتم اختبار، إضافة 80-200 نانوغرام المنقى البروتين ب (50٪ الجلسرين، أي LIM-4).
    4. اختياري: عند استخدام استخراج النووي إعداد وملزمة محددة من البروتين ويمكن التحقق من صحة، إضافة الأجسام المضادة المحددة للبروتين و(أي معاداة 6xHis، ومكافحة FLAG، وما إلى ذلك).
    5. في احتضان R / T في الظلام لمدة 15 دقيقة.
  4. تحميل كل من رد فعل ملزم على جل وتشغيل هلام في 10 فولت / سم إلى المسافة المطلوبة.

5. التصوير

ملاحظة: تم مسحها الجل مباشرة في لوحات الزجاج مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء المتقدمة. ولذلك، فإن جل يمكن زيادة حل ومسحها بشكل متكرر (أرقام 1C و 2). تم اختبار نظام التصوير الفلورسنت القريب من الأشعة تحت الحمراء في المقام الأول عن البقع الغربية أيضا لمسح هلام، ولكن لم يكن سوى نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء متقدمة قادرة على مسح الجل مع قرار جيد. منهجية وصف تقتصر على نوع معين من برامج التصوير بالأشعة تحت الحمراء، على الرغم من حزم البرامج الأخرى يمكن أن تستخدم.

  1. تنظيف السرير من الماسح الضوئي مع ده 2 O وتجف جيدا قبل المسح. جففي لوحات الزجاج من هلام ووضع لوحات تحتوي على هلام على السرير الماسح الضوئي.
  2. فتح برامج التصوير بالأشعة تحت الحمراء، وانتقل إلى علامة التبويب "اكتساب" ل. عندما يتم وضع لوحة أرق (1 ملم) على السرير الماسح الضوئي، استخدام الإعدادات من القناة: 700، كثافة: السيارات، والقرار: 169 ميكرون، الجودة: متوسطة، والتركيز تعوض: 1.5 مم. عندما يتم وضع لوحة سمكا (3 مم) على السرير الماسح الضوئي، استخدام الإعدادات من القناة: 700، كثافة: السيارات، والقرار: 84 ميكرون، الجودة: متوسطة، والتركيز تعوض: 3.5 مم. التركيز تعويض يعتمد علىسمك لوحة من الزجاج.
  3. تحديد المنطقة التي تحتل جل على الماسح الضوئي. انقر على "ابدأ" لبدء المسح الضوئي.
  4. كرر الكهربائي والمسح الضوئي بالإضافة إلى ذلك الضرورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البرتقال G صبغ تحميل (6X: 0.12 غرام البرتقال G في 100 مل من 30٪ الجلسرين) ويمكن أن يضاف إلى رد فعل ملزم قبل التحميل لتصور سير الكهربائي. سوف يتم الكشف عن الأصباغ التحميل الأخرى بما في ذلك برموفينول الأزرق خلال المسح الضوئي وبالتالي تتداخل مع تحليل الصور (الشكل 1B).

في بعض الحالات من EMSAs، خاصة إذا تم استخدام مستخلص النووي الإعداد،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fEMSAs تشكل أداة فعالة للتحقيق في التفاعلات البروتينية الحمض النووي، وتكون بديلا لوسم المشعة من الحمض النووي. والأصباغ الفلورية مثل الأصباغ الحمراء المتاحة تجاريا، وتوفير وسيلة أكثر أمانا وصديقة للبيئة مقارنة مع وضع العلامات الحمض النووي المشع. EMSAs باستخدام الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ لا تتطلب خطوات المعالجة هلام postrun، وبالتالي توفير الوقت والتكلفة مقارنة تقنيات الحمض النووي العلامات الأخرى. الوقت للكشف عن عصابات باستخدام EMSAs المشعة يمكن أن تتراوح م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل زمالة Alfred P. Sloan Research (إلى C.-F.C.) ومنحة NIH R01 (5R01GM098026-05 إلى C.-F.C.). نشكر ديفيد كرو على الوصول إلى نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء المتقدم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1   ؛Bio-Rad1610158أكريلاميد ضار وسام.
6x- الجسم المضاد لعلامة الحاتمة (HIS. H8)ThermoFisherMA1-21315
الجسم المضاد M2 المضاد للعلم   ؛Sigma-AldrichF3165-.2MG
ألبومين مصل البقر (BSA) درجة البيولوجيا الجزيئيةنيو إنجلاند بيولابرزB9000S
5'IRDye700 علامة DNA Oligosتقنيات الحمض النووي المتكاملةالحمض النووييشار إليها باسم "5'Dye-Label أو الأشعة تحت الحمراء صبغة الحمض النووي oligos" في المخطوطة. ستقوم الشركة بتصنيع 5 'IRDye قليلة النوكليوتيدات المسماة بالحمض النووي. يتطلب 100   كحد أدنى ؛ مو تخليق مقياس M وتنقية HPLC.
Klenow Fragment (3 '- >5' exo-)New England BiolabsM0212S
LightShif Poly (dI-dC)ThermoFisher20148E
Mini-PROTEAN   ؛ خلية الرحلان الكهربائي العمودي بيو راد1658000FC يشار إلى هذا باسم "نظام هلام البروتين الصغير" في المخطوطة. يمكن استخدام أي نظام كهربائي طالما أنها ألواح زجاجية شفافة يقل حجمها عن 25 سم × 25 سم.
نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء Odyssey CLxLI-COR BiotechnologyOdyssey CLx نظام الأشعة تحت الحمراءيشار إلى هذا باسم "نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء المتقدمة" في المخطوطة.
نظام تصوير Odyssey Fc  LI-COR BiotechnologyOdyssey Fc يشارإلى هذا باسم "نظام التصوير الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القريبة في المقام الأول للبقع الغربية" في المخطوطة.
برنامج Image Studio (الإصدار 4.0)برنامج LI-COR BiotechnologyImage Studio يشار إلى هذا باسم "برنامج تصوير معين" في المخطوطة.
البرتقال GSigma-AldrichO3756-25G
6x صبغة0.25٪ برتقالية G ؛ 30٪ جلسرين
0.5x TBE45 ملي مولار تريس بورات ؛ 1 ملي مولار EDTA
1x TE10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 1 ملي مولار EDTA
1x STE100 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ؛ 1 ملي مولار EDTA
5x عازلةملزمة50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 50 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 200 ملي كيلوسنال ؛ 5 ملي مولار MgCl2; 5 ملي EDTA ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 5 ملي متر DTT ؛ 250 μ جم / مل BSA
المخصص نظام التصوير ثنائي الوضع تحميل برتقالية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
  3. Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
  4. Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
  5. Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
  6. Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
  7. Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
  8. Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
  9. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  10. Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
  11. Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
  12. Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
  13. Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
  14. Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Electrophoretic Mobility Shift AssayInfrared Fluorescent DyeProtein DNA InteractionNon radioactive ProbesNative Polyacrylamide GelOligonucleotide AnnealingDNA Binding ActivityPurified SOX 2 ProteinInfrared Imaging SystemSupershift Assay

مقالات ذات صلة